Summary
热带爪蟾 是再生研究的理想模型，因为它的许多器官具有显着的再生能力。在这里，我们提出了一种通过顶点切除 构建热带X. tropicalis 心脏损伤模型的方法。
Abstract
众所周知，在成年哺乳动物中，心脏已经失去了再生能力，使心力衰竭成为全球死亡的主要原因之一。先前的研究已经证明了 成年热带爪蟾心脏的再生能力，非洲爪蟾是一种具有二倍体基因组并与哺乳动物有密切进化关系的无尾两栖动物。此外，研究表明，在心室尖切除术后， 热带弧菌的心脏可以再生而不会形成疤痕。因此，这些先前的结果表明， 热带X. tropicalis 是研究成人心脏再生的合适替代脊椎动物模型。本文介绍了成人 热带X. 的心脏再生手术模型。简而言之，青蛙被麻醉和固定;然后，用虹膜切除剪刀做一个小切口，穿透皮肤和心包。对心室施加温和的压力，然后用剪刀切出心室的顶端。心脏损伤和再生在切除后 7-30 天通过组织学确认 （dpr）。该方案建立了成人 热带X. 的根尖切除模型，可用于阐明成人心脏再生的机制。
Introduction
近年来，心力衰竭一直是全球死亡的主要原因。自2000年以来，心力衰竭导致的死亡人数随着时间的推移而增加。2019年，超过900万人死于心肌病，占全球死亡总数的16%1。由于成年哺乳动物心脏再生能力的丧失，在某些情况下，没有足够的心肌细胞来维持心脏的收缩功能，这会影响心脏功能并导致心室重塑异常和心力衰竭2，3，4。事实上，在哺乳动物中，与其他器官（如肝脏、肺、肠、膀胱、骨骼和皮肤）相比，心脏的再生能力最差。随着世界人口老龄化成为全球大趋势，我们面临的心脏病挑战将加剧5。
阐明心脏再生的机制可能对缺血性心脏病的治疗具有重要意义。报告显示，新生小鼠的心脏在顶端切除术后具有再生能力6。然而，这种再生能力在 7 岁7 天后会丧失。研究表明，成年哺乳动物的心脏无法再生，因为它们的心肌细胞增殖能力已经减弱8，9.然而，低等脊椎动物的心脏在受伤后具有强大的再生能力。例如，斑马鱼10、热带爪蟾 11、非洲爪蟾 12、蝾螈 13 和蝾螈14 能够在顶端切除后完全再生。此外，一些低等脊椎动物身体的其他部位也可以经历完全再生，例如蝾螈的四肢和热带爪蛙的尾巴、晶状体和手臂4，15，16。
建立心脏损伤模型是阐明心脏再生机制的第一步，在再生研究中具有重要意义。研究人员已经开发了各种方法来构建心脏损伤模型，包括刺伤、震荡、遗传消融、冷冻损伤和梗塞5，6。
冷冻损伤、心肌梗死（MI）和心尖切除术广泛用于诱发心脏损伤，损伤类型可能对心肌细胞的后续再生产生实质性影响6。根据手术技术的不同，心脏对再生的反应可能会有所不同。冷冻损伤导致大量细胞死亡，并在斑马鱼17的心脏中产生纤维化疤痕，从而创建一个类似于哺乳动物梗塞的模型。根尖切除是通过切掉一部分心室组织来进行的，这已经在斑马鱼10 和 热带 X.11 中完成，而不会造成永久性疤痕。这项研究进行了根尖切除术，这是一种更简单的手术，比冷冻损伤需要更少的手术器械。使用谱系追踪分析，之前的一项研究表明，心脏再生与小鼠6 和斑马鱼18心脏中预先存在的心肌细胞的增殖有关，但没有关于两栖动物的报道。因此， 热带X. tropicalis 的顶端切除模型在阐明再生反应的机制方面起着重要作用。
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Protocol
所有与 热带X. tropicalis 相关的实验方案均由暨南大学动物护理委员会批准。
1. 手术
- 术前准备：准备好眼科剪刀、眼科钳、针钳、吸收球、滤纸和手术缝合线/针头，以便在 热带X.的心脏中进行心尖切除。有关详细信息，请参阅 材料表 。使用前，通过高压灭菌对所有手术器械进行消毒，并准备足量的冰以备将来使用。
- 将成年 热带X. tropicalis 置于室温下500mL三卡因溶液（1mg / mL）中4分钟19，然后将其放在手术台上的冰表面上，以确保青蛙在手术过程中不会醒来。
