Summary
Xenopus tropicalis er en ideell modell for regenerativ forskning, da mange av organene har en bemerkelsesverdig regenerativ kapasitet. Her presenterer vi en metode for å konstruere en hjerteskademodell i X. tropicalis via apexreseksjon.
Abstract
Det er kjent at hos voksne pattedyr har hjertet mistet sin regenerative kapasitet, noe som gjør hjertesvikt til en av de ledende dødsårsakene over hele verden. Tidligere forskning har vist den regenerative evnen til hjertet til den voksne Xenopus tropicalis, en anuran amfibie med et diploid genom og et nært evolusjonært forhold til pattedyr. I tillegg har studier vist at etter ventrikulær apexreseksjon kan hjertet regenerere uten arrdannelse i X. tropicalis. Følgelig antyder disse tidligere resultatene at X. tropicalis er en passende alternativ virveldyrmodell for studiet av voksen hjerteregenerering. En kirurgisk modell for hjerteregenerering hos den voksne X. tropicalis presenteres her. Kort fortalt ble froskene bedøvet og fikset; Deretter ble det gjort et lite snitt med iridektomi saks, penetrerende hud og perikardium. Forsiktig trykk ble påført ventrikkelen, og toppen av ventrikkelen ble deretter kuttet ut med saks. Hjerteskade og regenerering ble bekreftet med histologi 7-30 dager etter reseksjon (DPR). Denne protokollen etablerte en apikal reseksjonsmodell hos voksne X. tropicalis, som kan brukes til å belyse mekanismene for regenerering av voksne hjerter.
Introduction
Hjertesvikt har vært en ledende årsak til dødelighet over hele verden de siste årene. Siden 2000 har antall dødsfall på grunn av hjertesvikt økt over tid. Mer enn 9 millioner mennesker døde av kardiomyopati i 2019, som utgjorde 16% av det totale antallet dødeligheter globalt1. På grunn av tapet av hjertets regenerative kapasitet hos voksne pattedyr, er det i noen tilfeller ikke nok kardiomyocytter til å opprettholde sammentrekningsfunksjonene i hjertet, noe som påvirker hjertefunksjonen og bidrar til unormal ventrikulær remodellering og hjertesvikt 2,3,4. Faktisk, hos pattedyr, har hjertet den dårligste regenerative kapasiteten sammenlignet med de andre organene, som lever, lunger, tarmer, blære, bein og hud. Etter hvert som aldringen av verdens befolkning blir en global megatrend, vil utfordringene vi står overfor med hjertesykdom intensiveres5.
Å belyse mekanismene for hjerteregenerering kan ha betydelige implikasjoner for terapier for iskemisk hjertesykdom. Rapporter har avslørt at hjertene til nyfødte mus har en regenerativ kapasitet etter apex-reseksjon6. Likevel går denne regenerative kapasiteten tapt etter 7 dagers alder7. Studier har vist at voksne pattedyrhjerter ikke er i stand til å regenerere fordi deres kapasitet for kardiomyocyttproliferasjon har redusert 8,9. Imidlertid har hjertene til lavere vertebrater en kraftig regenerativ kapasitet etter skade. For eksempel er sebrafisk10, X. tropicalis11, Xenopus laevis 12, newt13 og axolotl 14 i stand til fullstendig regenerering etter apexreseksjon. I tillegg kan de andre delene av kroppene til noen lavere virveldyr også gjennomgå fullstendig regenerering, for eksempel lemmer av salamander og haler, linser og armer av tropiske klørfrosker 4,15,16.
Etablering av hjerteskademodeller er det første skrittet for å belyse mekanismene bak hjerteregenerering og har stor betydning i regenerativ forskning. Forskere har utviklet ulike metoder for å bygge hjerteskademodeller, inkludert stikking, kontusing, genetisk ablasjon, kryoskade og infarkt 5,6.
