Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

שיטות גידול של Spirochetes מ Borrelia burgdorferi Sensu Lato קומפלקס קדחת התקפית Borrelia

Published: November 25, 2022 doi: 10.3791/64431
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 1, 2, 3
1Department of Biology, Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology, Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences, Institute of Parasitology
* These authors contributed equally

Summary

תרבית חוץ גופית היא שיטת זיהוי ישירה לנוכחות חיידקים חיים. פרוטוקול זה מתאר שיטות לתרבית של מגוון סוגי Borrelia spirochetes, כולל אלה של Borrelia burgdorferi sensu lato complex, קדחת התקפית של מיני Borrelia ו- Borrelia miyamotoi. מינים אלה הם חסונים וגדלים לאט, אך ניתן לתרבית אותם.

Abstract

הבורליה מורכבת משלוש קבוצות של מינים, אלה של קבוצת ליים בורליוזיס (LB), הידועה גם בשם B. burgdorferi sensu lato (s.l.) ולאחרונה סווגה מחדש לבורליאלה, קבוצת קדחת התקפית (RF) Borrelia, וקבוצה שלישית של ספירוצ'טים הקשורים לזוחלים. שיטות מבוססות תרבית נותרו תקן הזהב לזיהוי מעבדה של זיהומים חיידקיים הן למחקר והן לעבודה קלינית, שכן תרבית של פתוגנים מנוזלי גוף או רקמות מזהה ישירות פתוגנים משכפלים ומספקת חומר מקור למחקר. Borrelia ו- Borreliella spirochetes הם מהירים וגדלים לאט, ולכן אינם מתורבתים בדרך כלל למטרות קליניות; עם זאת, התרבות נחוצה למחקר. פרוטוקול זה מדגים את המתודולוגיה והמתכונים הדרושים לתרבית מוצלחת של ספירוצ'טות LB ו- RF, כולל כל המינים המוכרים מקומפלקס B. burgdorferi s.l. כולל B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis, and RFspirochetes, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis ו-B. miyamotoi. המדיום הבסיסי לגידול ספירוצ'טות LB ו- RF הוא מדיום ברבור-סטונר-קלי (BSK-II או BSK-H), התומך באופן אמין בצמיחת ספירוצ'טות בתרבויות מבוססות. כדי להיות מסוגל לגדל מבודד בורליה מבודד חדש מדגימות שמקורן בקרציות או פונדקאי שבהן מספר הספירוצ'ט הראשוני נמוך בחיסון, עדיף מדיום קלי-פטנקופר שונה (MKP). מדיום זה תומך גם בצמיחה של B. miyamotoi. ההצלחה של טיפוח של spirochetes RF תלוי גם באופן קריטי באיכות המרכיבים.

Introduction

בורליה (שם מדעי: Borrelia) הוא סוג של חיידק ספירוצ'טה הכולל שלושה סוגים עיקריים: קבוצת ליים בורליוזיס (LB), קבוצת קדחת התקפית (RF), וקבוצה פחות מאופיינת המוגבלת לכאורה לזוחלים. טקסונומיה של בורליה נמצאת בשטף עם הופעתן של מתודולוגיות מולקולריות המאפשרות השוואה בין גנום לפרוטאום, כפי שנכון לגבי רוב הקבוצות הטקסונומיות האחרות 1,2,3,4,5,6,7. קבוצת LB (המכונה גם קבוצת מחלת ליים) נקראת באופן מסורתי Borrelia burgdorferi sensu lato על שם חבריה המאופיינים ביותר Borrelia burgdorferi sensu stricto.  מאמר זה משתמש בטרמינולוגיה הנפוצה ביותר כיום: LB, RF והקבוצה המשויכת לזוחלים, ומתאר את פרוטוקולי התרבות עבור קבוצות LB ו- RF.

כפי שניתן היה לצפות עבור בן משפחה Spirochaetaceae, Borrelia יכול לאמץ את הצורה הספירלית הארוכה והדקה הייחודית, בדרך כלל 20-30 מיקרומטר אורך ו 0.2-0.3 מיקרומטר רוחב. עם זאת, תאי בורליה הם פלאומורפיים מאוד ויכולים לאמץ צורות רבות אחרות הן בתרבית והן in vivo 1,8 כתוצאה מהמבנה התאי והגנטי המורכב שלהם. בצורתו הספירוכטלית, המורפולוגיה של גל הסינוס המישורי נובעת מכך שהאנדופלגלה הצירית שלו מסתובבת בחלל הפריפלסמי שבין הממברנות הפנימיות והחיצוניות. מבנה זה מאפשר לתאים להיות תנועתיים מאוד, כאשר הקרום החיצוני מכיל חלבונים המאפשרים לתא לתקשר עם רקמות מארחות 9,10. הביטוי של חלבוני הממברנה החיצונית מווסת היטב ומשפיע לא רק על פלישת רקמת המאכסן אלא גם על אינטראקציה עם מערכת החיסון המארחת11. ביטוי גנים מורכב זה מאפשר לתאי בורליה לנוע בין סביבות שונות מאוד של מארחי חוליות ווקטורים חסרי חוליות. הגנום של בורליה הוא יוצא דופן בקרב פרוקריוטים, המורכב מכרומוזום ליניארי ולא מעגלי. בנוסף לכרומוזום הליניארי, מיני בורליה מכילים 7-21 פלסמידים, חלקם ליניאריים וחלקם מעגליים. הפלסמידים מכילים את רוב הגנים הדרושים להסתגלות ולאלימות של המאכסן, והפלסמידים המעגליים שמקורם בפרופג'ים נחשבים כאחראים לרוב זרימת הגנים האופקית בין תאים ספירוכטליים12,13. בהתאם לתפקיד בהסתגלות המארח, חלקם, אולי רבים או כולם, מחברי קבוצת הבורליוזיס ליים מאבדים פלסמידים בתרבות14. הזן ה"מותאם למעבדה" הנחקר ביותר של B. burgdorferi, B31, מכיל רק שבעה מתוך תשעת הפלסמידים שנמצאו במבודדים פראיים של מין זה15. באופן דומה, B. garinii מאבד פלסמידים בתרבות16. כמה מחקרים הראו כי מיני RF ו- B. miyamotoi שומרים על פלסמידים בתרבית14,17, אך עבודות אחרונות מדגימות שינויים בפלסמידים והדבקה עם גידול מבחנה לטווח ארוך 18.

