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Medicine

성인 Xenopus tropicalis 심장의 정점 절제 모델

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64719
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Regenerative Medicine of Ministry of Education, Department of Developmental & Regenerative Biology, Jinan University
* These authors contributed equally

Summary

Xenopus tropicalis 는 많은 기관이 놀라운 재생 능력을 가지고 있기 때문에 재생 연구에 이상적인 모델입니다. 여기에서는 정점 절제술을 통해 X. tropicalis 에서 심장 손상 모델을 구성하는 방법을 제시합니다.

Abstract

성인 포유류에서 심장은 재생 능력을 상실하여 심부전이 전 세계적으로 주요 사망 원인 중 하나가 된 것으로 알려져 있습니다. 이전 연구에서는 이배체 게놈과 포유류와 밀접한 진화 관계를 가진 아누란 양서류인 성인 Xenopus tropicalis의 심장 재생 능력을 입증했습니다. 또한 연구에 따르면 심실 정점 절제술 후 심장은 흉터 없이 재생될 수 있습니다. 결과적으로, 이러한 이전 결과는 X. tropicalis 가 성인 심장 재생 연구를 위한 적절한 대체 척추동물 모델임을 시사합니다. 성인 X. tropicalis 에서의 심장 재생의 외과적 모델이 본원에 제시된다. 간단히 말해서, 개구리는 마취되고 고정되었습니다. 그런 다음 홍채 절제술 가위로 작은 절개를 만들어 피부와 심낭을 관통했습니다. 심실에 부드러운 압력을 가한 다음 심실의 정점을 가위로 잘라냈습니다. 심장 손상 및 재생은 절제술 후 7-30일(DPR)에 조직학에 의해 확인되었습니다. 이 프로토콜은 성인 X. tropicalis 에서 정점 절제 모델을 확립했으며, 이는 성인 심장 재생의 메커니즘을 설명하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

심부전은 최근 몇 년 동안 전 세계적으로 사망의 주요 원인이었습니다. 2000 년 이후 심부전으로 인한 사망자 수는 시간이 지남에 따라 증가하고 있습니다. 2019년에 900만 명 이상이 심근병증으로 사망했으며, 이는 전 세계 총 사망자 수의 16%를 차지했습니다1. 성인 포유류에서 심장의 재생 능력 상실로 인해 경우에 따라 심장의 수축 기능을 유지하기에 충분한 심근 세포가 없어 심장 기능에 영향을 미치고 비정상적인 심실 리모델링 및 심부전을 유발합니다 2,3,4. 실제로 포유류에서 심장은 간, 폐, 내장, 방광, 뼈 및 피부와 같은 다른 기관에 비해 재생 능력이 가장 낮습니다. 세계 인구의 고령화가 세계적인 메가트렌드가 되면서 우리가 직면한 심장병 문제는 더욱 심화될 것입니다5.

심장 재생의 메커니즘을 설명하는 것은 허혈성 심장 질환 치료에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다. 보고서에 따르면 신생아 생쥐의 심장은 정점 절제술 후 재생 능력이 있습니다6. 그럼에도 불구하고 이 재생 능력은 7세가 지나면 사라집니다7. 연구에 따르면 성인 포유류의 심장은 심근 세포 증식 능력이 감소했기 때문에 재생할 수 없습니다 8,9. 그러나 하부 척추 동물의 심장은 부상 후 강력한 재생 능력을 가지고 있습니다. 예를 들어, 제브라피쉬 10, X. 트로피칼리스 11, 제노푸스 레비스12, 뉴트 13, 액솔로틀 14는 정점 절제 후 완전한 재생이 가능합니다. 또한, 일부 하등 척추동물의 몸의 다른 부분도 영원의 팔다리와 열대 발톱 개구리의 꼬리, 렌즈 및 팔과 같이 완전한 재생을 겪을 수 있습니다 4,15,16.

심장 손상 모델을 확립하는 것은 심장 재생의 기본 메커니즘을 설명하는 첫 번째 단계이며 재생 연구에서 큰 의미가 있습니다. 연구자들은 칼에 찔리기, contusing, 유전자 절제, 냉동 손상 및 경색을 포함하여 심장 손상 모델을 구축하기 위한 다양한 방법을 개발했습니다 5,6.

냉동손상, 심근경색증(myocardial infarction, MI) 및 정점 절제술(apex resectiontion)은 심장 손상을 유발하는 데 널리 사용되며, 이러한 유형의 손상은 다음과 같은 심근세포 재생에 상당한 영향을 미칠 수 있다6. 수술 기술에 따라 재생에 대한 심장의 반응이 다를 수 있습니다. 냉동 손상은 대규모 세포 사멸을 일으키고 제브라피쉬17의 심장에 섬유성 흉터를 생성하여 포유류 경색과 유사한 모델을 만듭니다. 정점 절제술은 영구적인 흉터를 남기지 않고 제브라피쉬10 과 X. tropicalis11에서 수행된 심실 조직의 일부를 절단하여 수행됩니다. 이 연구는 치근단 절제술을 수행했는데, 이는 수술이 간단하고 냉동 손상보다 수술 도구가 덜 필요합니다. 혈통 추적 분석을 사용하여, 이전 연구에서는 심장 재생이 생쥐6 와 제브라피쉬18의 심장에 존재하는 심근 세포의 증식과 관련이 있음을 입증했지만, 양서류에 대한 보고는 존재하지 않는다. 따라서 X. tropicalis 의 정점 절제 모델은 재생 반응의 기본 메커니즘을 설명하는 데 중요한 역할을 합니다.

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Protocol

X. tropicalis와 관련된 모든 실험 프로토콜은 Jinan University Animal Care Committee의 승인을 받았습니다.

1. 수술

  1. 수술 전 준비: X. tropicalis의 심장에 정점 절제술을 위해 안과용 가위, 안과용 겸자, 바늘 집게, 흡수성 볼, 여과지 및 수술용 봉합사/바늘을 준비하십시오. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 사용하기 전에 모든 수술 기구를 고압증기멸균으로 소독하고 나중에 사용할 수 있도록 적절한 양의 얼음을 준비하십시오.
  2. 성인 X. tropicalis 를 트리카인으로 마취하여 실온에서 500mL의 트리카인 용액(1mg/mL)에 4분19초 동안 넣은 다음 수술대 위의 얼음 표면에 올려 개구리가 수술 과정에서 깨어나지 않도록 합니다.
    주의 : 전체 절차는 5-10분이 소요됩니다. 마취 시간이 너무 길어서는 안되며, 그렇지 않으면 X. tropicalis가 수술 후 깨어나지 못할 수도 있습니다.
  3. 개흉술
    1. 마취 된 X. tropicalis 복부를 위로 올려 놓고 개구리의 복부를 증류수에 미리 담근 거즈로 덮어 수술 중 동물의 피부가 건조하지 않도록하십시오.
    2. 집게로 가슴을 부드럽게 누르고, 가슴의 중심을 아래 앞다리와 평행하게 찾고, 안과 용 가위로 피부를 들어 올리고, ~ 1cm의 작은 절개를합니다. 안과 용 가위를 사용하여 피부 아래의 근육층을 집어 들고 중앙 가슴 근육에 상처를 만듭니다. 심장이 상처 부위의 위쪽에 위치하므로 안과용 집게로 가슴을 부드럽게 눌러 상처에서 심장을 짜냅니다.
      주의 : X. tropicalis의 피부는 항균 펩타이드를 생성 할 수 있으므로 X. tropicalis의 수술 부위에 기존의 소독 절차를 사용할 필요가 없습니다. 모든 소독제는 X. tropicalis의 피부를 손상시킵니다.
  4. 심실 정점 절제술
    1. 집게로 심낭을 부드럽게 조이고 심장 정점 근처의 안과 가위를 사용하여 부드럽게 부러 뜨립니다. 수축기 혈액 펌핑으로 인해 심낭이 빠질 때까지 기다리십시오(그림 1A, B).
    2. 주로 사용하지 않는 손에 집게로 심장의 끝을 잡고 심장 수축 리듬에 따라 심장을 약간 들어 올립니다. 심장이 수축하여 혈관을 통해 혈액을 재순환시키면 심장의 정점(심실의 ~14%)을 빠르게 차단합니다(그림 1C).
    3. 정점 절제의 양이 전체 심장의 약 14%가 되도록 하려면, 절제술 유무에 관계없이 심장 무게(HW)와 표면적을 분석한다20. 집게와 흡수성 볼을 사용하여 심장을 가슴에 넣습니다.
      알림: 집게로 심장을 직접 누르지 마십시오. 그렇지 않으면 심장의 다른 부분에 구멍이 뚫립니다.
  5. 4-0 비흡수성 비실크 수술실 봉합사로 피부를 봉합합니다(그림 1D). 수술 후 사망을 예방하기 위해 근육층에 봉합하지 않도록 주의하십시오. 수술 후 1주일 이내에 피부 상처가 자연적으로 치유될 때까지 기다리십시오.
  6. 가짜 수술 그룹에서는 정점 절제술을 시행하지 않고 개흉술을 시행하고 심낭을 열고 봉합합니다.

2. 외과적 회복

  1. 수술 후 X. tropicalis 를 복부가 위로 향하게 하여 소량의 탈이온수가 들어 있는 페트리 접시에 놓습니다(동물을 완전히 범람시키지 마십시오). X. tropicalis가 ~10분 이내에 깨어날 때까지 기다리십시오.
  2. 의식을 회복하면 동물의 이동성과 활동뿐만 아니라 활동 중 상처 봉합사를 관찰하십시오. 균형을 되찾은 개구리를 재배를 위해 순수한 물로 채워진 용기에 옮깁니다. 상처 감염을 피하기 위해 매일 물을 순수한 물로 교체하십시오.
    참고: 이러한 조치를 통해 생존율은 ~90%에 도달할 수 있습니다. 장기간의 마취와 수술 중 과도한 출혈은 모두 사망으로 이어지며, 이는 일반적으로 수술 당일에 발생합니다.

3. 심장 손상 후 수리 상태 감지

  1. 수술 후 여러 시점에서 X. tropicalis 의 심장을 수집합니다.
    1. 트리카인으로 X. tropicalis 를 마취 한 후 복부를 열고 집게를 사용하여 다른 내부 장기와 조직을 제거하여 심장의 위치를 찾습니다.
      참고: 정점 절제술로 인해 심장은 복구 과정에서 다른 조직 및 기관과 함께 발달할 가능성이 있습니다. 때로는 근육 벽에 달라 붙어 분리가 쉽지 않으므로 수집 중에 조심스럽게 다루어야합니다.
    2. 심장을 찾은 후 집게를 사용하여 심장에서 다른 장기를 부드럽게 찢습니다. 심장을 둘러싼 다른 조직을 부드럽게 떼어내어 심장을 노출시킵니다. 집게를 사용하여 심장을 부드럽게 들어 올리고 가위로 잘라냅니다. 심장을 즉시 PBS에 넣어 남아 있는 혈액을 제거하고 문서화를 위해 입체경으로 사진을 찍습니다(그림 2).
  2. 기울기 탈수
    1. 하트를 여과지로 블롯하여 과량의 PBS 잔류물을 건조시키고, 이들을 24-웰 세포 배양 접시에 넣는다. 4 % 파라 포름 알데히드 1-2 ml를 사용하여 밤새 심장 조직을 고정하십시오. 다음날 에탄올 탈수를 수행하십시오. 먼저 70% 에탄올을 하룻밤 동안 사용한 다음 80% 에탄올, 90% 에탄올 및 100% 에탄올을 기울기 탈수(매번 1시간)에 사용합니다. 100 % 에탄올 사용을 세 번 반복하십시오.
  3. 파라핀 임베딩
    1. 탈수 된 심장 조직을 크실렌으로 6-8 분 동안 치료하십시오. 자일렌 처리된 조직을 파라핀 왁스로 채워진 유리 용기에 넣고 65°C에서 2-3시간 동안 처리한다.
      알림: 기포는 임베딩 과정에서 섹션에 영향을 미치므로 피하는 것이 중요합니다.
  4. 매립된 조직을 -20°C에서 1시간 동안 동결하고 절개합니다.
  5. 심장을 절편한 후, 섹션11에 대해 표준 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 및 Masson의 삼색 염색 기술을 수행합니다.

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Representative Results

하트는 0 dpr, 7 dpr, 14 dpr 및 30 dpr에서 수집되었습니다. 형태학적 분석 결과 심장 손상으로 인한 혈전이 30dpr에서 사라진 것으로 나타났습니다(그림 2). 동시에, 절제술 그룹에서 30 dpr에서 심장의 모습은 가짜 수술 그룹의 심장과 비슷했습니다. 뚜렷한 상처는 없었다(그림 2). 정점 절제 후, 혈전이 형성되어 H & E (그림 3) 및 Masson 삼색 염색 (그림 4)에 의해 관찰 된 바와 같이 심실의 상처를 봉합했다. 14dpr 이내에 혈전이 점차 사라지고 피브린으로 대체되었습니다(그림 4). 14dpr에서 30dpr까지 심근은 점진적으로 피브린을 대체하고 손상된 심실 정점을 복구했습니다(그림 4). 조직학적 분석은 30dpr에서 가짜 심장과 절제된 심장 사이에 차이가 없음을 보여주었습니다(그림 3 및 그림 4). 이 형태학적 및 조직학적 분석은 성인 X. tropicalis가 손상된 심실 정점을 30dpr까지 복구하고 재생할 수 있음을 보여주었습니다.

Figure 1
그림 1: 수술 절차 . (A) 심낭으로 덮인 노출된 심장의 대표 이미지. (B) 심낭이 벗겨지는 수축기 단계의 심장의 대표 이미지; 점선은 심장의 정점 절제술 부위를 나타냅니다. (C) 심장의 정점 절제술의 대표 이미지. (D) 수술 후 피부 봉합사의 대표 이미지. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 0dpr에서 30dpr까지의 X. tropicalis 심장의 형태학적 분석 . (A) 0dpr에서 가짜(왼쪽) 및 정점 절제군(오른쪽)의 심장의 대표 이미지, 절제군에는 심장의 정점이 현저히 없음. (나,씨) 7-14 dpr에서 가짜(왼쪽) 대 절제군(오른쪽)의 심장의 대표 이미지, 7dpr에서 절제군의 심장에 많은 혈전이 나타납니다. 14dpr에서 정점 절제 부위에서 상당한 재생이 보이지만 심장 정점의 가장자리는 고르지 않습니다. (D) 30dpr에서 가짜(왼쪽) 대 절제술 그룹(오른쪽)의 심장의 대표 이미지; 절제된 심장의 정점은 거의 완전히 재생되었습니다. 스케일 바 = 1mm. 약어: dpr = 절제 후 일수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 0 dpr에서 30 dpr까지의 Xenopus tropicalis 심장의 조직학적 분석. 0 dpr에서 30 dpr까지 가짜 및 절제술 그룹의 심장을 사용한 H & E 염색의 대표 이미지. (A) 가짜 그룹의 심장을 사용한 H & E 염색의 대표 이미지, 대략적인 절단 평면을 나타내는 점선. (B) 0 dpr에서 절제군의 심장을 이용한 H&E 염색의 대표 이미지. (C-E) 7-30 dpr에서 절제군의 심장을 사용한 H & E 염색의 대표 이미지로, 7 dpr (화살표)에서 상처 내에 많은 양의 적혈구가 축적되었다. 피브린 덩어리가 14 dpr (화살촉)의 절제 부위에 나타났습니다. 심장은 30dpr에서 흉터 없이 완전히 재생되었습니다. 스케일 바 = 500 μm. 약어: dpr = 절제 후 일수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4 : 0 dpr에서 30 dpr까지 X. tropicalis 심장의 심근 섬유증 분석. 0 dpr에서 30 dpr에서 가짜 및 절제술 그룹에서 Masson의 심장 염색의 대표적인 이미지. (A) 가짜 그룹에서 Masson의 심장 염색의 대표 이미지, 대략적인 절단 평면을 나타내는 점선. (B) 0dpr에서 절제군에서 Masson의 심장 염색의 대표 이미지. (C-E) 7-30 dpr에서 절제군에서 Masson의 심장 염색의 대표적인 이미지, 7 dpr에서 상처 내에 많은 양의 적혈구가 축적되었습니다(화살표). 피브린 덩어리가 14 dpr (화살촉)의 절제 부위에 나타났습니다. 심장은 30dpr에서 흉터 없이 완전히 재생되었습니다. 스케일 바 = 500 μm. 약어: dpr = 절제 후 일수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

심장 정점의 외과적 절단을 포함하는 정점 절제술은 제브라피쉬와 생쥐 6,18; 그러나 이것은 X. tropicalis에 설명되어 있지 않습니다. 이 보고서는 심장 손상의 신뢰할 수 있는 모델을 설명하고 성인 X. tropicalis의 심장이 정점 절제 후 흉터 없이 완전히 재생될 수 있음을 보여줍니다. 그러나 몇 가지 단점을 개선해야하며 특정 세부 사항은주의가 필요합니다.

정점 절제술은 심장 손상 모델을 확립할 수 있지만 심장 크기가 다른 개구리의 다양성으로 인해 동일한 범위의 심장 절제를 보장하는 것은 어렵습니다. 같은 크기의 정점을 가진 심장을 절제하기 위해서는 같은 크기의 개구리를 선택해야 하며, 작업자는 실험 전에 광범위하게 연습해야 합니다.

둘째, 심장을 찾는 과정에서 인접한 혈관에 구멍이 뚫려 출혈을 일으켜 시술의 진행을 방해하거나 심지어 실패를 유발할 수 있기 때문에 심장을 정확하고 신속하게 찾아 노출시키는 능력은 시술의 성공에 매우 중요합니다. 마취 기간은 너무 짧거나 길어서는 안됩니다. 너무 짧으면 수술이 완료되기 전에 개구리가 깨어날 수 있으며, 이 과정이 너무 길면 개구리가 죽을 가능성이 높습니다. 프로토콜 섹션 2-5에서 언급했듯이 봉합은 신중하게 이루어져야 합니다. 전체 심장에 대한 정점 절제의 양이 개구리에 걸쳐 거의 동일하도록 하기 위해, 심장 무게(HW)와 절제술 유무에 관계없이 표면적을 분석하고(20), 심장 정점의 작은 부분을 절제하여 챔버 노출을 보장한다6.

냉동 손상, MI 및 정점 절제술은 제브라피쉬와 생쥐에서 심장 손상을 유도하는 데 가장 널리 사용되는 세 가지 방법입니다 6,18,21. 이 글의 한계는 세 번째 방법만 사용되었다는 것인데, 이는 이 작업이 다른두 가지 방법6으로 부상 후 다른 재생 반응에 대한 정보를 제공하지 않는다는 것을 의미한다. 냉동손상은 포유류 경색과 유사하게 심실 벽의 ~20%에 있는 많은 수의 세포가 죽는 결과를 낳는다21. 관상동맥 폐색이라고도 불리는 MI는 생쥐의 정점 절제술에 비해 X. tropicalis에서 생존율이 더 높지만6 열대 발톱 개구리의 심장이 생쥐의 심장보다 작기 때문에 X. tropicalis에서는 달성하기가 더 어렵습니다. 본 연구에서 확립된 X. tropicalis 치근단 절제술은 수행이 간단하고 수술 후 생존율이 높습니다.

이 보고서에서 개발된 정점 절제술은 X. tropicalis의 심장에서 재생의 분자 메커니즘을 조사하는 중요한 방법이 될 것입니다. 이전 연구에서는 Fosl1이 정점 절제술 후 X. tropicalis 의 심장 재생에 없어서는 안될 필수 요소임을 입증했습니다20. X. tropicalis 의 이 정점 절제 심장 손상 모델은 심장 재생의 기초가 되는 분자 메커니즘에 대해 더 많이 학습하여 인간 심장 재생과 관련된 유전자 및 분자 메커니즘의 연구를 촉진하는 데 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2016YFE0204700), 중국 국립 자연 과학 재단(82070257, 81770240) 및 중국 제남대학교 교육부 재생 의학 핵심 연구소(ZSYXM202004 및 ZSYXM202104)의 연구 보조금으로 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid GHTECH 64-19-7-500ml
Acid Alcohol Fast Differentiation Solution Beyotime C0163M
Acid Fuchsin aladdin A104916
Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution Servicebio G1001-500ML
BioReagent Beyotime ST2600-100g
Ethanol absolute Guangzhou Chemical Reagent Factory HB15-GR-0.5L
Hematoxylin Stain Solution Servicebio G1004-500ML
Neutral balsam Solarbio G8590
Operating Scissors Prosperich HC-JZ-YK-Z-10cm
Paraffins Leica 39601095
Para-formaldehyde Fixative Servicebio G1101-500ML
Phosphate Buffered Saline (PBS) powder Servicebio G0002-2L
Phosphomolybdic acid hydrate Macklin P815551
Stereo microscope Leica
surgical forceps ChangZhou zfq-11-btjw
Surgical Suture HUAYON 18-5140
Tricaine Macklin
Xylene Guangzhou Chemical Reagent Factory IC02-AR-0.5L

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References

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He, S. Y., Zhou, Y. M., Wen, N., Meng, K., Cai, D. Q., Qi, X. F. An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart. J. Vis. Exp. (189), e64719, doi:10.3791/64719 (2022).

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