Kryoinskade, hjerteinfarkt (MI) og apexreseksjon er mye brukt for å indusere hjerteskade, og skadetypen kan ha betydelig effekt på følgende regenerering av kardiomyocytter6. Avhengig av kirurgisk teknikk, kan hjertets respons på regenerering variere. Kryoskade forårsaker massiv celledød og produserer fibrotiske arr i hjertene til sebrafisk17, og skaper dermed en modell som ligner pattedyrinfarkt. Apikal reseksjon utføres ved å skjære bort en del av ventrikkelvevet, noe som er gjort i sebrafisk10 og X. tropicalis11, uten å forårsake permanente arr. Denne studien utførte apikal reseksjon, som er en enklere operasjon og krever færre kirurgiske instrumenter enn kryoskade. Ved hjelp av avstamningssporingsanalyse viste en tidligere studie at hjerteregenerering er relatert til spredning av kardiomyocytter som eksisterer i hjertene til mus6 og sebrafisk18, men det finnes ingen rapporter for amfibier. Derfor spiller modellen for apexreseksjon i X. tropicalis en viktig rolle i å belyse mekanismene som ligger til grunn for regenerative responser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle protokoller relatert til X. tropicalis ble godkjent av Jinan University Animal Care Committee.
1. Kirurgi
- Preoperativ forberedelse: Hold klar oftalmisk saks, oftalmisk tang, nåletang, absorberende baller, filterpapir og kirurgiske suturer / nåler for apexreseksjon i hjertene til X. tropicalis. Se materialfortegnelsen for detaljert informasjon. Før bruk, steriliser alle kirurgiske instrumenter ved autoklavering, og klargjør en tilstrekkelig mengde is for fremtidig bruk.
- Bedøv en voksen X. tropicalis med trikain ved å plassere den i 500 ml trikainoppløsning (1 mg/ml) ved romtemperatur i 4 minutter19, og legg den deretter på en isflate på operasjonsbordet for å sikre at frosken ikke våkner under driftsprosessen.
FORSIKTIG: Hele prosedyren krever 5-10 min; anestesitiden bør ikke være for lang, ellers kan X. tropicalis ikke være i stand til å våkne opp etter operasjonen. - Toraktomi
- Plasser den bedøvede X. tropicalis magen opp, og dekk froskens underliv med gasbind presoaked i destillert vann for å unngå tørking av dyrets hud under operasjonen.
- Trykk forsiktig på brystet med tang, finn midten av brystet parallelt med underbenet, løft huden med oftalmisk saks og lag forsiktig et lite snitt på ~ 1 cm. Bruk oftalmisk saks, plukk opp muskellaget under huden, og lag et sår i den sentrale brystmuskelen. Da hjertet ligger i den øvre posisjonen til sårstedet, trykk forsiktig på brystet med den oftalmiske tangen for å klemme hjertet ut fra såret.
FORSIKTIG: Siden huden til X. tropicalis kan produsere antimikrobielle peptider, er det unødvendig å bruke konvensjonelle desinfeksjonsprosedyrer på operasjonsstedet til X. tropicalis. Ethvert desinfeksjonsmiddel vil skade huden på X. tropicalis.
- Reseksjon av ventrikkelapex
- Klem forsiktig perikardiet med tang, og bryt det forsiktig med oftalmisk saks nær hjertets topp. Vent til perikardiet løsner på grunn av systolisk blodpumping (figur 1A, B).
- Hold tuppen av hjertet med tang i den ikke-dominerende hånden, og løft hjertet litt i henhold til hjertekontraksjonsrytmen. Når hjertet trekker seg sammen for å resirkulere blod gjennom blodårene, kutter du raskt av hjertets topp (~ 14% av ventrikkelen) (figur 1C).
- For å sikre at mengden apexreseksjon er ca. 14% av hele hjertet, analyser hjertevekten (HW) og overflatearealet med eller uten reseksjon20. Plasser hjertet i brystet ved hjelp av tang og en absorberende ball.
MERK: Ikke trykk hjertet direkte med tangen; Ellers vil andre deler av hjertet bli punktert.
- Sutur huden med en 4-0 ikke-absorberende ikke-silke kirurgisk trådsutur (figur 1D). Vær forsiktig med å unngå suturering i muskellaget for å forhindre postoperativ dødelighet. Vent til hudsåret naturlig leges innen 1 uke etter operasjonen.
- I sham operasjon gruppen, utføre torakotomi, åpne perikardiet, og sutur, uten å utføre apex reseksjon.
2. Kirurgisk gjenoppretting
- Plasser den postoperative X. tropicalis med magen vendt opp i en petriskål som inneholder en liten mengde avionisert vann (ikke oversvømme dyret helt). Vent til X. tropicalis våkner innen ~ 10 min.
- Når du gjenvinner bevisstheten, må du observere dyrets mobilitet og aktivitet, samt sårsuturen under aktivitet. Overfør froskene som har gjenvunnet balansen til en beholder fylt med rent vann for dyrking. Bytt ut vannet med rent vann hver dag for å unngå sårinfeksjon.
MERK: Med disse tiltakene kan overlevelsesraten nå ~ 90%. En lengre tid med anestesi og overdreven blødning under operasjonen fører begge til døden, som vanligvis oppstår på operasjonsdagen.
3. Påvisning av reparasjonstilstanden etter hjerteskade
- Samle hjertene til X. tropicalis på flere tidspunkter etter operasjonen.
- Etter bedøvelse av X. tropicalis med tricaine, åpne magen, og bruk tang for å fjerne de andre indre organer og vev for å finne plasseringen av hjertet.
MERK: På grunn av apex-reseksjonen vil hjertet sannsynligvis utvikle seg sammen med andre vev og organer under reparasjonsprosessen. Noen ganger fester det seg til muskelveggen og er ikke lett å skille, så det må håndteres forsiktig under samlingen. - Etter å ha funnet hjertet, bruk tang for å forsiktig rive de andre organene fra hjertet. Fjern forsiktig de andre vevene rundt hjertet for å eksponere hjertet. Bruk tang til å løfte hjertet forsiktig, og klipp det ut med saks. Plasser hjertet umiddelbart i PBS for å fjerne gjenværende blod, og fotografer det med et stereoskop for dokumentasjon (figur 2).
- Etter bedøvelse av X. tropicalis med tricaine, åpne magen, og bruk tang for å fjerne de andre indre organer og vev for å finne plasseringen av hjertet.
- Gradient dehydrering
- Blett hjertene med filterpapir for å tørke overflødige PBS-rester, og legg dem i en 24-brønns cellekulturfat. Bruk 1-2 ml 4% paraformaldehyd for å fikse hjertevevet over natten. Neste dag, utfør etanol dehydrering. Bruk først 70% etanol over natten, etterfulgt av 80% etanol, 90% etanol og 100% etanol for gradient dehydrering (1 time hver gang). Gjenta bruken av 100% etanol tre ganger.
- Innebygging av parafin
- Behandle det dehydrerte hjertevevet med xylen i 6-8 minutter. Legg det xylenbehandlede vevet i en glassbeholder fylt med parafinvoks ved 65 °C i 2-3 timer.
MERK: Det er viktig å unngå luftbobler da de påvirker delen under innebyggingsprosessen.
- Behandle det dehydrerte hjertevevet med xylen i 6-8 minutter. Legg det xylenbehandlede vevet i en glassbeholder fylt med parafinvoks ved 65 °C i 2-3 timer.
- Frys det innebygde vevet ved -20 °C i 1 time, og snitt det.
- Etter snitting av hjertet, utfør standard hematoksylin og eosin (H&E) og Massons trikrome fargeteknikker på seksjonene11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hjertene ble samlet på 0 dpr, 7 dpr, 14 dpr og 30 dpr. Den morfologiske analysen viste at blodproppen forårsaket av hjerteskaden forsvant ved 30 dpr (figur 2). Samtidig var hjertets utseende ved 30 dpr i reseksjonsgruppen likt hjertets utseende i skamoperasjonsgruppen; det var ingen åpenbare sår (figur 2). Etter apikal reseksjon dannet det seg blodpropp som forseglet såret i ventrikkelen, observert ved H&E (figur 3) og Massons trikromatfarging (figur 4). Ved 14 dpr forsvant blodproppen gradvis og ble erstattet av fibrin (figur 4). Fra 14 dpr til 30 dpr erstattet myokard gradvis fibrin og reparerte skadet ventrikkelapex (figur 4). Den histologiske analysen viste ingen forskjell mellom simulert og resektert hjerter ved 30 dpr (figur 3 og figur 4). Denne morfologiske og histologiske analysen viste at voksen X. tropicalis kunne reparere og regenerere den skadede ventrikkelapeksen med 30 dpr.
Figur 1 Kirurgisk inngrep. (A) Representativt bilde av et eksponert hjerte dekket av perikardiet. (B) Representativt bilde av et hjerte i systolisk fase, hvor perikardiet ble avskallet; Den stiplede linjen indikerer stedet for den apikale reseksjonen av hjertet. (C) Representativt bilde av apex-reseksjonen av hjertet. (D) Representativt bilde av hudsuturen etter operasjonen. Skalastenger = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Morfologisk analyse av X. tropicalis hjerter fra 0 dpr til 30 dpr. (A) Representative bilder av hjerter fra humbug (venstre) og apikale reseksjonsgrupper (høyre) ved 0 dpr, med hjertets apex signifikant fraværende i reseksjonsgruppen. (B,C) Representative bilder av hjerter fra humbug (venstre) versus reseksjonsgrupper (høyre) ved 7-14 dpr, med mange blodpropper som vises i hjertene til reseksjonsgruppen ved 7 dpr. Ved 14 dpr ses signifikant regenerering på det apikale reseksjonsstedet, men kantene på hjertets apex er ikke engang. (D) Representativt bilde av hjerter fra humbug (venstre) versus reseksjonsgrupper (høyre) ved 30 dpr; Toppen av det resekterte hjertet har nesten helt regenerert. Skalastenger = 1 mm. Forkortelse: dpr = dager etter reseksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Histologisk analyse av Xenopus tropicalishjerter fra 0 dpr til 30 dpr. Representative bilder av H&E-farging med hjerter fra humbug- og reseksjonsgruppene ved 0 dpr til 30 dpr. (A) Representativt bilde av H&E-farging ved hjelp av hjerter fra humbuggruppen, med stiplede linjer som indikerer de omtrentlige amputasjonsplanene. (B) Representativt bilde av H&E-farging ved bruk av hjerter fra reseksjonsgruppen ved 0 dpr. (VG Nett) Representative bilder av H&E-farging med hjerter fra reseksjonsgruppen ved 7-30 dpr, med store mengder røde blodlegemer akkumulert i såret ved 7 dpr (piler). En masse fibrin har dukket opp i reseksjonsstedet ved 14 dpr (pilspisser). Hjertene har regenerert helt uten arr ved 30 dpr. Skala bar = 500 μm. Forkortelse: dpr = dager etter reseksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Myokardfibroseanalyse av X. tropicalis hjerter fra 0 dpr til 30 dpr. Representative bilder av Massons farging av hjerter fra humbug- og reseksjonsgruppene ved 0 dpr til 30 dpr. (A) Representativt bilde av Massons farging av hjerter fra humbuggruppen, med stiplede linjer som indikerer de omtrentlige amputasjonsplanene. (B) Representativt bilde av Massons farging av hjerter fra reseksjonsgruppen ved 0 dpr. (VG Nett) Representative bilder av Massons farging av hjerter fra reseksjonsgruppen ved 7-30 dpr, med store mengder røde blodlegemer akkumulert i såret ved 7 dpr (piler). En masse fibrin har dukket opp i reseksjonsstedet ved 14 dpr (pilspisser). Hjertene har regenerert helt uten arr ved 30 dpr. Skala bar = 500 μm. Forkortelse: dpr = dager etter reseksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Apikal reseksjon, som innebærer kirurgisk amputasjon av hjertespissen, er beskrevet hos sebrafisk og mus 6,18; Dette er imidlertid ikke beskrevet i X. tropicalis. Denne rapporten beskriver en troverdig modell for hjerteskade og viser at hjertet til voksen X. tropicalis kan regenerere fullstendig etter apikal reseksjon uten arrdannelse. Noen mangler må imidlertid forbedres, og visse detaljer trenger oppmerksomhet.
Selv om apikal reseksjon kan etablere en hjerteskademodell, er det utfordrende å sikre samme grad av eksisjon av hjertet på grunn av mangfoldet av frosker, som har forskjellige hjertestørrelser. For å sikre at hjerter med apexer av samme størrelse resektereseres, er det nødvendig å velge frosker av samme størrelse, og operatøren må øve mye før forsøket.
For det andre er evnen til nøyaktig og raskt å lokalisere og eksponere hjertet avgjørende for prosedyrens suksess, da prosessen med å finne hjertet kan resultere i punktering av de tilstøtende blodkarene og forårsake blødning, og dermed hindre prosedyrens fremgang eller til og med forårsake svikt. Varigheten av anestesi bør ikke være for kort eller for lang. Hvis den er for kort, kan frosken våkne opp før operasjonen er fullført, og hvis denne prosessen er for lang, vil det sannsynligvis føre til froskens død. Som nevnt i protokollen § 2-5 skal sutureringen gjøres med varsomhet. For å sikre at forholdet mellom mengden apexreseksjon i forhold til hele hjertet er omtrent det samme på tvers av frosker, analyseres hjertevekten (HW) og overflatearealet med eller uten reseksjon20, og en liten del av hjertets apex resekteres for å sikre kammereksponering6.
Kryoskade, MI, og apikal reseksjon er de tre mest brukte metodene for å indusere hjerteskade hos sebrafisk og mus 6,18,21. Begrensningen i denne artikkelen er at bare den tredje metoden ble brukt, noe som betyr at dette arbeidet ikke gir noen informasjon om de forskjellige regenerative responsene etter skade med de to andre metodene6. Kryoskade resulterer i død av et stort antall celler i ~ 20% av ventrikkelveggen, lik pattedyrinfarkt21. MI, som også kalles koronar okklusjon, har høyere overlevelse i X. tropicalis i forhold til apikal reseksjon hos mus6, men er vanskeligere å oppnå i X. tropicalis fordi hjertene til tropiske klørfrosker er mindre enn hos mus. X. tropicalis apikal reseksjonsmetode etablert i denne studien er enklere å utføre og har en høy postoperativ overlevelse.
Den apikale reseksjonen utviklet i denne rapporten vil være en betydelig metode for å undersøke molekylære mekanismer for regenerering i hjertene til X. tropicalis. En tidligere studie viste også at Fosl1 er uunnværlig for hjerteregenerering ved X. tropicalis etter apikal reseksjon20. Denne modellen av apikal reseksjon hjerteskade i X. tropicalis kan brukes til å lære mer om de molekylære mekanismene som ligger til grunn for hjerteregenerering for å fremme studiet av gener og molekylære mekanismer relatert til human hjerteregenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Key R &D Program of China (2016YFE0204700), National Natural Science Foundation of China (82070257, 81770240), og Research Grant of Key Laboratory of Regenerative Medicine, Ministry of Education, Jinan University (ZSYXM202004 og ZSYXM202104), Kina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | GHTECH | 64-19-7-500ml | |
| Acid Alcohol Fast Differentiation Solution | Beyotime | C0163M | |
| Acid Fuchsin | aladdin | A104916 | |
| Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution | Servicebio | G1001-500ML | |
| BioReagent | Beyotime | ST2600-100g | |
| Ethanol absolute | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-0.5L | |
| Hematoxylin Stain Solution | Servicebio | G1004-500ML | |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | |
| Operating Scissors | Prosperich | HC-JZ-YK-Z-10cm | |
| Paraffins | Leica | 39601095 | |
| Para-formaldehyde Fixative | Servicebio | G1101-500ML | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) powder | Servicebio | G0002-2L | |
| Phosphomolybdic acid hydrate | Macklin | P815551 | |
| Stereo microscope | Leica | ||
| surgical forceps | ChangZhou | zfq-11-btjw | |
| Surgical Suture | HUAYON | 18-5140 | |
| Tricaine | Macklin | ||
| Xylene | Guangzhou Chemical Reagent Factory | IC02-AR-0.5L |
References
- Thiara, B.
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (6), 2233-2244 (2008).
- Burke, A. P., Virmani, R.
- Sessions, S. K., Bryant, S. V. Evidence that regenerative ability is an intrinsic property of limb cells in Xenopus. Journal of Experimental Zoology. 247 (1), 39-44 (1988).
- Laflamme, M. A.
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Tzahor, E., Poss, K. D. Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart. Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Liao, S., et al. Heart regeneration in adult Xenopus tropicalis after apical resection. Cell & Bioscience. 7, 70 (2017).
- Marshall, L. N., et al. Stage-dependent cardiac regeneration in Xenopus is regulated by thyroid hormone availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3614-3623 (2019).
- Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Developmental Biology. 354 (1), 67-76 (2011).
- Cano-Martinez, A., et al. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Archivos de Cardiología de México. 80 (2), 79-86 (2010).
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. Journal of Experimental Zoology. 187 (2), 249-253 (1974).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Ellman, D. G., et al. Apex resection in zebrafish (Danio rerio) as a model of heart regeneration: A video-assisted guide. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5865 (2021).
- Lee-Liu, D., et al. Genome-wide expression profile of the response to spinal cord injury in Xenopus laevis reveals extensive differences between regenerative and non-regenerative stages. Neural Development. 9, 12 (2014).
- Wu, H. Y., et al. Fosl1 is vital to heart regeneration upon apex resection in adult Xenopus tropicalis. npj Regenerative Medicine. 6 (1), 36 (2021).
- Chablais, F., Jazwinska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. Journal of Visualized Experiments. (62), e3666 (2012).