注意：整个过程需要5-10分钟;麻醉时间不宜过长，否则 热带X. 在手术后可能无法醒来。 - 开 胸 术
- 将麻醉的 热带X. tropicalis 腹部向上放置，并用预先浸泡在蒸馏水中的纱布覆盖青蛙的腹部，以避免在手术过程中动物皮肤干燥。
- 用镊子轻轻按压胸部，找到与下前肢平行的胸部中心，用眼科剪刀提起皮肤，轻轻做一个~1厘米的小切口。使用眼科剪刀，捡起皮肤下的肌肉层，并在胸部中央肌肉上形成伤口。由于心脏位于伤口部位的上部位置，用眼科镊子轻轻按压胸部，将心脏从伤口中挤出。
注意：由于 热带X. tropicalis 的皮肤可以产生抗菌肽，因此没有必要在 热带X.任何消毒剂都会损害 热带X.
- 心室尖切除术
- 用镊子轻轻夹住心包，并在心脏顶点附近用眼科剪刀轻轻折断。等待心包因收缩期血液泵送而脱落（图1A，B）。
- 用非惯用手用镊子握住心脏尖端，根据心肌收缩节律稍微抬起心脏。当心脏收缩以通过血管再循环血液时，迅速切断心脏的顶点（~14%的心室）（图1C）。
- 为确保心尖切除量约为整个心脏的 14%，请分析心脏重量 （HW） 和表面积（有或没有切除术 20）。使用镊子和吸收球将心脏放入胸部。
注意：不要用镊子直接按压心脏;否则，心脏的其他部位将被刺穿。
- 用4-0非吸收性非丝绸手术线缝合皮肤（图1D）。注意避免缝合到肌肉层，以防止术后死亡。等待皮肤伤口在手术后 1 周内自然愈合。
- 在假手术组中，进行开胸术，打开心包并缝合，而不进行心尖切除术。
2. 手术恢复
- 将术后 热带X. tropicalis 腹部朝上置于含有少量去离子水的培养皿中（不要完全淹没动物）。等待 热带X. tropicalis 在~10分钟内醒来。
- 恢复意识后，观察动物的活动性和活动性，以及活动期间的伤口缝合线。将恢复平衡的青蛙转移到装满纯净水的容器中进行栽培。每天用纯净水代替水，避免伤口感染。
注意：通过这些措施，存活率可以达到~90%。手术期间长时间麻醉和出血过多都会导致死亡，这通常发生在手术当天。
3.心脏损伤后修复状况的检测
- 在手术后的多个时间点收集 热带X. tropicalis 的心脏。
- 用三卡因麻醉热带 X. 后，打开腹部，用镊子取出其他内脏和组织，以找到心脏的位置。
注意：由于心尖切除术，在修复过程中，心脏可能会与其他组织和器官一起发育。有时，它粘在肌肉壁上，不易分离，因此在收集过程中需要小心处理。 - 找到心脏后，用镊子轻轻地从心脏上撕下其他器官。轻轻剥去心脏周围的其他组织，露出心脏。用镊子轻轻提起心脏，然后用剪刀剪掉。立即将心脏放入PBS中以去除任何残留的血液，并用立体镜拍照以进行记录（图2）。
- 用三卡因麻醉热带 X. 后，打开腹部，用镊子取出其他内脏和组织，以找到心脏的位置。
- 梯度脱水
- 用滤纸吸干心脏以干燥多余的PBS残留物，并将它们放入24孔细胞培养皿中。使用1-2毫升4%多聚甲醛将心脏组织固定过夜。第二天，进行乙醇脱水。首先，使用70%乙醇过夜，然后使用80%乙醇，90%乙醇和100%乙醇进行梯度脱水（每次1小时）。重复使用100%乙醇三次。
- 石蜡包埋
- 用二甲苯处理脱水的心脏组织6-8分钟。将二甲苯处理的组织置于65°C下充满石蜡的玻璃容器中2-3小时。
注意： 必须避免气泡，因为它们在嵌入过程中会影响切片。
- 用二甲苯处理脱水的心脏组织6-8分钟。将二甲苯处理的组织置于65°C下充满石蜡的玻璃容器中2-3小时。
- 将嵌入的组织在-20°C冷冻1小时，并将其切片。
- 切片心脏后，对切片11进行标准的苏木精和伊红（H&E）以及Masson的三色染色技术。
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Representative Results
在 0 dpr、7 dpr、14 dpr 和 30 dpr 收集心脏。形态学分析显示，心脏损伤引起的血凝块在30 dpr时消失（图2）。同时，切除组30 dpr时心脏外观与假手术组心脏外观相似;没有明显的伤口（图2）。根尖切除后，形成血凝块并密封心室中的伤口，如H&E（图3）和Masson的三色染色（图4）所观察到的那样。在14 dpr内，凝块逐渐消失并被纤维蛋白取代（图4）。从14 dpr到30 dpr，心肌逐渐取代纤维蛋白并修复受损的心室尖（图4）。组织学分析显示，在30 dpr时，假心脏和切除心脏之间没有差异（图3 和 图4）。形态学和组织学分析表明，成虫热带 乳杆菌 可在30 dpr时修复和再生受损的心室尖。
图1：外科手术 。 （A）被心包覆盖的暴露心脏的代表性图像。（B）心脏处于收缩期的代表性图像，在此期间心包被剥离;虚线表示心脏顶端切除的部位。（C）心脏顶端切除术的代表形象。（四）术后皮肤缝合线的代表性图像。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：0 dpr 至 30 dpr 热带 X. 热带心脏的形态学分析。 （A） 0 dpr 时假切除组（左）和根尖切除组（右）的心脏代表性图像，切除组中心脏顶点明显缺失。（乙，丙）7-14 dpr时假手术组（左）与切除组（右）心脏的代表性图像，7 dpr时切除组的心脏中出现许多血凝块。在 14 dpr 时，在心尖切除部位可见明显的再生，但心脏顶点的边缘不均匀。（D） 假心脏（左）与切除组（右）在 30 dpr 的代表性图像;切除心脏的顶点几乎完全再生。比例尺 = 1 毫米。缩写：dpr = 切除后的天数。请点击此处查看此图的大图。
图 3：热带爪蟾心脏的组织学分析，从 0 dpr 到 30 dpr。使用假手术和切除组的心脏在0 dpr至30 dpr下进行H&E染色的代表性图像。（A）使用假手术组的心脏进行H&E染色的代表性图像，虚线表示近似截肢平面。（B）使用0 dpr切除组的心脏进行H&E染色的代表性图像。（中欧）使用切除组的心脏在7-30 dpr处进行H&E染色的代表性图像，在7 dpr处伤口内积聚了大量红细胞（箭头）。在 14 dpr（箭头）的切除部位出现了大量纤维蛋白。心脏在 30 dpr 时完全再生，没有疤痕。比例尺 = 500 μm。缩写：dpr = 切除后的天数。请点击此处查看此图的大图。
图 4：0 dpr 至 30 dpr 热带弧菌心脏的心肌纤维化分析。 马森在 0 dpr 至 30 dpr 时对假和切除组的心脏进行染色的代表性图像。（A）马森从假组中染色心脏的代表性图像，虚线表示近似截肢平面。（B） Masson 在 0 dpr 时对切除组心脏进行染色的代表性图像。（中欧）Masson在7-30 dpr时对切除组心脏进行染色的代表性图像，在7 dpr时伤口内积聚了大量红细胞（箭头）。在 14 dpr（箭头）的切除部位出现了大量纤维蛋白。心脏在 30 dpr 时完全再生，没有疤痕。比例尺 = 500 μm。缩写：dpr = 切除后的天数。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
根尖切除术涉及心脏心尖的手术截肢，已在斑马鱼和小鼠中描述6，18;然而， 这在热带X.该报告描述了一个可信的心脏损伤模型，并证明 成年热带X. tropicalis 的心脏可以在根尖切除后完全再生而不会形成疤痕。但是，有些缺点需要改进，某些细节需要注意。
虽然心尖切除术可以建立心脏损伤模型，但由于青蛙的多样性，具有不同的心脏大小，确保心脏切除的程度相同具有挑战性。为了确保切除具有相同大小顶点的心脏，有必要选择相同大小的青蛙，并且操作人员必须在实验前进行广泛的练习。
其次，准确快速地定位和暴露心脏的能力对于手术的成功至关重要，因为寻找心脏的过程可能导致邻近血管穿刺并导致出血，从而阻碍手术的进展甚至导致失败。麻醉时间不应太短或太长。如果时间太短，青蛙可能会在手术完成之前醒来，如果这个过程太长，很可能导致青蛙死亡。如协议第2-5节所述，缝合必须谨慎进行。为了确保青蛙的心尖切除量与整个心脏的比值大致相同，分析心脏重量（HW）和表面积（有或没有切除）20，并切除一小部分心尖以确保腔室暴露6。
冷冻损伤、心肌梗死和根尖切除术是诱导斑马鱼和小鼠心脏损伤的三种最广泛使用的方法6，18，21。本文的局限性在于仅使用了第三种方法，这意味着这项工作没有提供有关其他两种方法受伤后不同再生反应的任何信息6。冷冻损伤导致~20%的心室壁中大量细胞死亡，类似于哺乳动物梗死21。MI，也称为冠状动脉闭塞，与小鼠6的根尖切除术相比，在热带X.中具有更高的存活率，但在热带X.中更难实现，因为热带爪蛙的心脏比小鼠的心脏小。本研究建立的热带弧线尖切除术方法操作简单，术后存活率高。
本报告中开发的顶端切除术将是研究 热带X. tropicalis心脏再生分子机制的重要方法。先前的一项研究还表明，Fosl1对于根尖切除术后 热带X. tropicalis 的心脏再生是必不可少的20。该热带 苜蓿 心尖切除损伤模型可用于了解心脏再生背后的分子机制，以促进人类心脏再生相关基因和分子机制的研究。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
这项工作得到了国家重点研发计划（2016YFE0204700），国家自然科学基金（82070257，81770240）和暨南大学再生医学教育部重点实验室研究资助（ZSYXM202004和ZSYXM202104）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | GHTECH | 64-19-7-500ml | |
| Acid Alcohol Fast Differentiation Solution | Beyotime | C0163M | |
| Acid Fuchsin | aladdin | A104916 | |
| Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution | Servicebio | G1001-500ML | |
| BioReagent | Beyotime | ST2600-100g | |
| Ethanol absolute | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-0.5L | |
| Hematoxylin Stain Solution | Servicebio | G1004-500ML | |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | |
| Operating Scissors | Prosperich | HC-JZ-YK-Z-10cm | |
| Paraffins | Leica | 39601095 | |
| Para-formaldehyde Fixative | Servicebio | G1101-500ML | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) powder | Servicebio | G0002-2L | |
| Phosphomolybdic acid hydrate | Macklin | P815551 | |
| Stereo microscope | Leica | ||
| surgical forceps | ChangZhou | zfq-11-btjw | |
| Surgical Suture | HUAYON | 18-5140 | |
| Tricaine | Macklin | ||
| Xylene | Guangzhou Chemical Reagent Factory | IC02-AR-0.5L |
References
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