שיטות מבוססות תרבית נותרו תקן הזהב לזיהוי מעבדה של זיהומים חיידקיים, הן במחקר והן בעבודה קלינית14,17. תרבית של פתוגנים מנוזלי גוף או רקמות מזהה ישירות פתוגנים משכפלים ומספקת חומר מקור למחקר14,17. פרוטוקול זה מדגים את המתודולוגיה והמתכונים הדרושים לתרבית מוצלחת של הספירוכטות של קבוצת LB, כמו גם RF Borrelia ו- B. miyamotoi. המדיום הבסיסי לגידול ספירוצ'טות בורליה הוא מדיום ברבור-סטונר-קלי (BSK-II או BSK-H הזמין מסחרית), עם או בלי אנטיביוטיקה כדי להפחית את הצמיחה של פרוקריוטים מזהמים. מדיום זה הותאם ממדיום ששימש במקור לתמיכה ב-RF Borrelia19, שונה עוד יותר על ידי Stoenner20 ולאחר מכן על ידי Barbour21. שינויים רבים פותחו מאז, לכל אחד מהם יש השפעות על הפיזיולוגיה של החיידקים שיכולים להשפיע על גדילה, זיהומיות ופתוגניות22. מדיום זה תומך באופן אמין בגדילה של ספירוכטות בתרבויות מבוססות ושימש לבידוד ספירוכטות מדגימות קרציות, יונקים וקליניות23. הווריאציה שפותחה לאחרונה, מדיום קלי-פטנקופר (MKP), יכולה לספק הצלחה טובה יותר בבידוד, מורפולוגיה ותנועתיות בעת בידוד מבודדי בורליה חדשים מדגימות סביבתיות, כאשר מספר הספירוצ'טים הנמצאים במדגם הזמין לזרע התרבית נמוך23,24. בכל המקרים, הצלחת הטיפוח תלויה באופן קריטי במדיום המוכן ובשימוש במרכיבים המתאימים; לא כל המרכיבים המסחריים מייצרים מדיום באיכות גבוהה. תרביות מחוסנות יכולות להיות מודגרות בנוחות מבלי לרעוד באינקובטור קונבנציונלי של 32-34 מעלות צלזיוס בנוכחות כמות קטנה של שאריות חמצן סביבתי. Borrelia spirochetes הם אנאירובים אך חשופים בטבע לתנודות בריכוזי חמצן ופחמן דו חמצני ומגיבים לשינויים בביטוי גנים26,27,28,29. לפיכך, ביטוי גנים, גדילה ומחקרים מטבוליים אחרים צריכים לשלוט על רמות חמצן ופחמן דו חמצני באמצעות אינקובטור מבוקר חמצן או תא אנאירובי. בתרבית, תרביות נבדקות מדי שבוע, או לעתים קרובות יותר, עבור נוכחות של spirochetes עם מיקרוסקופ שדה כהה או מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. כתמי תרבית יכולים להיות מוכתמים בכתמי כסף, אימונוהיסטוכימיה, או באמצעות שימוש בזנים מתויגים פלואורסצנטית29,30. PCR ואחריו ריצוף DNA היא שיטה רגישה וספציפית לזהות ולזהות גנטית או לאשר את מיני Borrelia 30,31,32,33.

קיימות וריאציות קטנות רבות על BSK-II, וחלקן זמינות מסחרית. הפרוטוקול המתואר כאן בסעיף 1 עובד מברבור (1984)21. מדיום MKP נוזלי הוא מדיום שפותח לאחרונה ומתואר בסעיף 2. הוא מוכן על פי פרוטוקול33,34 שדווח בעבר, אשר, בדומה למדיום BSK, מורכב משני שלבים: הכנת מדיום בסיסי והכנת מדיום שלם. ניתן להכין מדיום תרבית בורליה עם אנטיביוטיקה או בלעדיה, כמתואר בסעיף 3; חוק האנטיביוטיקה להפחתת חיידקים מזהמים שהוכנסו בעת חיסון בדגימות קליניות או סביבתיות, כמתואר בסעיף 4; אם מחסנים בתרבית Borrelia sp. טהורה, ייתכן שלא יהיה צורך באנטיביוטיקה. ייצור מניות בורליה לטווח ארוך הוא לעתים קרובות חשוב, ופרוטוקול לכך מתואר בסעיף 5. סעיף 6 מתאר שימוש במדיה זו כדי לבודד שיבוטים טהורים של Borrelia sensu lato מדגימות קליניות או סביבתיות. ישנן מספר גישות אפשריות36; להלן אחד שנמצא יעיל. אמצעי הציפוי המשמש בפרוטוקול זה הוא שינוי של מדיום ציפוי BSK-II37 ו- MKP בינוני 34 (עם סרום ארנב גדל ל -10%38).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל המחקרים שכללו דגימות שהתקבלו מנבדקים אנושיים אושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית של האוניברסיטה ו / או המתקן הרפואי הרלוונטיים, והסכמה מדעת בכתב התקבלה מהמשתתפים לפני איסוף הדגימות. כל המחקרים שכללו דגימות שנלקחו מבעלי חיים אושרו ונערכו תחת הנחיות הוועדה המוסדית לאתיקה של בעלי חיים. במידת הצורך, התקבלו אישורים לדיגום סביבתי.

הערה: הצלחת התרבות תלויה באופן קריטי באיכות המרכיבים. מדיום BSK מסחרי זמין ותומך בצמיחה של B. burgdorferi טהור מותאם מעבדה ומינים קרובים שבהם ניתן להשתמש בחיסון במינון גבוה כדי לזרוע את התרבית. עבור בידוד זנים מחומר ביולוגי ראשוני, מדיום טרי הוא מועדף ולעתים קרובות הכרחי.

Borrelia sp. הם פתוגנים ידועים או חשודים, ורקמות אנושיות או בעלי חיים שלא נבדקו יכולות גם הן להוות סכנה ביולוגית. טיפול בחומר שעלול להיות מדבק דורש ציוד מגן אישי וטכניקה סטרילית לבטיחות החוקרים. בנוסף, המדיום כל כך עשיר בחומרים מזינים שהתרבית מזוהמת בקלות. הכלה ברמת בטיחות ביולוגית 2 נדרשת בדרך כלל לעבודה זו וכל עבודה עם Borrelia sp. או דגימות צריכה להתבצע בארון בטיחות ביולוגי.

1. הוראות להכנת מדיום BSK-II

  1. הכנת מדיום BSK-II מלא
    1. השג ריאגנטים להכנת 1 ליטר של המדיום, כפי שמוצג בטבלה 1.
      הערה: טוהר BSA (או חוסר טוהר) הוא קריטי לצמיחה אופטימלית. בפרט, טוהר BSA שונה בין היצרן לבין הרבה. עיין בטבלה 2 לקבלת רשימה של מוצרים מוצלחים יותר לעומת מוצרים מוצלחים פחות. קבלת מספר דוגמאות מספקים שונים, בדיקת אותם לצמיחה אופטימלית, ולאחר מכן קניית כמות גדולה של המגרש הטוב ביותר היא אסטרטגיה יעילה כדי להקל על בעיה זו ולייצר מדיום טוב.
    2. התחל עם המסת BSA בכוס על ידי ערבוב במים, אשר ייקח לפחות חצי שעה.
    3. מוסיפים את כל הכימיקלים היבשים ונותנים להם להתמוסס. לאחר מכן הוסף את CMRL.
    4. התאם את ה- pH של מדיום BSK-II ל- 7.6, במידת הצורך, עם 1 M NaOH.
    5. הוסיפו סרום ארנבים למדיום BSK-II לריכוז של 6%-10%. מסנן לעקר (0.22 מיקרומטר גודל נקבוביות) את המדיום BSK-II. כמות הסרום הנדרשת תלויה במין Borrelia . השתמש 6%-7% עבור מינים וזנים RF, ועבור Borrelia burgdorferi sensu lato. אם הצמיחה אינה חזקה, הוסיפו עוד 1%-2% סרום ארנבים סטרילי למדיום.
    6. להקפיא את המלאי של מדיום BSK-II ב 100 מ"ל או 400 מ"ל aliquots.
    7. עבור זני RF, ג'לטין נדרש. מוסיפים 100 מ"ל של 7% ג'לטין סטרילי (מחומם מעט כדי להכניס אותו לתמיסה) ל 400 מ"ל BSK-II בינוני. חממו את BSK-II עם ג'לטין ב 37 °C כדי להפוך את הג'לטין להמיס לפני חיסון התרבית.
      הערה: ניתן להקפיא מדיום (-20°C) לפני עיקור מסנן והוספת סרום ארנבת וג'לטין (עבור ספירוצ'טות RF) או לאחר עיקור מסנן והוספת סרום (וג'לטין). המדיום יציב כאשר קפוא במשך זמן רב. כאשר מאוחסן במקרר, להשתמש במדיום בתוך חודש אחד. מיני RF גדלים בצורה הטובה ביותר עם מדיום טרי, בדרך כלל לא יותר משבוע אחד. אם לא קפוא, לבדוק חזותית את איכות המדיום עבור עכירות. השליכו את המדיום שנראה מזוהם, מרכיבים מזרזים או מפוקפקים בדרך אחרת.
    8. אם יש להוסיף אנטיביוטיקה למדיום, להוסיף אותם למדיום טרי או לאליציטוטים שהוקפאו בעבר; האחרון הוא הגישה הגמישה יותר. השתמש בריכוזי אנטיביוטיקה כפי שתוארו על ידי Oliver et al.39.
    9. בעת הפשרת צינור של התווך, לשקול אנטיביוטיקה לתוך צינורות סטריליים (autoclaved) 1.7 מ"ל או סטריליים 15 מ"ל צינורות חרוטיים, באמצעות איזון מדויק. הכן את פתרונות המלאי כדלקמן: להמיס 25 מ"ג של amphotericin B ב 10 מ"ל של DMSO, 20 מ"ג של phosphomycin ב 1 מ"ל של מים מזוקקים autoclaved, ו 50 מ"ג של rifampicin ב 1 מ"ל של DMSO.
    10. מסננים לעקר (מזרק 0.2 מיקרומטר מסננים) את האנטיביוטיקה ולהעביר אותם לתוך צינור חדש בגודל המתאים.
    11. לדלל את האנטיביוטיקה ביחס של 1:1000 של המדיום כדי להגיע לריכוז הסופי שלהם. עבור 500 מ"ל של BSK, הוסף 0.5 מ"ל של תמיסת מלאי אמפוטריצין B (2.5 מ"ג/מ"ל ב-DMSO), 0.5 מ"ל של תמיסת מלאי פוספומיצין (20 מ"ג/מ"ל ב-H2O סטרילי) ו-0.5 מ"ל של תמיסת מלאי ריפמפיצין (ארה"ב: ריפמפין) (50 מ"ג/מ"ל ב-DMSO).
    12. השתמש במדיום או באליקוט בתוספת אנטיביוטיקה והקפיא ב -20 מעלות צלזיוס.
- הרכבים סכום (/L)
BSA חלק V 50 גרם
CMRL-1066 (10x) 100 מ"ל
נאופטון 5 גרם
Hepes 6 גרם
חומצת לימון, טריסודיום, מלח, דיהידרט; 0.7 גרם
גלוקוז 5 גרם
TC Yeastolate 2 גרם
חומצה פירובית (מלח נה) 0.8 גרם
N-אצטיל-D-גלוקוזאמין 0.4 גרם
סודיום ביקרבונט 2.2 גרם
מים (טוהר גבוה) 900 מ"ל

טבלה 1: הרכב של 1 ליטר של מדיום BSK-II.

מקור התאמה
Serva GmbH, היידלברג, גרמניה כן
Proliant Biologicals, בון IA, ארה"ב כן
Sigma (Millipore-Sigma & Sigma- Aldrich), סנט לואיס, MO, ארצות הברית לא

טבלה 2: מקורות BSA והתאמה למדיום BSK-II.

2. הוראות להכנת MKP

  1. הכנת מדיום בסיסי
    1. יש לשקול ולהמיס בזהירות את כל רכיבי האבקה כמפורט להלן בטבלה 3 ב-3/4 מהנפח הסופי של ddH2O (כ-750 מ"ל) על ידי ערבוב עד להמסה מלאה, שאורכת ~1 שעות.
    2. לאחר המסה מלאה, כוונן את ה- pH עם NaOH ל- 7.6 ואת הנפח ל- 1000 מ"ל, ולאחר מכן עקר על ידי סינון (מסנן 0.22 מיקרומטר).
      הערה: ניתן לאחסן מדיום בסיסי בטמפרטורה של -20°C למשך עד 3 חודשים.
  2. הכנת MKP מדיום מלא
    1. לערבב את כל הרכיבים כמפורט בטבלה 4 באופן סטרילי; לעקר את הג'לטין על ידי autoclaving ולטפל בצורה סטרילית. יש לעבוד בארון בטיחות ביולוגי סטרילי ולהשתמש בסרום סטרילי מסונן.
    2. Aliquot MKP בצינורות 50 מ"ל. שים aliquot אחד קטן ב 33 ° C במשך כמה ימים, ולאחר מכן לבדוק תחת מיקרוסקופ שדה כהה עבור היעדר זיהום.
      הערה: שמור על MKP שלם בינוני ב +4 ° C לא יותר מחודש אחד, ולא להקפיא. ניתן לעקר בנוסף את המדיום המלא על ידי סינון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
- הרכבים סכום (/L)
CMRL-1066 (פי 10 ללא גלוטמין) 100 מ"ל (אם נוזלי)/9.7 גרם/ליטר אם אבקה
נאופטון 3 גרם
Hepes 6 גרם
חומצת לימון 0.7 גרם
גלוקוז 3 גרם
חומצה פירובית 0.8 גרם
N-אצטילגלוקוזאמין 0.4 גרם
סודיום ביקרבונט 2 גרם

טבלה 3: הרכב של 1 ליטר של מדיום MKP בסיסי (Modified Kelly-Pettenkofer).

- הרכבים כמות (מ"ל)
מדיום בסיסי 500
7% ג'לטין (ב-H2O) (טרי אך לא חם) 100
סרום ארנב 36
35% BSA 17.5

טבלה 4: הרכב MKP (Modified Kelly-Pettenkofer) מדיום שלם.

3. תרבות של Borrelia, עם או בלי אנטיביוטיקה

  1. לבצע את כל שלבי הניסוי בתנאי עבודה סטריליים בארון בטיחות ביולוגי. יש לחטא את פני השטח ואת כל החומרים באתנול 70%, ולהעבירם מיד לארון הבטיחות הביולוגי. UV לעקר את כל החומרים הלא ביולוגיים בארון הבטיחות הביולוגי במשך 5 דקות לפני תחילת העבודה.
  2. השתמש במדיום הטרי ביותר האפשרי.
  3. כדי להתחיל תרבות, מראש לחמם את המדיום (33 ° C - 37 ° C) באינקובטור. יש למרוח ניעור במידת הצורך.
    הערה: בהתאם לעוצמת הקול של בינוני, שלב זה עשוי להימשך מספר שעות.
  4. הוסף ~ 1 מ"ל של תרבית Borrelia מופשרת מגליצרול או מלאי דומה, שאוחסן בעבר ב -80 ° C והופשר בטמפרטורת החדר (RT), ברגע שהוא נוזלי, ל 5-15 מ"ל של מדיום BSK מחומם מראש. חסן את התרבית לנפח קטן (5-15 מ"ל של BSK) באמצעות בקבוקוני זכוכית או פלסטיק זמינים מסחרית עם מכסי בורג. מלאו את הצינורות כמעט מלאים כדי ליצור אווירה מיקרו או אנאירובית. סגור את הצינורות בחוזקה; אם תרבית באופן זה, CO2 אינו נחוץ.
  5. לגדל מיני RF (ו - B. persica) ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור ללא ערבוב או תסיסה. לגדל B. burgdorferi sensu lato מינים ב 33-34 °C (75 °F).
  6. עקבו אחר הצמיחה של תרבית בורליה באמצעות ניגודיות פאזה או מיקרוסקופ שדה כהה בהגדלה של 200x-400x (איור 3). כדי להבטיח פיזור אחיד של תאים, מערבבים את התרבית עם פיפטה סרולוגית או לערבוב נוסף עם פיפטת העברה של 3 מ"ל תוך כדי פיפט למעלה ולמטה.
    הערה: בורליה נראים בעיקר בהגדלה גבוהה יותר (200X-400X), אך ניתן לספור אותם בצורה הטובה ביותר בהגדלה של 200X על המוציטומטר40. תנועת בורליה ומורפולוגיה מעידים על נוכחותם של חיידקים אלה.
  7. כדי לכמת את צמיחת החיידקים, ספרו כמה (10) ריבועים קטנים בודדים בתבנית הרשת בת שישה עשר השדות של שטח הספירה משני צידי ההמוציטומטר והממוצע. הכפל את מספר התא הממוצע לכל ריבוע קטן כאשר מקדם ההמרה המתאים להמוציטומטר משמש לקביעת ספירת התאים למ"ל.
  8. עקוב אחר צמיחת החיידקים במרווחים של 1-2 ימים. הגידול המעריכי של Borrelia תלוי בכדאיות ובצפיפות התא ועשוי להימשך שבוע או יותר ב 34 °C (75 °F). לדלל את תרביות הפאזה המעריכית ביחס של 1:2 או 1:4 עם המדיום בצינור 1.7 מ"ל לפני העמסה על המוציטומטר. כלול התחשבות מתאימה בגורם הדילול בעת קביעת ספירת התא. לאחר השימוש, רססו את המשטחים ואת ההמוציטומטר באקונומיקה מדוללת (10%) ו/או 70% אתנול.
    הערה: Borrelia נמצאים בצמיחה אקספוננציאלית כאשר ריכוזי התאים הם 1-5 x 107 תאים / מ"ל. בתוך טווח זה, התאים גדלים היטב.
  9. תרבית מורחבת תרוקן חומרים מזינים ותשנה pH בינוני ולכן נדרשת תת-תרבות. בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגי, מעבירים 1/10 מנפח התרבית לצינור חדש וממלאים אותו בתווך החדש (אליקוט טרי של אותו מדיום ששימש לגידול המעבר הקודם). דילול של 1:10 הוא אופטימלי. אם רוצים לשנות את נפח התרבית, התאימו את כמות החיסון בהתאם, והמשיכו בדגירה. מספר המעברים גדל עם כל שינוי בינוני.
  10. עבור מיצוי של DNA או בידוד של תאי Borrelia, צנטריפוגה את השלב המעריכי Borrelia במשך 10 דקות ב 4000 x גרם כדי pellet את החיידקים. יש להשליך את הסופרנאטנט לפסולת מסוכנת ביולוגית מתאימה. לעבד את החיידקים הכדוריים עם ערכת מיצוי DNA מסחרית או להשהות מחדש את החיידקים במדיום מתאים לניסוי המיועד.
  11. בסוף כל מניפולציה, לעקר את כל הציוד עם אתנול וקרינת UV, בהתאם לציוד. יש לאסוף את הפסולת הנוזלית, כולל עודפי תרבית, בבקבוק פסולת ולהוסיף אקונומיקה לריכוז סופי של 10%. יש להניח את הבקבוק בטמפרטורה של -80°C לפני השלכתו. לחלופין, לעקר את הפסולת הנוזלית ואת התרבית ללא אקונומיקה או אלכוהול על ידי autoclaving.

4. אחסון לטווח ארוך של תרבויות בורליה

  1. הכנת מלאי גליצרול של תרבית בורליה
    1. קח ~ 1.8 מ"ל aliquots של תרביות פאזה מעריכית, ריכוזי תאים ~ 107-10 8 תאים / מ"ל, ולהוסיף גליצרול סטרילי לריכוז סופי של 10% (ריכוזים של 5%-20% עבודה).
    2. מניחים בבקבוקונים קריוגניים של מכסה בורג 2 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C.
    3. החזיקו במקפיא מלאי עם לפחות 10 צינורות מכל זן.
  2. מתכון אחסון חלופי לייצור מלאי גליצרול לאחסון קבוע
    1. ערבבו 2/3 מתרבית בורליה עם 1/3 של 15% גליצרול בציר ברוסלה . השתמש 2.8 גרם של מרק Brucella מומס ב 100 מ"ל של ddH2O, אשר היה סטרילי מסונן (0.22 מיקרומטר).
    2. שמור את מלאי הגליצרול של דגימות ב -70 ° C עד -80 ° C.

5. בידוד של spirochetes ממקורות סביבתיים או קליניים

הערה: אם מבודדים חומר ממקורות אנושיים, בעלי חיים או סביבתיים, יש לקבל אתיקה מחקרית, טיפול בבעלי חיים או אישור אקולוגי, לפי הצורך.

  1. גידול בורליה מקרציות קשות
    1. אספו נקבות בוגרות, זכרים ו/או קרציות נימפה.
    2. יש לעקר את כל דגימות הקרציות על ידי טבילתן באתנול 70% למשך 2 דקות ולייבש באוויר בארון בטיחות ביולוגי. מנתחים בנפרד למספר חתיכות בעזרת אזמל סטרילי. מניחים את החתיכות לתוך צינור 2 מ"ל המכיל 1.5 מ"ל של בינוני, בתוספת אנטיביוטיקה.
    3. יש לדגור על התרביות בטמפרטורה של 34°C ולבדוק אם יש ספירוצ'טות על ידי מיקרוסקופ ניגודיות שדה כהה או פאזה פעמיים בשבוע במשך השבועיים הראשונים ולאחר מכן מדי שבוע במשך 6 שבועות (לעתים קרובות יותר עבור ספירוצ'טות RF). דגימות תת-תרבותיות חיוביות ב-5 מ"ל של אותו מדיום.
      הערה: ניתן לטהר תרביות מזוהמות במידה מסוימת על ידי סינון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר; אנטיביוטיקה עשויה להידרש כדי לפתור זיהום באופן מלא.
  2. טיפוח בורליה מדגימות דם
    הערה: דגימת הדם צריכה להילקח על ידי איש מקצוע רפואי, וטרינרי או מחקרי מוסמך, בהתאם למקור החומר. פחות מ- 24 שעות ב- RT אמורות לחלוף בין הדגימה
    הסרה והגעה למעבדה.
    1. להשיג 10 מ"ל של דם, שנאסף לתוך צינורות איסוף דם זכוכית עם חומצה ציטראט דקסטרוז (ACD; "צמרת צהובה") כנוגד קרישה. להשאיר בטמפרטורת החדר. מומלץ לעבור פחות מ -24 שעות בין איסוף הדם לחיסון.
    2. צנטריפוגה את הדם עם נוגדי קרישה במשך 10 דקות ב 200-400 x גרם כדי להפריד פלזמה מתאי הדם.
    3. הסר בעדינות את הפלזמה מהצינור וחסן 1 מ"ל פלזמה לתוך 5 מ"ל של MKP מחומם מראש מדיום מלא. MKP ניתן להשלים עם אנטיביוטיקה. לדגור על תרביות ב 33 ° C עם בדיקה חזותית יומית ומיקרוסקופ ניגודיות שדה כהה או פאזה שבועי עד לצמיחת בורל הוא שם לב (לעתים קרובות יותר עבור RF Borrelia), אשר יכול לקחת עד 9 שבועות.
      הערה: אם אתם משתמשים בנפחי חיסון גדולים או קטנים יותר, שמרו על יחס של 1:5 בין החיסון לבינוני. השתמש sera או פלזמה ולא דם שלם.
  3. גידול בורליה מביופסיה של העור
    1. לעקר את פני השטח של ביופסיית העור (רצוי קובייה של 3 מ"מ x 3 מ"מ x 3 מ"מ; כלומר, עם 70% אתנול ומי חמצן). מניחים את דגימת הביופסיה במי מלח פיזיולוגיים.
      הערה: דגימת ביופסיה צריכה להילקח על ידי איש מקצוע רפואי, וטרינרי או מחקרי מוסמך, בהתאם למקור החומר. פחות מ-24 שעות ב-RT אמורות לחלוף בין הסרת הדגימה להגעה למעבדה.
    2. חתכו את הדגימה לשתיים עד שש חתיכות קטנות יותר באמצעות סכין גילוח סטרילית בצלחת פטרי סטרילית מזכוכית בעודכם שקועים במי מלח פיזיולוגיים. להעביר את כל הדגימות ו~ 1 מ"ל של המלח הפיזיולוגי שבו אוחסנה ביופסיית העור לתוך 5 מ"ל של מדיום שחומם מראש בתוספת אנטיביוטיקה ולדגור ב 33 מעלות צלזיוס.
    3. במקרה של צמיחת יתר של חיידקים מזהמים, להוסיף אנטיביוטיקה כמו בשלב 1.1.10 לעיל, או על ידי הוספת שתי טבליות של sulfamethoxazole (23.75 מ"ג; ריכוז סופי 5 מ"ג / מ"ל) + trimethoprim (1.25 מ"ג; 0.25 מ"ג / מ"ל) או Bactrim (ריכוז מעכב מינימלי >128 מיקרוגרם / מ"ל), שתי טבליות של Amikacin (2 x 30 מיקרוגרם; ריכוז סופי 12 מיקרוגרם / מ"ל), ושתי טבליות של פוספומיצין (2 x 200 מיקרוגרם; ריכוז סופי 80 מיקרוגרם/מ"ל).
      הערה: בכל המקרים, הקפד להישאר מתחת לריכוז המעכב המינימלי של אנטיביוטיקה זו עבור זן Borrelia שעבורו מנסים תרבית41,42,43.
    4. אם התרבית חיובית לבורליה, שמרו את התרבית למשך 3-4 ימים נוספים או עד שכמות הבורליה תגיע ל-10+ ספירוצ'טות בשדה מיקרוסקופ באמצעות מטרה של פי 40. צור מלאי גליצרול לאחסון קבוע.

6. בידוד אוכלוסיות חד-שבטיות, של B. burgdorferi sensu lato spirochetes ו-B. miyamotoi מתרביות נוזליות על ידי גידול על מצע מוצק;

  1. להכנת צלחות, חם 300 מ"ל של 1.5X MKP בינוני מלא (ללא ג'לטין). כמו כן, חם 200 מ"ל של 1.7% agarose (autoclaved במים deionized, מאוחסן ב RT, ומיקרוגל לפני השימוש) עד 55 ° C. מערבבים את שני הנוזלים.
  2. פיפטה 15 מ"ל של תערובת זו לתוך כל אחד מ 16 צלחות פטרי עמוק כדי להפוך את שכבת האגר התחתונה.
  3. שמור על שאר המדיום ב 55 ° C באמבט מים.
    הערה: הבורליה מעורבבים בשכבת האגרוז העליונה.
  4. ראשית, לכמת את צפיפות תרבית בורליה באמצעות המוציטומטר ולדלל לצפיפות הרצויה בתווך נוזלי.
    הערה: 500, 200, 100 ו-50 ספירוצ'טות לצלחת עובדות היטב.
  5. לאחר שהלוחות התחתונים התמצקו, הוסיפו 10 מ"ל מתערובת האגרוז הנותרת לצינור של 15 מ"ל המכיל את המספר המתאים של ספירוצ'טים.
  6. יוצקים את המתלה על האגרוז התחתון בצלחת הפטרי המסומנת.
    הערה: מכיוון שספירוצ'טות Borrelia רגישות לטמפרטורה גבוהה, יש להקפיד על כך שהחיידקים לא ייחשפו ל-55°C למשך פרק זמן ממושך; יוצקים את האגר העליון מיד עם הוספתו לתאי החיידקים בתווך.
  7. לאחר שהצלחות מוצקות לחלוטין, סגרו את צלחות הפטרי והניחו אותן הפוכות בטמפרטורה של 34-35 מעלות צלזיוס ב-2.5% CO2.
    הערה: המושבות יופיעו שבוע לאחר הציפוי אם ההליך הצליח.
  8. כדי לסנן ולהרחיב את המושבות הבודדות, בחר מושבות בודדות מהלוחות והכנס אותן לתוך 1.5 מ"ל של MKP נוזלי שונה, או מדיה מתאימה אחרת, בצינורות תרבות סטריליים של 2 מ"ל.
  9. יש לדגור על התרביות בטמפרטורה של 34°C ולבדוק אם יש ספירוצ'טות באמצעות מיקרוסקופ שדה כהה או פאזה. השתמש בתרבויות אלה לניתוח או מניות, שנעשו כמתואר לעיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מדיה תרבותית Borrelia BSK ו- MKP, וריאנטים, הם מדיה תרבותית עשירה עם מרכיבים שצריך להכין ולעקר ברצף. כאשר מכינים אותו נכון, מדיום BSK צריך להיות אדום-כתום ושקוף (איור 1). עכירות ומשקעים הנמשכים לאחר ההתחממות מצביעים על מרכיבים בעייתיים, ייצור בינוני או זיהום; מדיום כזה הוא הטוב ביותר לזרוק. אם מוסיפים ג'לטין ל- BSK ועם MKP, המדיום יהיה ג'לטיני בקירור; עם ההתחממות, הוא יהיה נוזלי, אם כי צמיג מעט.

צמיחתן של תרביות בורליה טהורות לא תשנה את עכירות המדיום. עם זאת, הצמיחה של תרביות חיידקים, Borrelia, כמו גם מזהמים, ישתנה צבע בינוני כתוצאה של מחוון pH. צמיחת יתר של חיידקים אחרים תייצר עכירות וחומרים גושים (איור 2).

ניתן לנטר את צמיחת התרבית באמצעות ניגודיות פאזה או מיקרוסקופ שדה כהה (איור 3 ואיור 4). תאי בורליה בשלב המעריכי הם בדרך כלל דקים ומפותלים, ונעים במידה מסוימת. ככל שהתרביות נכנסות לשלב הנייח, גופים עגולים נראים יותר ויותר (איור 5). מבודדים קליניים או סביבתיים מכילים לעתים קרובות זנים ו / או מינים מרובים של Borrelia . כדי לבודד שיבוטים טהורים, ניתן לצפות תרביות נוזליות כדי לבודד מושבות חד-שבטיות (איור 6); לעיתים, ייתכן שיהיה צורך בסבבים מרובים של בידוד מושבות.

Figure 1
איור 1: מדיום BSK ו-MKP . (A) BSK (עם אנטיביוטיקה) עם תרבית טהורה של Borrelia burgdorferi. עם או בלי B. burgdorferi בינוני נשאר ללא עכירות נראית לעין והוא כתום-ענברי (הצבע משתנה מעט עם המרכיבים). (B) MKP בינוני, לא מחוסן, מפשיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מדיום BSK ו-MKP מזוהם עם צמיחת יתר של חיידקים מתחרים. המדיום דהוי, עכור, ועם הזמן חיידקים מתחרים מתים ושוקעים לתחתית הצינור. (A) צינור BSK מגודל. (B) צינור BSK ישן עם חיידקים מזהמים מואצים. (C) צינור MKP עם תרבית (משמאל) וללא תרבית (באמצע) ותרבות מזוהמת (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שימוש בהמוציטומטר כדי לעקוב אחר גדילת בורליה . זן Borrelia burgdorferi B31 (תת-קבוצה המסומנת על ידי חצים) במבט על המוציטומטר (קו אחד של הרשת הקטנה מסומן על ידי ראש החץ) תחת ניגודיות פאזה של 200X. הגדלה ותהליך זה מאפשרים ניטור של תרביות והערכת צפיפות התא. סרגל קנה המידה הוא 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תמונת שדה כהה של Borrelia burgdorferi. תמונת שדה כהה של זן Borrelia burgdorferi SCW-53, בצפיפות גבוהה בשלב מעריכי לאחר 5-7 ימי גידול במדיום MKP (הגדלה של 400X). סרגל קנה המידה הוא 20 מיקרומטר. זן זה בודד מהקרצייה הקשה Ixodes affinis, שנאספה בדרום קרוליינה, ארצות הברית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: בורליה בתרבויות עתיקות. ככל שתאי בורליה נכנסים לשלב הנייח בתרבויות ישנות, צורות גוף עגולות נראות יותר ויותר כמחליפות את הצורה הספירוכטלית. אלה עשויים להיות צורות רדומות או תאים מתים. פאנל שמאלי, כתם דיטרל; פאנל אמצעי, כתם אימונוהיסטוכימי; ופאנל ימני, הכלאה פלואורסצנטית באתרה של תרבית בורליה (ככל הנראה B. burgdorferi על בסיס מוצאו אך המין והזן לא זוהו מולקולרית) מחוסנת בשתן כלבים. איסוף הנתונים באיור 5 אושר על-ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת אליסון, אישור מספר 16-1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: Borrelia burgdorferi sensu lato complex spirochetes. מושבות של Borrelia burgdorferi sensu lato מורכבים spirochetes גדל על תווך מוצק על מנת לבודד אוכלוסיות שבטים טהורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תרבית המעבדה של חיידקים היא קרש קפיצה למחקר. היתרון העמוק שמעניקה היכולת לתרבות בא לידי ביטוי במאבק, במשך יותר ממאה שנה שהגיע לשיאו רק לאחרונה בהצלחה, לתרבות Treponema pallidum, הספירוכטה שהיא הסוכן האטיולוגי של עגבת44. גם ספירוצ'טות בורליה מאתגרות את התרבות, אך התרבות אפשרית 23,24,34,44,45,46,47,48,49.

תאי בורליה הם קשיחים וכל מין וזן, ואף מבודדים שונים, הן גנטית והן באמצעות הסתגלות לפונדקאי ממנו בודדו 51,52,53,54,55. בעת הכנת מדיה, השימוש במרכיבים מתאימים עושה הבדל עצום במרץ של תרבות בורליה או אפילו בכדאיות של התרבות. השימוש במדיום טרי, מועשר מאוד ומאוחסן כראוי חיוני לקידום צמיחת חיידקים והוא דרישה מבוססת היטב לצמיחת חיידקים. עבור Borrelia, שמירה על תנאים אנאירוביים או microaerobic נדרש לצמיחה טובה. ניתן להשיג זאת בפשטות רבה על ידי מילוי צינורות למעלה, כך שלא נותר כמעט אוויר בצינור וגידול התרביות ללא תסיסה; בקרה קפדנית יותר של חמצן ופחמן דו חמצני עשויה להידרש לביטוי גנים ומחקרים קשורים 26,27,28,29,30. הוספת אנטיביוטיקה למדיום תרבית החיידקים עשויה להיראות מנוגדת לאינטואיציה; השימוש במינונים נמוכים של אנטיביוטיקה בתווך בורליה נועד להרתיע את צמיחתם של חיידקים הגדלים מהר יותר. אם התרבית מחוסנת במבודד בורליה טהור, אין צורך בתוספת אנטיביוטיקה; עם זאת, השימוש בתוספת אנטיביוטיקה חיוני כדי להרתיע צמיחת יתר מחיידקים מתחרים בעת חיסון עם דגימות קליניות או סביבתיות. BSK בינוני ניתן גם להשלים עם 3%-7% ג'לטין. זה נחוץ לצמיחה של מיני בורליה RF21. השימוש ב- BSK או MKP לגידול מיני Borrelia burgdorferi sensu lato תלוי במקור המבודד. שני אמצעי התקשורת תומכים בצמיחה של תרביות מבוססות, אך MKP נמצא כבעל ביצועים טובים יותר בעת זריעת תרביות חדשות עם מספר נמוך של תאי בורליה, כמו שקורה עם מבודדים קליניים או סביבתיים23,24. מדיום זה מאפשר גם את התרבות של B. miyamotoi56,57,58. בסופו של דבר, יש אלמנט של אמנות במדע של גידול מיקרובים חסונים, אבל זה אפשרי בזהירות ובהתמדה.

התרבות של בורליה עומדת בבסיס ההתקדמות במחקר הביו-רפואי. תרבית בורליה אפשרה לקבוע את הגנום המלא והפרוטאום של מיני בורליה רבים, מה שאפשר לחוקרים להתחיל לפענח את האבולוציה והביולוגיה של ספירוצ'טות אלה54,58,59. באופן דומה, גישה לתרבויות טהורות של בורליה מאפשרת להבין את האינטראקציות המורכבות הרבות של בורליה עם הפונדקאי של היונקים ועם וקטור פרוקי הרגליים 61,62,63,64,65, כולל אינטראקציות עם מערכת החיסון של הפונדקאי11,65, מאפשרת להסיק מנגנוני העברה 29,66ומספק את כלי החקירה העיקרי להבחנה בין תאים הניתנים לתרבית, ולכן בהכרח חיים, לבין פסולת תאית, הבחנה שהיא קריטית בחשיפת מנגנוני הפתוגנזה כמו גם משטרי טיפול יעילים 8,67,68,69,70,71., בעוד שתרבית בורליה במבחנה יכולה לקחת מספר שבועות לפני שספירוצ'טות יהיו מספיק בשפע לזיהוי, הגבלת יישומי אבחון קליניים, הבנה בסיסית של ביולוגיה של בורליה, גנומיקה, אינטראקציות מארח-פתוגן ויישומים רבים נוספים הסתמכה על היכולת לבודד בורליה טהורה תרבויות ממבודדים סביבתיים, ולהגביר את המבודדים הללו באמצעות תרבית כדי לייצר מספיק חומר לניתוח ביוכימי וגנטי. יש דחיפה חברתית לתגובה מהירה לזיהומים כדי לתמוך באבחון וטיפול מהירים. עם זאת, המרכיב השני של צורך זה הוא המחקר הביו-רפואי והביולוגי הדרוש לבסיס איתן שעליו ניתן יהיה לטפל כראוי ובהצלחה במחלות ולמנוע אותן. אמנם מאתגר, גידול במבחנה של Borrelia spirochetes אפשרי ויכול לתמוך בצרכים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה חלקית על ידי מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה והקרן הקנדית למחלות ליים (AB ו- VL), מועצת המחקר השבדית (SB, M-LF ו- IN), TAČR GAMA 2 פרויקט - "תמיכה באימות פוטנציאל יישום 2.0 במרכז הביולוגי CAS" (TP01010022) (MG ו- NR), ועל ידי מענק ממשרד הבריאות של הרפובליקה הצ'כית NV19-05-00191 (MG ו- NR). אנו מודים ל-S. Vranjes (2021, מעבדת Rudenko) עבור התמונה באיור 4 ול-J. Thomas-Ebbett (2021, מעבדת לויד) עבור התמונות באיור 5. אנו מודים לכל החוקרים שתרמו לתחום ומתנצלים בפני אלה שלא יכולנו לצטט את עבודתם בשל מגבלות מקום.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item - any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item - any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item - any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item - any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item - any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item - any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item - any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item - any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item - any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item - any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item - any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item - any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important - see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item - any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item - any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item - any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item - any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item - any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item - any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item - any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item - any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top - ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item - any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item - any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item - any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item - any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item - any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item - any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item - any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item - any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item - any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item - any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item - any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item - any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item - any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item - any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item - any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item - any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item - any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item - any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item - any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item - any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item - any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item - any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item - any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item - any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item - any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item - any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item - any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item - any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item - any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item - any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item - any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item - any supplier will do

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aberer, E., Duray, P. H. Morphology of Borrelia burgdorferi: Structural patterns of cultured borreliae in relation to staining methods. Journal of Clinical Microbiology. 29 (4), 764-772 (1991).
  2. Estrada-Peña, A., Cabezas-Cruz, A. Phyloproteomic and functional analyses do not support a split in the genus Borrelia (phylum Spirochaetes). BMC Evolutionary Biology. 19 (1), 54 (2019).
  3. Parte, A. C., Carbasse, J. S., Meier-Kolthoff, J. P., Reimer, L. C., Göker, M. List of prokaryotic names with standing in nomenclature (LPSN) moves to the DSMZ. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (11), 5607-5612 (2020).
  4. List of prokaryotic names with standing in nomenclature Genus Borrelia. , Available from: https://lpsn.dsmz.de/gnus/borrelia (2022).
  5. Margos, G., et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 13 (12), 0208432 (2018).
  6. Gupta, R. S., et al. Distinction between Borrelia and Borreliella is more robustly supported by molecular and phenotypic characteristics than all other neighbouring prokaryotic genera: Response to Margos' et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 14 (12), 0221397 (2019).
  7. Barbour, A. G., Qiu, W. Borreliella. Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. Trujillo, S., Dedysh, P., DeVos, B., Hedlund, P., Kampfer, F. A., Rainey,, Whitman, W. B. , John Wiley & Sons. 1-22 (2019).
  8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Kybicova, K., Vancova, M. Metamorphoses of Lyme disease spirochetes: Phenomenon of Borrelia persisters. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-10 (2019).
  9. Strnad, M., et al. Nanomechanical mechanisms of Lyme disease spirochete motility enhancement in extracellular matrix. Communications Biology. 4 (1), 268 (2021).
  10. Niddam, A. F., et al. Plasma fibronectin stabilizes Borrelia burgdorferi-endothelial interactions under vascular shear stress by a catch-bond mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (17), 3490-3498 (2017).
  11. Anderson, C., Brissette, C. A. The brilliance of Borrelia: Mechanisms of host immune evasion by Lyme disease-causing Spirochetes. Pathogens. 10 (3), 1-17 (2021).
  12. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  13. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 409-454 (2021).
  14. Lopez, J. E., et al. Relapsing fever spirochetes retain infectivity after prolonged in vitro cultivation. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 8 (6), 813-820 (2008).
  15. Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia Burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56 (8), 1831-1836 (1988).
  16. Biškup, U. G., Strle, F., Ružić-Sabljić, E. Loss of plasmids of Borrelia burgdorferi sensu lato during prolonged in vitro cultivation. Plasmid. 66 (1), 1-6 (2011).
  17. Gilmore, R. D., et al. Borrelia miyamotoi strain LB-2001 retains plasmids and infectious phenotype throughout continuous culture passages as evaluated by multiplex PCR. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (1), 101587 (2021).
  18. Krishnavajhala, A., Armstrong, B. A., Lopez, J. E. The impact of in vitro cultivation on the natural life cycle of the tick-borne relapsing fever spirochete Borrelia turicatae. PLoS One. 15 (10), 0239089 (2020).
  19. Kelly, R. Cultivation of Borrelia hermsi. Science. 173 (3995), 443-444 (1971).
  20. Stoenner, H. G. Biology of Borrelia hermsii in Kelly Medium. Applied Microbiology. 28 (4), 540-543 (1974).
  21. Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale Journal of Biology and Medicine. 57 (4), 521-525 (1984).
  22. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  23. Pollack, R. J., Telford, S. R., Spielman, A. Standardization of medium for culturing Lyme disease spirochetes. Journal of Clinical Microbiology. 31 (5), 1251-1255 (1993).
  24. Ružiæ-Sabljiæ, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  25. Ružić-Sabljić, E., et al. Comparison of isolation rate of Borrelia burgdorferi sensu lato in two different culture media, MKP and BSK-H. Clinical Microbiology and Infection. 20 (7), 636-641 (2014).
  26. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  27. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  28. Raffel, S. J., Williamson, B. N., Schwan, T. G., Gherardini, F. C. Colony formation in solid medium by the relapsing fever spirochetes Borrelia hermsii and Borrelia turicatae. Ticks and Tick-borne Diseases. 9 (2), 281-287 (2018).
  29. Margos, G., et al. Long-term in vitro cultivation of Borrelia miyamotoi. Ticks and Tick-borne Diseases. 6 (2), 181-184 (2015).
  30. Middelveen, M. J., et al. Culture and identification of Borrelia spirochetes in human vaginal and seminal secretions. F1000Research. 3, 309 (2014).
  31. Moriarty, T. J., et al. Real-time high resolution 3D imaging of the Lyme disease spirochete adhering to and escaping from the vasculature of a living host. PLoS Pathogens. 4 (6), 1000090 (2008).
  32. Cerar, T., Korva, M., Avšič-Županc, T., Ružić-Sabljić, E. Detection, identification and genotyping of Borrellia spp. In rodents in Slovenia by PCR and culture. BMC Veterinary Research. 11, 188 (2015).
  33. Liebisch, G., Sohns, B., Bautsch, W. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks attached to human skin by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 36 (11), 3355-3358 (1998).
  34. Ružić-Sabljić, E., Strle, F. Comparison of growth of Borrelia afzelii, B. gavinii, and B. burgdorferi sense strict in MKP and BSK-II medium. International Journal of Medical Microbiology. 294 (6), 407-412 (2004).
  35. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Schierz, G. European Borrelia burgdorferi isolated from humans and ticks culture conditions and antibiotic susceptibility. Zentralblatt fur Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene. Series A, Medical Microbiology, Infectious Diseases, Virology, Parasitology. 263 (1-2), 112-118 (1986).
  36. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Reinhardt, S. Culture of Borrelia burgdorferi on six solid media. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (12), 1076-1079 (1991).
  37. Rosa, P. A., Hogan, D. Colony formation by Borrelia burgdorferi in solid medium: clonal analysis of osp locus variants. First International Conference on Tick Borne Pathogens at the Host-Vector Interface: An Agenda for Research. , 95-103 (1992).
  38. Wagemakers, A., Oei, A., Fikrig, M. M., Miellet, W. R., Hovius, J. W. The relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi is cultivable in a modified Kelly-Pettenkofer medium, and is resistant to human complement. Parasites and Vectors. 7 (1), 4-9 (2014).
  39. Oliver, J. H., et al. First isolation and cultivation of Borrelia burgdorferi sensu lato from Missouri. Journal of Clinical Microbiology. 36 (1), 1-5 (1998).
  40. Greenfield, E. A. Myeloma and hybridoma cell counts and viability checks. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), 689-690 (2019).
  41. Baradaran-Dilmaghani, R., Stanek, G. In vitro susceptibility of thirty borrelia strains from various sources against eight antimicrobial chemotherapeutics. Infection. 24 (1), 60-63 (1996).
  42. Ružić-Sabljić, E., Podreka, T., Maraspin, V., Strle, F. Susceptibility of Borrelia afzelii strains to antimicrobial agents. International Journal of Antimicrobial Agents. 25 (6), 474-478 (2005).
  43. Sicklinger, M., Wienecke, R., Neubert, U. In vitro susceptibility testing of four antibiotics against Borrelia burgdorferi: A comparison of results for the three genospecies Borrelia afzelii, Borrelia garinii, and Borrelia burgdorferi sensu stricto. Journal of Clinical Microbiology. 41 (4), 1791-1793 (2003).
  44. Edmondson, D. G., Hu, B., Norris, S. J. Long-term in vitro culture of the syphilis spirochete treponema pallidum subsp. Pallidum. mBio. 9 (3), 01153 (2018).
  45. Wilhelmsson, P., et al. Prevalence and diversity of Borrelia species in ticks that have bitten humans in Sweden. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 4169-4176 (2010).
  46. Toledo, A., et al. Phylogenetic analysis of a virulent Borrelia species isolated from patients with relapsing fever. Journal of Clinical Microbiology. 48 (7), 2484-2489 (2010).
  47. Elbir, H., et al. Genome sequence of the Asiatic species Borrelia persica. Genome Announcements. 2 (1), 01127 (2014).
  48. Sapi, E., et al. Improved culture conditions for the growth and detection of Borrelia from human serum. International Journal of Medical Sciences. 10 (4), 362-376 (2013).
  49. Liveris, D., et al. Quantitative detection of Borrelia burgdorferi in 2-millimeter skin samples of erythema migrans lesions: Correlation of results with clinical and laboratory findings. Journal of Clinical Microbiology. 40 (4), 1249-1253 (2002).
  50. Wormser, G. P., et al. Comparison of the yields of blood cultures using serum or plasma from patients with early Lyme disease. Journal of Clinical Microbiology. 38 (4), 1648-1650 (2000).
  51. Lagal, V., Postic, D., Ruzic-Sabljic, E., Baranton, G. Genetic diversity among Borrelia strains determined by single-strand conformation polymorphism analysis of the ospC gene and its association with invasiveness. Journal of Clinical Microbiology. 41 (11), 5059-5065 (2003).
  52. Lin, Y. P., Diuk-Wasser, M. A., Stevenson, B., Kraiczy, P. Complement evasion contributes to Lyme Borreliae-host associations. Trends in Parasitology. 36 (7), 634-645 (2020).
  53. Real-time PCR: understanding Ct. Application Note Real-time PCR. Thermo Fisher Scientific Inc. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/PG1503-PJ9169-CO019879-Re-brand-Real-Time-PCR-Undertanding-Ct-Value-Americas-FHR.pdf (2016).
  54. Adams, B., Walter, K. S., Diuk-Wasser, M. A. Host specialisation, immune cross-reaction and the composition of communities of co-circulating Borrelia strains. Bulletin of Mathematical Biology. 83 (6), 66 (2021).
  55. Marosevic, D., et al. First insights in the variability of Borrelia recurrentis genomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005865 (2017).
  56. Koetsveld, J., et al. Development and optimization of an in vitro cultivation protocol allows for isolation of Borrelia miyamotoi from patients with hard tick-borne relapsing fever. Clinical Microbiology and Infection. 23 (7), 480-484 (2017).
  57. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  58. Replogle, A. J., et al. Isolation of Borrelia miyamotoi and other Borreliae using a modified BSK medium. Scientific Reports. 11 (1), 1926 (2021).
  59. Stanek, G., Reiter, M. The expanding Lyme Borrelia complex-clinical significance of genomic species. Clinical Microbiology and Infection. 17 (4), 487-493 (2011).
  60. Seifert, S. N., Khatchikian, C. E., Zhou, W., Brisson, D. Evolution and population genomics of the Lyme borreliosis pathogen, Borrelia burgdorferi. Trends in Genetics. 31 (4), 201-207 (2015).
  61. Kurokawa, C., et al. Interactions between Borrelia burgdorferi and ticks. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 587-600 (2020).
  62. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 473-518 (2021).
  63. Wolcott, K. A., Margos, G., Fingerle, V., Becker, N. S. Host association of Borrelia burgdorferi sensu lato: A review. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (5), 101766 (2021).
  64. Thompson, D., Watt, J. A., Brissette, C. A. Host transcriptome response to Borrelia burgdorferi sensu lato. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (2), 101638 (2021).
  65. Chaconas, G., Moriarty, T. J., Skare, J., Hyde, J. A. Live imaging. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 385-408 (2021).
  66. Kerstholt, M., Netea, M. G., Joosten, L. A. B. Borrelia burgdorferi hijacks cellular metabolism of immune cells: Consequences for host defense. Ticks and Tick-borne Diseases. 11 (3), 101386 (2020).
  67. Rudenko, N., Golovchenko, M. Sexual transmission of Lyme Borreliosis? The question that calls for an answer. Tropical Medicine and Infectious Disease. 6 (2), 87 (2021).
  68. Cutler, S. J., et al. Diagnosing Borreliosis. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 17 (1), 2-11 (2017).
  69. Middelveen, M. J., et al. Persistent Borrelia infection in patients with ongoing symptoms of Lyme disease. Healthcare. 6 (2), 33 (2018).
  70. Bernard, Q., Grillon, A., Lenormand, C., Ehret-Sabatier, L., Boulanger, N. Skin Interface, a key player for Borrelia multiplication and persistence in Lyme Borreliosis. Trends in Parasitology. 36 (3), 304-314 (2020).
  71. Bobe, J. R., et al. Recent progress in Lyme disease and remaining challenges. Frontiers in Medicine. 8, 666554 (2021).
  72. Branda, J. A., Steere, A. C. Laboratory diagnosis of lyme borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. 34 (2), 1-45 (2021).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 189
שיטות גידול של Spirochetes מ Borrelia <em>burgdorferi</em> Sensu Lato קומפלקס קדחת התקפית <em>Borrelia</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berthold, A., Faucillion, M. L.,… More

Berthold, A., Faucillion, M. L., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter