Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Dyrkingsmetoder for spiroketter fra Borrelia burgdorferi Sensu Lato-kompleks og tilbakefallsfeber Borrelia

Published: November 25, 2022 doi: 10.3791/64431
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 1, 2, 3
1Department of Biology, Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology, Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences, Institute of Parasitology
* These authors contributed equally

Summary

In vitro kultur er en direkte deteksjonsmetode for tilstedeværelse av levende bakterier. Denne protokollen beskriver metoder for kulturen til forskjellige Borrelia spirochetes, inkludert de av Borrelia burgdorferi sensu lato kompleks, relapsing fever Borrelia arter, og Borrelia miyamotoi. Disse artene er kresne og saktevoksende, men kan dyrkes.

Abstract

Borrelia består av tre grupper av arter, de av Lyme borreliosis (LB) gruppen, også kjent som B. burgdorferi sensu lato (sl) og nylig omklassifisert til Borreliella, relapsing fever (RF) gruppe Borrelia, og en tredje reptil-assosiert gruppe spiroketter. Kulturbaserte metoder forblir gullstandarden for laboratoriedeteksjon av bakterielle infeksjoner for både forskning og klinisk arbeid, da kulturen av patogener fra kroppsvæsker eller vev direkte oppdager replikerende patogener og gir kildemateriale for forskning. Borrelia og Borreliella spirochetes er kresne og saktevoksende, og er derfor ikke vanlig dyrket for kliniske formål; Kultur er imidlertid nødvendig for forskning. Denne protokollen demonstrerer metodikken og oppskriftene som kreves for å lykkes med å dyrke LB- og RF-spiroketter, inkludert alle anerkjente arter fra B. burgdorferi s.l.-komplekset, inkludert B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis og RFspirochetes, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis og B. miyamotoi. Det grunnleggende mediet for dyrking av LB- og RF-spiroketter er Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II eller BSK-H) medium, som pålitelig støtter veksten av spiroketter i etablerte kulturer. For å kunne dyrke nylig isolerte borreliaisolater fra flått- eller vertsavledede prøver der det opprinnelige spiroketantallet er lavt i inokulumet, foretrekkes modifisert Kelly-Pettenkofer (MKP) medium. Dette mediet støtter også veksten av B. miyamotoi. Suksessen med dyrking av RF-spiroketter avhenger også kritisk av kvaliteten på ingrediensene.

Introduction

Borrelia er en slekt av spiroketebakterier som omfatter tre store klader: Lyme borreliosis (LB) -gruppen, relapsing fever (RF) -gruppen og en mindre godt karakterisert gruppe som tilsynelatende er begrenset til reptiler. Borrelia-taksonomien er i endring med fremkomsten av molekylære metoder som tillater sammenligninger av genom og proteom, slik tilfellet er for de fleste andre taksonomiske grupper 1,2,3,4,5,6,7. LB-gruppen (også kalt borreliosegruppen) har tradisjonelt blitt kalt Borrelia burgdorferi sensu lato etter sitt best karakteriserte medlem Borrelia burgdorferi sensu stricto.  Denne artikkelen bruker den mest brukte terminologien: LB, RF og reptilassosiert gruppe, og beskriver kulturprotokollene for LB- og RF-gruppene.

Som forventet for et medlem av familien Spirochaetaceae, kan Borrelia vedta den karakteristiske lange og tynne spiralformen, typisk 20-30 μm lang og 0,2-0,3 μm bred. Borreliaceller er imidlertid svært pleomorfe og kan adoptere mange andre former i både kultur og in vivo 1,8 som et resultat av deres komplekse cellulære og genetiske struktur. I sin spiroketale form skyldes den plane sinusbølgemorfologien at dens aksiale endoflagella roterer i det periplasmatiske rommet mellom indre og ytre membraner. Denne strukturen gjør at cellene kan være svært bevegelige, med den ytre membranen som inneholder proteiner som gjør at cellen kan interagere med vertsvev 9,10. Ekspresjonen av de ytre membranproteinene er tett regulert og påvirker ikke bare vertsvevsinvasjon, men også interaksjon med vertsimmunsystemet11. Dette komplekse genuttrykket gjør at borreliacellene kan bevege seg mellom de svært forskjellige miljøene til virveldyrverter og virvelløse vektorer. Genomet til Borrelia er uvanlig blant prokaryoter, bestående av et lineært snarere enn et sirkulært kromosom. I tillegg til det lineære kromosomet inneholder borreliaarter 7-21 plasmider, noen lineære og noen sirkulære. Plasmidene har de fleste gener som kreves for vertstilpasning og virulens, og de sirkulære plasmidene avledet fra profager antas å være ansvarlige for flertallet av horisontal genflyt mellom spiroketale celler12,13. I samsvar med en rolle i vertstilpasning mister noen, muligens mange eller alle, medlemmer av Lyme-borreliosegruppen plasmider i kultur14. Den best studerte "laboratorietilpassede" stammen av B. burgdorferi, B31, har bare syv av de ni plasmidene som finnes i ville isolater av denne arten15. Tilsvarende mister B. garinii plasmider i kultur16. Noen studier har vist at RF-arter og B. miyamotoi beholder plasmider når de dyrkes14,17, men nyere arbeid demonstrerer endrede plasmider og smittsomhet med langvarig in vitro-dyrking 18.

Kulturbaserte metoder forblir gullstandarden for laboratoriepåvisning av bakterielle infeksjoner, både for forskning og klinisk arbeid14,17. Kulturen av patogener fra kroppsvæsker eller vev oppdager direkte replikerende patogener og gir kildemateriale for forskning14,17. Denne protokollen demonstrerer metodikken og oppskriftene som kreves for å lykkes med å dyrke spiroketene i LB-gruppen, samt RF Borrelia og B. miyamotoi. Det grunnleggende mediet for dyrking av Borrelia spirochetes er Barbour-Stoenner-Kelly-mediet (BSK-II eller det kommersielt tilgjengelige BSK-H), med eller uten antibiotika for å redusere veksten av forurensende prokaryoter. Dette mediet ble tilpasset fra et medium som opprinnelig ble brukt til å støtte RF Borrelia19, ytterligere modifisert av Stoenner20 og deretter av Barbour21. Mange modifikasjoner har siden blitt utviklet, som hver har effekter på bakteriell fysiologi som kan påvirke vekst, smittsomhet og patogenisitet22. Dette mediet støtter pålitelig veksten av spiroketter i etablerte kulturer og har blitt brukt til å isolere spiroketter fra flått, pattedyr og kliniske prøver23. Den mer nylig utviklede variasjonen, modifisert Kelly-Pettenkofer (MKP) medium, kan gi bedre isolasjonssuksess, morfologi og motilitet ved isolering av nye borreliaisolater fra miljøprøver, når antall spiroketer tilstede i prøven som er tilgjengelig for frø kulturen er lav23,24. I alle tilfeller er suksessen med dyrking kritisk avhengig av det tilberedte mediet og bruken av passende ingredienser; Ikke alle kommersielle ingredienser produserer medium av høy kvalitet. Inokulerte kulturer kan enkelt inkuberes uten å riste i en konvensjonell 32-34 ° C inkubator i nærvær av en liten mengde gjenværende omgivende oksygen. Borrelia spirochetes er anaerober, men er utsatt i naturen for svingninger i oksygen- og karbondioksidkonsentrasjoner og reagerer med endringer i genuttrykk26,27,28,29. Dermed bør genuttrykk, vekst og andre metabolske studier kontrollere for oksygen- og karbondioksidnivåer ved bruk av en oksygenkontrollert inkubator eller anaerob kammer. I kultur kontrolleres kulturer ukentlig, eller oftere, for tilstedeværelse av spiroketter med enten mørkefeltsmikroskopi eller fasekontrastmikroskopi. Kulturutstryk kan farges med enten sølvflekker, immunhistokjemi eller ved bruk av fluorescerende merkede stammer29,30. PCR etterfulgt av DNA-sekvensering er en sensitiv og spesifikk metode for å påvise og genetisk identifisere eller bekrefte borreliaarten 30,31,32,33.

Det finnes mange mindre variasjoner av BSK-II, og noen er kommersielt tilgjengelige. Protokollen beskrevet her i avsnitt 1 er tilpasset fra Barbour (1984) 21. Flytende MKP-medium er et mer nylig utviklet medium og er beskrevet i avsnitt 2. Den er utarbeidet i henhold til en tidligere rapportert protokoll33,34, som i likhet med BSK-medium består av to trinn: forberedelse av grunnleggende medium og forberedelse av komplett medium. Dyrkningsmedium Borrelia kan tilberedes med eller uten antibiotika, som beskrevet i avsnitt 3. antibiotika virker for å redusere kontaminerende bakterier introdusert ved inokulering med kliniske prøver eller miljøprøver, som beskrevet i avsnitt 4; ved inokulering med ren Borrelia sp. kultur, kan antibiotika ikke være nødvendig. Langsiktige borreliabestander er ofte viktig, og en protokoll for dette er beskrevet i kapittel 5. Avsnitt 6 beskriver bruk av disse mediene for å isolere rene Borrelia sensu lato-kloner fra kliniske eller miljømessige prøver. Det er en rekke mulige tilnærminger36; Nedenfor er en funnet å være effektiv. Pletteringsmediet som brukes i denne protokollen er en modifikasjon av BSK-II plating medium37 og MKP medium 34 (med kaninserum økt til 10%38).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle studier som involverer prøver oppnådd fra mennesker ble godkjent av Institutional Review Board ved det aktuelle universitetet og / eller medisinsk anlegg, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra deltakerne før prøvene ble samlet inn. Alle studier med prøver fra dyr ble godkjent og gjennomført i henhold til retningslinjene til Institusjonens dyreetiske komité. Der det er relevant, er det innhentet godkjenning for miljøprøvetaking.

MERK: Kulturens suksess er kritisk avhengig av kvaliteten på ingrediensene. Kommersielt BSK medium er tilgjengelig og støtter robust veksten av lab-tilpasset ren B. burgdorferi og beslektede arter hvor høy dose inokulum kan brukes til å frø kulturen. For isolater av stammer fra primærbiologisk materiale foretrekkes nytilberedt medium og er ofte nødvendig.

Borrelia sp. er kjente eller mistenkte patogener, og uskjermet vev fra mennesker eller dyr kan også være en biologisk fare. Håndtering av potensielt smittsomt materiale krever personlig verneutstyr og steril teknikk for etterforskerens sikkerhet. I tillegg er mediet så næringsrikt at kulturen lett blir forurenset. Biosikkerhetsnivå 2 er generelt nødvendig for dette arbeidet, og alt arbeid med Borrelia sp. eller prøver skal utføres i et biologisk sikkerhetsskap.

1. Instruksjoner for å lage BSK-II medium

  1. Fremstilling av komplett BSK-II medium
    1. Få reagenser for å tilberede 1 l av mediet, som vist i tabell 1.
      MERK: BSA-renhet (eller mangel på renhet) er avgjørende for optimal vekst. Spesielt varierer BSA-renheten mellom både produsent og parti. Se tabell 2 for en liste over mer versus mindre vellykkede produkter. Å skaffe flere prøver fra forskjellige leverandører, teste dem for optimal vekst, og deretter kjøpe en stor mengde av det beste partiet er en effektiv strategi for å redusere dette problemet og produsere et godt medium.
    2. Begynn med å løse opp BSA i et beger ved å røre i vannet, noe som vil ta minst en halv time.
    3. Tilsett alle de tørre kjemikaliene og la dem oppløses. Legg deretter til CMRL.
    4. Juster pH i BSK-II-mediet til 7,6, om nødvendig, med 1 M NaOH.
    5. Tilsett kaninserum til BSK-II-mediet til en konsentrasjon på 6% -10%. Filtrer steriliser (0,22 μm porestørrelse) BSK-II-mediet. Den nødvendige mengden serum avhenger av Borrelia-artene . Bruk 6%-7% for RF arter og stammer, og for Borrelia burgdorferi sensu lato. Hvis veksten ikke er sterk, tilsett et annet 1% -2% sterilt kaninserum til mediet.
    6. Frys lageret av BSK-II medium i 100 ml eller 400 ml alikoter.
    7. For RF-stammer er gelatin nødvendig. Tilsett 100 ml 7% steril gelatin (lett oppvarmet for å sette den i en løsning) til 400 ml BSK-II medium. Varm BSK-II med gelatin ved 37 °C for å få gelatinen til å smelte før kulturen inokuleres.
      MERK: Medium kan fryses (-20 °C) før filtersterilisering og tilsetning av kaninserum og gelatin (for RF-spiroketter) eller etter filtersterilisering og serumtilsetning (og gelatin). Mediet er stabilt når det er frosset i lang tid. Når du oppbevarer det i kjøleskap, bruk mediet innen 1 måned. RF-arter vokser best med ferskt medium, vanligvis ikke mer enn 1 uke gammelt. Hvis det ikke er frosset, må du visuelt inspisere kvaliteten på mediet for turbiditet. Kast mediet som ser ut til å være forurenset, utfellende ingredienser eller på annen måte tvilsomt.
    8. Hvis antibiotika skal legges til mediet, legg dem til nystekte medium eller tidligere frosne alikoter; Sistnevnte er den mer fleksible tilnærmingen. Bruk antibiotikakonsentrasjoner som beskrevet av Oliver et al.39.
    9. Mens du tiner et rør av mediet, veier antibiotika i sterile (autoklaverte) 1,7 ml rør eller sterile 15 ml koniske rør, ved hjelp av en presisjonsbalanse. Forbered stamoppløsningene som følger: Løs opp 25 mg amfotericin B i 10 ml DMSO, 20 mg fosfomycin i 1 ml autoklavert destillert vann og 50 mg rifampicin i 1 ml DMSO.
    10. Filtrer steriliser (0,2 μm sprøytefiltre) antibiotika og overfør dem til et nytt rør av passende størrelse.
    11. Fortynn antibiotika i et forhold på 1:1000 av mediet for å nå sin endelige konsentrasjon. For 500 ml BSK, tilsett 0,5 ml amfotericin B stamløsning (2,5 mg/ml i DMSO), 0,5 ml fosfomycinoppløsning (20 mg/ml i steril H2O) og 0,5 ml rifampicin (USA: rifampicin) stamløsning (50 mg/ml i DMSO).
    12. Bruk det antibiotikasupplerte mediet eller alikoten og frys ned ved -20 °C.
Bestanddeler Beløp (/L)
BSA fraksjon V 50 g
CMRL-1066 (10x) 100 ml
Neopeptone 5 g
Hepes 6 g
Sitronsyretrinatriumsaltdihydrat 0,7 g
Glukose 5 g
TC Yeastolate 2 g
Pyruvsyre (Na-salt) 0,8 g
N-acetyl-D-glukosamin 0,4 g
Natron 2,2 g
Vann (høy renhet) 900 ml

Tabell 1: Sammensetning av 1 liter BSK-II medium.

Kilde Egnethet
Serva GmbH, Heidelberg, Tyskland Ja
Proliant Biologisk, Boone IA, USA Ja
Sigma (Millipore-Sigma & Sigma-Aldrich), St. Louis, MO, USA Nei

Tabell 2: Kilder til BSA og egnethet for BSK-II medium.

2. Instruksjoner for å lage MKP

  1. Fremstilling av basisk medium
    1. Vei og løs opp alle pulveriserte komponenter som listet opp nedenfor i tabell 3 i 3 /4 av det endelige volumet av ddH2O (ca. 750 ml) under omrøring til fullstendig oppløsning, noe som tar ~1 time.
    2. Etter fullstendig oppløsning, juster pH med NaOH til 7,6 og volumet til 1000 ml, og steriliser deretter ved filtrering (0,22 μm filter).
      MERK: Basisk medium kan oppbevares ved -20 °C i opptil 3 måneder.
  2. Fremstilling av MKP komplett medium
    1. Bland alle komponentene som listet opp i tabell 4 på en steril måte. Steriliser gelatinen ved autoklavering og håndtak på en steril måte. Arbeid i et sterilt biologisk sikkerhetsskap og bruk et sterilt filtrert serum.
    2. Aliquot MKP i 50 ml rør. Legg en liten alikot ved 33 ° C i flere dager, og sjekk deretter under et mørkefeltmikroskop for fravær av forurensning.
      MERK: Hold MKP komplett medium ved +4 °C i høyst 1 måned, og skal ikke fryse. Det komplette mediet kan i tillegg steriliseres ved filtrering ved hjelp av et 0,22 μm filter.
Bestanddeler Beløp (/L)
CMRL-1066 (10x uten glutamin) 100 ml (hvis flytende)/9,7 g/l hvis pulver
Neopeptone 3 g
Hepes 6 g
Sitronsyre 0,7 g
Glukose 3 g
Pyruvsyre 0,8 g
N-acetylglukosamin 0,4 g
Natron 2 g

Tabell 3: Sammensetning av 1 l basisk MKP (modifisert Kelly-Pettenkofer) medium.

Bestanddeler Beløp (ml)
Grunnleggende medium 500
7% gelatin (i H2O) (nyautoklavert, men ikke varmt) 100
Kanin serum 36
35% BSA 17.5

Tabell 4: Sammensetning av MKP (Modified Kelly-Pettenkofer) komplett medium.

3. Dyrkning av Borrelia, med eller uten antibiotika

  1. Utfør alle eksperimentelle trinn under sterile arbeidsforhold i et biologisk sikkerhetsskap. Desinfiser overflaten og alle materialer med 70% etanol, og overfør dem umiddelbart til det biologiske sikkerhetsskapet. UV-steriliserer alt ikke-biologisk materiale i det biologiske sikkerhetsskapet i 5 minutter før arbeidet starter.
  2. Bruk det ferskeste mediet mulig.
  3. For å starte en kultur, forvarm mediet (33 ° C - 37 ° C) i en inkubator. Påfør risting om nødvendig.
    MERK: Avhengig av volumet av medium, kan dette trinnet ta flere timer.
  4. Tilsett ~1 ml tint borreliakultur fra glyserol eller lignende stam, tidligere lagret ved -80 °C og tint ved romtemperatur (RT), så snart det er flytende, til 5-15 ml forvarmet BSK-medium. Inokuler kulturen i et lite volum (5-15 ml BSK) ved hjelp av kommersielt tilgjengelige hetteglass av glass eller plast med skrukork. Fyll rørene nesten fulle for å lage en mikro- eller anaerob atmosfære. Lukk rørene tett; hvis dyrket på denne måten, er CO2 ikke nødvendig.
  5. Dyrk RF-arter (og B. persica) ved 37 °C i en inkubator uten omrøring eller omrøring. Dyrk B. burgdorferi sensu lato-arter ved 33-34 °C.
  6. Overvåk veksten av borreliakulturen med fasekontrast eller mørkefeltsmikroskopi ved 200x-400x forstørrelse (figur 3). For å sikre jevn fordeling av celler, bland kulturen med en serologisk pipette eller for mer blanding med en 3 ml overføringspitte mens du pipetterer opp og ned.
    MERK: Borrelia er mest synlig ved høyere forstørrelse (200X-400X), men kan best telles ved 200X forstørrelse på et hemocytometer40. Borreliabevegelse og morfologi er en indikasjon på tilstedeværelsen av disse bakteriene.
  7. For å kvantifisere bakterievekst, telle flere (10) individuelle små firkanter i seksten-feltet rutenett mønster av telleområdet på begge sider av hemocytometer og gjennomsnitt. Multipliser gjennomsnittlig cellenummer per liten kvadrat med konverteringsfaktoren som passer for hemocytometeret som brukes til å bestemme celletallet per ml.
  8. Overvåk bakterieveksten med 1-2 dagers intervaller. Den eksponentielle veksten av borrelia er avhengig av levedyktighet og celletetthet og kan ta 1 uke eller lenger ved 34 °C. Fortynn eksponentielle fasekulturer i forholdet 1: 2 eller 1: 4 med mediet i et 1, 7 ml rør før belastning på hemocytometeret. Inkluder passende vurdering av fortynningsfaktoren ved bestemmelse av celletallet. Etter bruk, spray overflatene og hemocytometeret med fortynnet blekemiddel (10%) og / eller 70% etanol.
    MERK: Borrelia er i eksponentiell vekst når cellekonsentrasjonene er 1-5 x 107 celler/ml. Innenfor dette området vokser cellene godt.
  9. Utvidet kultur vil tømme næringsstoffer og endre middels pH, så subkulturering er nødvendig. Under sterile forhold i et biologisk sikkerhetsskap, overfør 1/10 av kulturvolumet til et nytt rør og fyll det med det nye mediet (en fersk aliquot av samme medium som brukes til å vokse forrige passasje). En fortynning på 1:10 er optimal. Hvis kulturvolumet skal endres, juster inokulummengden tilsvarende, og fortsett inkubasjonen. Antall passeringer øker med hver middels endring.
  10. For ekstraksjon av DNA eller isolering av borreliaceller , sentrifuge eksponentialfasen Borrelia i 10 min ved 4000 x g for å pelletere bakteriene. Kast supernatanten i egnet biologisk farlig avfall. Behandle de pelleterte bakteriene med et kommersielt DNA-ekstraksjonssett eller resuspendere bakteriene i et passende medium for det tiltenkte eksperimentet.
  11. På slutten av hver manipulasjon, steriliser alt utstyr med etanol og UV-stråling, som passer for utstyret. Samle flytende avfall, inkludert overflødig kultur, i en avfallsflaske og tilsett blekemiddel til en endelig konsentrasjon på 10%. Plasser flasken ved -80 °C før du kaster den. Alternativt kan du sterilisere flytende avfall og kultur uten blekemiddel eller alkohol ved autoklavering.

4. Langtidslagring av borreliakulturer

  1. Fremstilling av glyserollager av borreliakultur
    1. Ta ~ 1,8 ml alikoter av eksponentielle fasekulturer, cellekonsentrasjoner ~ 107-10 8 celler / ml, og tilsett steril glyserol til en endelig konsentrasjon på 10% (konsentrasjoner på 5% -20% arbeid).
    2. Plasser i 2 ml kryogene hetteglass med skrukork. Oppbevares ved -80 °C.
    3. Vedlikehold et lager med minst 10 rør av hver stamme i fryseren.
  2. En alternativ lagringsoppskrift for å produsere et glyserollager for permanent lagring
    1. Bland 2/3 av borreliakulturen med 1/3 av 15% glyserol i brucellabuljong . Bruk 2,8 g Brucella-buljong oppløst i 100 ml ddH2O, som var sterilt filtrert (0,22 μm).
    2. Oppbevar glyserollageret av prøver ved -70 °C til -80 °C.

5. Isolering av spiroketter fra miljømessige eller kliniske kilder

MERK: Hvis isolering av materiale fra menneske-, dyre- eller miljøkilder, må forskningsetikk, dyrepleie eller økologisk sertifisering, etter behov, innhentes.

  1. Dyrking av borrelia fra harde flått
    1. Samle voksne hunner, hanner og/eller nymfestlått.
    2. Overflatesteriliser alle flåttprøver ved å dyppe dem i 70% etanol i 2 minutter og lufttørke i et biologisk sikkerhetsskap. Dissekere individuelt i flere stykker med en steril skalpell. Plasser bitene i et 2 ml rør inneholdende 1,5 ml medium, supplert med antibiotika.
    3. Inkuber dyrkningen ved 34 °C og se etter spiroketter ved mørkefelt- eller fasekontrastmikroskopi to ganger i uken de første 2 ukene og deretter ukentlig i 6 uker (oftere for RF-spiroketter). Subkultur-dyrkningspositive prøver i 5 ml av samme medium.
      MERK: Forurensede kulturer kan renses til en viss grad ved filtrering ved hjelp av et 0,2 μm filter; Antibiotika kan være nødvendig for å fullstendig løse forurensning.
  2. Dyrking av borrelia fra blodprøver
    MERK: Blodprøven skal tas av en kvalifisert medisinsk, veterinær eller forskningspersonell, avhengig av kilden til materialet. Mindre enn 24 timer ved RT bør gå mellom prøven
    Fjerning og ankomst i laboratoriet.
    1. Oppnå 10 ml blod, samlet i glass blod samling rør med syre citrat druesukker (ACD; "gul topp") som en antikoagulant. La stå i romtemperatur. Det anbefales at det går mindre enn 24 timer mellom blodinnsamling og inokulering.
    2. Sentrifuge blodet med antikoagulant i 10 minutter ved 200-400 x g for å skille plasma fra blodceller.
    3. Fjern plasmaet forsiktig fra slangen og inokuler 1 ml plasma til 5 ml forvarmet MKP komplett medium. MKP kan suppleres med antibiotika. Inkuber dyrkning ved 33 °C med daglig visuell inspeksjon og ukentlig mørkefelt- eller fasekontrastmikroskopi inntil borrelial vekst oppdages (oftere for RF Borrelia), som kan ta opptil 9 uker.
      MERK: Hvis du bruker større eller mindre inokulasjonsvolumer, oppretthold forholdet 1:5 mellom inokulant og medium. Bruk sera eller plasma i stedet for fullblod.
  3. Dyrking av borrelia fra hudbiopsi
    1. Overflatesteriliser hudbiopsien (ideelt sett en 3 mm x 3 mm x 3 mm kube, dvs. med 70% etanol og hydrogenperoksid). Plasser biopsiprøven i fysiologisk saltvann.
      MERK: En biopsiprøve bør tas av en kvalifisert medisinsk, veterinær eller forskningspersonell, avhengig av kilden til materialet. Mindre enn 24 timer ved RT bør gå mellom fjerning av prøven og ankomst i laboratoriet.
    2. Terning prøven i to til seks mindre biter ved hjelp av et sterilt barberblad i et sterilt glass petriskål mens nedsenket i fysiologisk saltvann. Overfør alle prøvene og ~1 ml av det fysiologiske saltvannet der hudbiopsien ble lagret i 5 ml forvarmet medium supplert med antibiotika og inkuber ved 33 °C.
    3. Ved overvekst av forurensende bakterier, tilsett antibiotika som i trinn 1.1.10 ovenfor, eller ved å tilsette to tabletter sulfametoksazol (23,75 mg, endelig konsentrasjon 5 mg/ml) + trimetoprim (1,25 mg, 0,25 mg/ml) eller Bactrim (minste hemmende konsentrasjon >128 μg/ml), to tabletter Amikacin (2 x 30 μg, endelig konsentrasjon 12 μg/ml), og to tabletter fosfomycin (2 x 200 μg; endelig konsentrasjon 80 μg/ml).
      MERK: I alle tilfeller, sørg for å holde deg under den minste hemmende konsentrasjonen av det antibiotika for Borrelia-artene som kultur blir forsøkt 41,42,43.
    4. Hvis kulturen er positiv for Borrelia, behold kulturen i ytterligere 3-4 dager eller til mengden Borrelia når 10+ spiroketter i et mikroskopfelt ved hjelp av et 40X-mål. Opprett et glyserollager for permanent lagring.

6. Isolering av monoklonale populasjoner av B. burgdorferi sensu lato spirochetes og B. miyamotoi fra flytende kulturer ved dyrking på faste medier

  1. For å lage plater, varm 300 ml 1,5X MKP komplett medium (uten gelatin). Varm også 200 ml 1,7% agarose (autoklavert i avionisert vann, lagret ved RT, og mikrobølgeovn før bruk) til 55 °C. Bland begge væskene.
  2. Pipett 15 ml av denne blandingen inn i hver av 16 dype petriskåler for å lage bunnen agar oselayer.
  3. Behold resten av mediet ved 55 °C i vannbad.
    MERK: Borrelia blandes inn i det øverste agaroselaget.
  4. Først kvantifiser Borrelia kulturtetthet ved hjelp av et hemocytometer og fortynn til ønsket tetthet i et flytende medium.
    MERK: 500, 200, 100 og 50 spiroketter per tallerken fungerer bra.
  5. Etter at bunnplatene har størknet, tilsett 10 ml av den gjenværende agaroseblandingen til et 15 ml rør inneholdende passende antall spiroketter.
  6. Hell suspensjonen på bunnen agarose i den merkede petriskålen.
    MERK: Siden Borrelia spirochetes er følsomme for høy temperatur, bør det utvises forsiktighet for å sikre at bakteriene ikke utsettes for 55 °C over lengre tid. Hell den øverste agar umiddelbart etter å ha tilsatt den til bakteriecellene i mediet.
  7. Etter at platene er helt størknet, lukk petriskålene og legg dem opp ned ved 34-35 °C i 2,5% CO2.
    MERK: Koloniene vil vises 1 uke etter plating hvis prosedyren er vellykket.
  8. For å screene og utvide de enkelte koloniene, velg enkeltkolonier fra platene og legg dem i 1,5 ml modifisert flytende MKP, eller andre egnede medier, i sterile 2 ml dyrkningsrør.
  9. Inkuber kulturene ved 34 °C og undersøk for spiroketer ved mørkefelt- eller fasemikroskopi. Bruk disse kulturene til analyse eller aksjer, laget som beskrevet ovenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Borrelia kultur media BSK og MKP, og varianter, er rike kulturmedier med ingredienser som må tilberedes og steriliseres sekvensielt. Når riktig tilberedt, bør BSK medium være rød-oransje og klart (figur 1). Turbiditet og nedbør som vedvarer etter oppvarming indikerer problematiske ingredienser, middels produksjon eller forurensning; Et slikt medium kastes best. Hvis gelatin tilsettes BSK og med MKP, vil mediet være gelatinøst når det oppbevares i kjøleskap; Ved oppvarming vil den være flytende, men litt viskøs.

Veksten av rene borreliakulturer vil ikke endre mediets turbiditet. Imidlertid vil veksten av bakteriekulturer, Borrelia, samt forurensninger, endre middels farge som følge av pH-indikatoren. Gjengroing av andre bakterier vil gi turbiditet og klumpede materialer (figur 2).

Dyrkningsvekst kan overvåkes med fasekontrast eller mørkefeltsmikroskopi (figur 3 og figur 4). Borreliaceller i eksponentiell fase er typisk slanke og knekkete, og til en viss grad bevegelige. Etter hvert som kulturene går inn i den stasjonære fasen, blir runde legemer stadig tydeligere (figur 5). Kliniske eller miljømessige isolater inneholder ofte flere borreliastammer og/eller arter. For å isolere rene kloner kan flytende kulturer belegges for å isolere monoklonale kolonier (figur 6); Noen ganger kan det være nødvendig med flere runder med koloniisolasjon.

Figure 1
Figur 1: BSK og MKP medium. (A) BSK (med antibiotika) med en ren kultur av Borrelia burgdorferi. Med eller uten B. burgdorferi forblir medium uten synlig turbiditet og er oransje-gult (fargen varierer litt med ingrediensene). (B) MKP-medium, ikke-inokulert, tining. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Forurenset BSK- og MKP-medium med overvekst av konkurrerende bakterier. Medium er misfarget, uklart, og over tid konkurrerende bakterier dør og faller ut til bunnen av røret. (A) Overgrodd BSK-rør. (B) Gammelt BSK-rør med utfelte forurensende bakterier. (C) MKP-rør med (venstre) og uten (midt) kultur og forurenset kultur (høyre). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3 Bruk av hemocytometer for å overvåke borreliavekst. Borrelia burgdorferi stamme B31 (en delmengde indikert med piler) sett på et hemocytometer (en linje i det lille rutenettet er indikert med pilspissen) under 200X fasekontrast. Denne forstørrelsen og prosessen tillater overvåking av kulturer og estimering av celletetthet. Skalastangen er 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Mørkefeltbilde av Borrelia burgdorferi. Darkfield-bilde av Borrelia burgdorferi-stammen SCW-53, ved høy tetthet i eksponentiell fase etter 5-7 dagers dyrking i MKP-medium (400X forstørrelse). Skala bar er 20 μm. Denne stammen ble isolert fra den harde flåtten Ixodes affinis, samlet i South Carolina, USA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Borrelia i gamle kulturer. Etter hvert som borreliaceller går inn i den stasjonære fasen i gamle kulturer, ser man i økende grad at runde kroppsformer erstatter spiroketalformen. Disse kan være sovende former eller døde celler. Venstre panel, Dieterle flekk; midtpanel, immunhistokjemi flekk; og høyre panel, fluorescerende in situ hybridisering av en borreliakultur (antatt å være B. burgdorferi basert på opprinnelse, men arten og stammen ble ikke molekylært identifisert) inokulert med hundeurin. Innsamling av dataene i figur 5 ble godkjent av Mrt. Allison University Animal Care Committee, godkjenningsnummer 16-1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Borrelia burgdorferi sensu lato komplekse spiroketter. Kolonier av Borrelia burgdorferi sensu lato komplekse spiroketter dyrket på fast medium for å isolere rene klonale populasjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bakterienes laboratoriekultur er springbrettet for forskning. Den dype fordelen som evnen til kultur gir, eksemplifiseres av kampen, over mer enn et århundre som kulminerte bare nylig i suksess, for å dyrke Treponema pallidum, spiroketen som er det etiologiske middelet til syfilis44. Borrelia spirochetes er også utfordrende å dyrke, men kultur er mulig 23,24,34,44,45,46,47,48,49.

Borreliaceller er kresne og hver art og stamme, og til og med isolere forskjellig, både genetisk og gjennom tilpasning til verten de har blitt isolert fra 51,52,53,54,55. Når du lager medier, gjør bruken av passende ingredienser en enorm forskjell i kraften til Borrelia-kulturen eller til og med kulturens levedyktighet. Bruk av ferskt tilberedt, høyt beriket og riktig lagret medium er viktig for å fremme bakterievekst og er et veletablert krav til bakterievekst. For Borrelia er det nødvendig å opprettholde anaerobe eller mikroaerobe forhold for god vekst. Dette kan oppnås enklest ved å fylle rør til toppen, så det er lite eller ingen luft igjen i røret og vokser kulturen uten omrøring; Strengere kontroll av oksygen og karbondioksid kan være nødvendig for genuttrykk og relaterte studier 26,27,28,29,30. Tilsetningen av antibiotika til bakteriekulturmediet kan virke motintuitivt; Bruk av lave doser antibiotika i borreliamediet skal motvirke vekst av raskere voksende bakterier. Hvis kulturen inokuleres med et rent Borrelia-isolat, er det ikke nødvendig med tilsetning av antibiotika; Bruk av tilsatte antibiotika er imidlertid viktig for å motvirke overvekst fra konkurrerende bakterier ved inokulering med kliniske eller miljømessige prøver. BSK medium kan også suppleres med 3% -7% gelatin. Dette er nødvendig for vekst av RF Borrelia-arter 21. Bruken av BSK eller MKP for vekst av Borrelia burgdorferi sensu lato-arter avhenger av kilden til isolatet. Begge mediene støtter veksten av etablerte kulturer, men MKP har vist seg å fungere bedre ved såing av nye kulturer med lavt antall borreliaceller, som forekommer med kliniske eller miljømessige isolater23,24. Dette mediet tillater også kulturen til B. miyamotoi56,57,58. Til syvende og sist er det et element av kunst til vitenskapen om voksende begeistrede mikrober, men det er mulig med forsiktighet og utholdenhet.

Kulturen i Borrelia ligger til grunn for fremskritt innen biomedisinsk forskning. Kulturen i Borrelia har gjort det mulig å bestemme hele genomet og proteomet til mange Borrelia-arter, noe som har gjort det mulig for forskere å begynne å avdekke utviklingen og biologien til disse spiroketene54,58,59. På samme måte tillater tilgang til rene kulturer av Borrelia forståelsen av de mange komplekse interaksjonene av Borrelia med pattedyrverten og leddyrvektoren 61,62,63,64,65, inkludert interaksjoner med vertsimmunsystemet11,65, gjør det mulig å utlede overføringsmekanismer 29,66, og gir det viktigste undersøkelsesverktøyet for å skille dyrkbare, og dermed nødvendigvis levende, celler fra cellulært rusk, et skille som er kritisk for å avdekke patogenesens mekanismer samt effektive behandlingsregimer 8,67,68,69,70,71. Mens in vitro borreliakulturen kan ta flere uker før spiroketer er tilstrekkelig rikelig for påvisning, har begrensende kliniske diagnostiske applikasjoner, grunnleggende forståelse av borreliabiologi, genomikk, vertspatogeninteraksjoner og mange flere applikasjoner stolt på evnen til å isolere ren borrelia kulturer fra miljøisolater, og å forsterke disse isolatene gjennom kultur for å produsere tilstrekkelig materiale for biokjemisk og genetisk analyse. Det er et samfunnsmessig press for rask respons på infeksjoner for å støtte rask diagnose og behandling. Den andre komponenten i dette behovet er imidlertid den biomedisinske og biologiske forskningen som trengs for et solid fundament for å behandle og forebygge sykdom på riktig og vellykket måte. Selv om det er utfordrende, er in vitro-dyrking av Borrelia spirochetes mulig og kan støtte disse behovene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Det ble ikke oppgitt interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis støttet av Natural Science and Engineering Research Council of Canada og Canadian Lyme disease Foundation (AB og VL), Vetenskapsrådet (SB, M-LF og IN), TAČR GAMA 2-prosjektet - "Support of application potential verification 2.0 at the Biology Centre CAS" (TP01010022) (MG og NR), og av et tilskudd fra Tsjekkias helsedepartement NV19-05-00191 (MG og NR). Vi takker S. Vranjes (2021, Rudenko lab) for bildet i figur 4 og J. Thomas-Ebbett (2021, Lloyd lab) for bildene i figur 5. Vi takker alle forskere som har bidratt til feltet og beklager til de som har fått sitt arbeid vi ikke kunne sitere på grunn av plassbegrensninger.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item - any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item - any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item - any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item - any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item - any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item - any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item - any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item - any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item - any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item - any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item - any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item - any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important - see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item - any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item - any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item - any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item - any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item - any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item - any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item - any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item - any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top - ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item - any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item - any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item - any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item - any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item - any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item - any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item - any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item - any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item - any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item - any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item - any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item - any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item - any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item - any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item - any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item - any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item - any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item - any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item - any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item - any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item - any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item - any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item - any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item - any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item - any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item - any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item - any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item - any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item - any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item - any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item - any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item - any supplier will do

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aberer, E., Duray, P. H. Morphology of Borrelia burgdorferi: Structural patterns of cultured borreliae in relation to staining methods. Journal of Clinical Microbiology. 29 (4), 764-772 (1991).
  2. Estrada-Peña, A., Cabezas-Cruz, A. Phyloproteomic and functional analyses do not support a split in the genus Borrelia (phylum Spirochaetes). BMC Evolutionary Biology. 19 (1), 54 (2019).
  3. Parte, A. C., Carbasse, J. S., Meier-Kolthoff, J. P., Reimer, L. C., Göker, M. List of prokaryotic names with standing in nomenclature (LPSN) moves to the DSMZ. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (11), 5607-5612 (2020).
  4. List of prokaryotic names with standing in nomenclature Genus Borrelia. , Available from: https://lpsn.dsmz.de/gnus/borrelia (2022).
  5. Margos, G., et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 13 (12), 0208432 (2018).
  6. Gupta, R. S., et al. Distinction between Borrelia and Borreliella is more robustly supported by molecular and phenotypic characteristics than all other neighbouring prokaryotic genera: Response to Margos' et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 14 (12), 0221397 (2019).
  7. Barbour, A. G., Qiu, W. Borreliella. Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. Trujillo, S., Dedysh, P., DeVos, B., Hedlund, P., Kampfer, F. A., Rainey,, Whitman, W. B. , John Wiley & Sons. 1-22 (2019).
  8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Kybicova, K., Vancova, M. Metamorphoses of Lyme disease spirochetes: Phenomenon of Borrelia persisters. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-10 (2019).
  9. Strnad, M., et al. Nanomechanical mechanisms of Lyme disease spirochete motility enhancement in extracellular matrix. Communications Biology. 4 (1), 268 (2021).
  10. Niddam, A. F., et al. Plasma fibronectin stabilizes Borrelia burgdorferi-endothelial interactions under vascular shear stress by a catch-bond mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (17), 3490-3498 (2017).
  11. Anderson, C., Brissette, C. A. The brilliance of Borrelia: Mechanisms of host immune evasion by Lyme disease-causing Spirochetes. Pathogens. 10 (3), 1-17 (2021).
  12. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  13. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 409-454 (2021).
  14. Lopez, J. E., et al. Relapsing fever spirochetes retain infectivity after prolonged in vitro cultivation. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 8 (6), 813-820 (2008).
  15. Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia Burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56 (8), 1831-1836 (1988).
  16. Biškup, U. G., Strle, F., Ružić-Sabljić, E. Loss of plasmids of Borrelia burgdorferi sensu lato during prolonged in vitro cultivation. Plasmid. 66 (1), 1-6 (2011).
  17. Gilmore, R. D., et al. Borrelia miyamotoi strain LB-2001 retains plasmids and infectious phenotype throughout continuous culture passages as evaluated by multiplex PCR. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (1), 101587 (2021).
  18. Krishnavajhala, A., Armstrong, B. A., Lopez, J. E. The impact of in vitro cultivation on the natural life cycle of the tick-borne relapsing fever spirochete Borrelia turicatae. PLoS One. 15 (10), 0239089 (2020).
  19. Kelly, R. Cultivation of Borrelia hermsi. Science. 173 (3995), 443-444 (1971).
  20. Stoenner, H. G. Biology of Borrelia hermsii in Kelly Medium. Applied Microbiology. 28 (4), 540-543 (1974).
  21. Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale Journal of Biology and Medicine. 57 (4), 521-525 (1984).
  22. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  23. Pollack, R. J., Telford, S. R., Spielman, A. Standardization of medium for culturing Lyme disease spirochetes. Journal of Clinical Microbiology. 31 (5), 1251-1255 (1993).
  24. Ružiæ-Sabljiæ, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  25. Ružić-Sabljić, E., et al. Comparison of isolation rate of Borrelia burgdorferi sensu lato in two different culture media, MKP and BSK-H. Clinical Microbiology and Infection. 20 (7), 636-641 (2014).
  26. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  27. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  28. Raffel, S. J., Williamson, B. N., Schwan, T. G., Gherardini, F. C. Colony formation in solid medium by the relapsing fever spirochetes Borrelia hermsii and Borrelia turicatae. Ticks and Tick-borne Diseases. 9 (2), 281-287 (2018).
  29. Margos, G., et al. Long-term in vitro cultivation of Borrelia miyamotoi. Ticks and Tick-borne Diseases. 6 (2), 181-184 (2015).
  30. Middelveen, M. J., et al. Culture and identification of Borrelia spirochetes in human vaginal and seminal secretions. F1000Research. 3, 309 (2014).
  31. Moriarty, T. J., et al. Real-time high resolution 3D imaging of the Lyme disease spirochete adhering to and escaping from the vasculature of a living host. PLoS Pathogens. 4 (6), 1000090 (2008).
  32. Cerar, T., Korva, M., Avšič-Županc, T., Ružić-Sabljić, E. Detection, identification and genotyping of Borrellia spp. In rodents in Slovenia by PCR and culture. BMC Veterinary Research. 11, 188 (2015).
  33. Liebisch, G., Sohns, B., Bautsch, W. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks attached to human skin by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 36 (11), 3355-3358 (1998).
  34. Ružić-Sabljić, E., Strle, F. Comparison of growth of Borrelia afzelii, B. gavinii, and B. burgdorferi sense strict in MKP and BSK-II medium. International Journal of Medical Microbiology. 294 (6), 407-412 (2004).
  35. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Schierz, G. European Borrelia burgdorferi isolated from humans and ticks culture conditions and antibiotic susceptibility. Zentralblatt fur Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene. Series A, Medical Microbiology, Infectious Diseases, Virology, Parasitology. 263 (1-2), 112-118 (1986).
  36. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Reinhardt, S. Culture of Borrelia burgdorferi on six solid media. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (12), 1076-1079 (1991).
  37. Rosa, P. A., Hogan, D. Colony formation by Borrelia burgdorferi in solid medium: clonal analysis of osp locus variants. First International Conference on Tick Borne Pathogens at the Host-Vector Interface: An Agenda for Research. , 95-103 (1992).
  38. Wagemakers, A., Oei, A., Fikrig, M. M., Miellet, W. R., Hovius, J. W. The relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi is cultivable in a modified Kelly-Pettenkofer medium, and is resistant to human complement. Parasites and Vectors. 7 (1), 4-9 (2014).
  39. Oliver, J. H., et al. First isolation and cultivation of Borrelia burgdorferi sensu lato from Missouri. Journal of Clinical Microbiology. 36 (1), 1-5 (1998).
  40. Greenfield, E. A. Myeloma and hybridoma cell counts and viability checks. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), 689-690 (2019).
  41. Baradaran-Dilmaghani, R., Stanek, G. In vitro susceptibility of thirty borrelia strains from various sources against eight antimicrobial chemotherapeutics. Infection. 24 (1), 60-63 (1996).
  42. Ružić-Sabljić, E., Podreka, T., Maraspin, V., Strle, F. Susceptibility of Borrelia afzelii strains to antimicrobial agents. International Journal of Antimicrobial Agents. 25 (6), 474-478 (2005).
  43. Sicklinger, M., Wienecke, R., Neubert, U. In vitro susceptibility testing of four antibiotics against Borrelia burgdorferi: A comparison of results for the three genospecies Borrelia afzelii, Borrelia garinii, and Borrelia burgdorferi sensu stricto. Journal of Clinical Microbiology. 41 (4), 1791-1793 (2003).
  44. Edmondson, D. G., Hu, B., Norris, S. J. Long-term in vitro culture of the syphilis spirochete treponema pallidum subsp. Pallidum. mBio. 9 (3), 01153 (2018).
  45. Wilhelmsson, P., et al. Prevalence and diversity of Borrelia species in ticks that have bitten humans in Sweden. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 4169-4176 (2010).
  46. Toledo, A., et al. Phylogenetic analysis of a virulent Borrelia species isolated from patients with relapsing fever. Journal of Clinical Microbiology. 48 (7), 2484-2489 (2010).
  47. Elbir, H., et al. Genome sequence of the Asiatic species Borrelia persica. Genome Announcements. 2 (1), 01127 (2014).
  48. Sapi, E., et al. Improved culture conditions for the growth and detection of Borrelia from human serum. International Journal of Medical Sciences. 10 (4), 362-376 (2013).
  49. Liveris, D., et al. Quantitative detection of Borrelia burgdorferi in 2-millimeter skin samples of erythema migrans lesions: Correlation of results with clinical and laboratory findings. Journal of Clinical Microbiology. 40 (4), 1249-1253 (2002).
  50. Wormser, G. P., et al. Comparison of the yields of blood cultures using serum or plasma from patients with early Lyme disease. Journal of Clinical Microbiology. 38 (4), 1648-1650 (2000).
  51. Lagal, V., Postic, D., Ruzic-Sabljic, E., Baranton, G. Genetic diversity among Borrelia strains determined by single-strand conformation polymorphism analysis of the ospC gene and its association with invasiveness. Journal of Clinical Microbiology. 41 (11), 5059-5065 (2003).
  52. Lin, Y. P., Diuk-Wasser, M. A., Stevenson, B., Kraiczy, P. Complement evasion contributes to Lyme Borreliae-host associations. Trends in Parasitology. 36 (7), 634-645 (2020).
  53. Real-time PCR: understanding Ct. Application Note Real-time PCR. Thermo Fisher Scientific Inc. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/PG1503-PJ9169-CO019879-Re-brand-Real-Time-PCR-Undertanding-Ct-Value-Americas-FHR.pdf (2016).
  54. Adams, B., Walter, K. S., Diuk-Wasser, M. A. Host specialisation, immune cross-reaction and the composition of communities of co-circulating Borrelia strains. Bulletin of Mathematical Biology. 83 (6), 66 (2021).
  55. Marosevic, D., et al. First insights in the variability of Borrelia recurrentis genomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005865 (2017).
  56. Koetsveld, J., et al. Development and optimization of an in vitro cultivation protocol allows for isolation of Borrelia miyamotoi from patients with hard tick-borne relapsing fever. Clinical Microbiology and Infection. 23 (7), 480-484 (2017).
  57. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  58. Replogle, A. J., et al. Isolation of Borrelia miyamotoi and other Borreliae using a modified BSK medium. Scientific Reports. 11 (1), 1926 (2021).
  59. Stanek, G., Reiter, M. The expanding Lyme Borrelia complex-clinical significance of genomic species. Clinical Microbiology and Infection. 17 (4), 487-493 (2011).
  60. Seifert, S. N., Khatchikian, C. E., Zhou, W., Brisson, D. Evolution and population genomics of the Lyme borreliosis pathogen, Borrelia burgdorferi. Trends in Genetics. 31 (4), 201-207 (2015).
  61. Kurokawa, C., et al. Interactions between Borrelia burgdorferi and ticks. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 587-600 (2020).
  62. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 473-518 (2021).
  63. Wolcott, K. A., Margos, G., Fingerle, V., Becker, N. S. Host association of Borrelia burgdorferi sensu lato: A review. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (5), 101766 (2021).
  64. Thompson, D., Watt, J. A., Brissette, C. A. Host transcriptome response to Borrelia burgdorferi sensu lato. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (2), 101638 (2021).
  65. Chaconas, G., Moriarty, T. J., Skare, J., Hyde, J. A. Live imaging. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 385-408 (2021).
  66. Kerstholt, M., Netea, M. G., Joosten, L. A. B. Borrelia burgdorferi hijacks cellular metabolism of immune cells: Consequences for host defense. Ticks and Tick-borne Diseases. 11 (3), 101386 (2020).
  67. Rudenko, N., Golovchenko, M. Sexual transmission of Lyme Borreliosis? The question that calls for an answer. Tropical Medicine and Infectious Disease. 6 (2), 87 (2021).
  68. Cutler, S. J., et al. Diagnosing Borreliosis. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 17 (1), 2-11 (2017).
  69. Middelveen, M. J., et al. Persistent Borrelia infection in patients with ongoing symptoms of Lyme disease. Healthcare. 6 (2), 33 (2018).
  70. Bernard, Q., Grillon, A., Lenormand, C., Ehret-Sabatier, L., Boulanger, N. Skin Interface, a key player for Borrelia multiplication and persistence in Lyme Borreliosis. Trends in Parasitology. 36 (3), 304-314 (2020).
  71. Bobe, J. R., et al. Recent progress in Lyme disease and remaining challenges. Frontiers in Medicine. 8, 666554 (2021).
  72. Branda, J. A., Steere, A. C. Laboratory diagnosis of lyme borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. 34 (2), 1-45 (2021).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 189
Dyrkingsmetoder for spiroketter fra Borrelia <em>burgdorferi</em> Sensu Lato-kompleks og tilbakefallsfeber <em>Borrelia</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berthold, A., Faucillion, M. L.,… More

Berthold, A., Faucillion, M. L., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter