Summary
जेनोपस उष्णकटिबंधीय पुनर्योजी अनुसंधान के लिए एक आदर्श मॉडल है क्योंकि इसके कई अंगों में उल्लेखनीय पुनर्योजी क्षमता है। यहां, हम एक्स ट्रॉपिलिस में दिल की चोट के मॉडल के निर्माण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
यह ज्ञात है कि वयस्क स्तनधारियों में, हृदय ने अपनी पुनर्योजी क्षमता खो दी है, जिससे दिल की विफलता दुनिया भर में मृत्यु के प्रमुख कारणों में से एक है। पिछले शोध ने वयस्क जेनोपस उष्णकटिबंधीय के दिल की पुनर्योजी क्षमता का प्रदर्शन किया है, जो एक द्विगुणित जीनोम के साथ एक एनुरान उभयचर और स्तनधारियों के साथ घनिष्ठ विकासवादी संबंध है। इसके अतिरिक्त, अध्ययनों से पता चला है कि वेंट्रिकुलर एपेक्स रिसेक्शन के बाद, दिल एक्स उष्णकटिबंधीय में निशान के बिना पुनर्जीवित हो सकता है। नतीजतन, इन पिछले परिणामों से पता चलता है कि एक्स उष्णकटिबंधीय वयस्क हृदय पुनर्जनन के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त वैकल्पिक कशेरुक मॉडल है। उष्णकटिबंधीय में कार्डियक पुनर्जनन का एक सर्जिकल मॉडल यहां प्रस्तुत किया गया है। संक्षेप में, मेंढकों को एनेस्थेटाइज और तय किया गया था; फिर, इरिडेक्टॉमी कैंची के साथ एक छोटा चीरा लगाया गया, जो त्वचा और पेरिकार्डियम को भेदता है। वेंट्रिकल पर कोमल दबाव लागू किया गया था, और वेंट्रिकल के शीर्ष को कैंची से काट दिया गया था। हृदय की चोट और पुनर्जनन की पुष्टि हिस्टोलॉजी द्वारा 7-30 दिनों के बाद रिसेक्शन (डीपीआर) में की गई थी। इस प्रोटोकॉल ने वयस्क एक्स उष्णकटिबंधीय में एक एपिकल रिसेक्शन मॉडल स्थापित किया, जिसे वयस्क हृदय पुनर्जनन के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।
Introduction
दिल की विफलता हाल के वर्षों में दुनिया भर में मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण रहा है। 2000 के बाद से, दिल की विफलता के कारण होने वाली मौतों की संख्या समय के साथ बढ़ रही है। 2019 में कार्डियोमायोपैथी से 9 मिलियन से अधिक लोगों की मृत्यु हो गई, जो विश्व स्तर पर मृत्यु दर की कुल संख्या का 16%था। वयस्क स्तनधारियों में हृदय की पुनर्योजी क्षमता के नुकसान के कारण, कुछ मामलों में, हृदय में संकुचन कार्यों को बनाए रखने के लिए पर्याप्त कार्डियोमायोसाइट्स नहीं होते हैं, जो हृदय समारोह को प्रभावित करता है और असामान्य वेंट्रिकुलर रीमॉडेलिंग और दिल की विफलतामें योगदान देता है 2,3,4. दरअसल, स्तनधारियों में, हृदय में यकृत, फेफड़े, आंतों, मूत्राशय, हड्डी और त्वचा जैसे अन्य अंगों की तुलना में सबसे खराब पुनर्योजी क्षमता होती है। जैसे-जैसे दुनिया की आबादी की उम्र बढ़ने का एक वैश्विक मेगाट्रेंड बन जाता है, हृदय रोग के साथ हमारे सामने आने वालीचुनौतियां तेज हो जाएंगी।
हृदय पुनर्जनन के तंत्र को स्पष्ट करने से इस्केमिक हृदय रोग के लिए उपचार के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकते हैं। रिपोर्टों से पता चला है कि नवजात चूहों के दिल में एपेक्स रिसेक्शन6 के बाद पुनर्योजी क्षमता होती है। फिर भी, यह पुनर्योजी क्षमता7 साल की उम्र के 7 दिनों के बाद खो जाती है। अध्ययनों से पता चला है कि वयस्क स्तनधारी दिल पुनर्जीवित करने में असमर्थ हैं क्योंकि कार्डियोमायोसाइट्स प्रसार के लिए उनकी क्षमता 8,9 कम हो गई है। हालांकि, निचले कशेरुकियों के दिल में चोट के बाद एक शक्तिशाली पुनर्योजी क्षमता होती है। उदाहरण के लिए, जेब्राफिश 10, एक्स ट्रॉपिलिस11, जेनोपस लेविस12, न्यूट 13, और एक्सोलोटल14 एपेक्स रिसेक्शन के बाद पूर्ण पुनर्जनन में सक्षम हैं। इसके अतिरिक्त, कुछ निचले कशेरुकियों के शरीर के अन्य हिस्से भी पूर्ण पुनर्जनन से गुजर सकते हैं, जैसे कि न्यूट्स के अंग और पूंछ, लेंस और उष्णकटिबंधीय पंजे वाले मेंढकों की भुजाएं 4,15,16।
कार्डियक चोट मॉडल स्थापित करना कार्डियक पुनर्जनन के अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने के लिए पहला कदम है और पुनर्योजी अनुसंधान में इसका बहुत महत्व है। शोधकर्ताओं ने कार्डियक चोट मॉडल बनाने के लिए विभिन्न तरीकों को विकसित किया है, जिसमें छुरा घोंपना, दूषित करना, आनुवंशिक पृथक्करण, क्रायोइंजरी और रोधगलन 5,6 शामिल हैं।
क्रायोइंजरी, मायोकार्डियल रोधगलन (एमआई), और एपेक्स रिसेक्शन का व्यापक रूप से हृदय की चोट को प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जाता है, और चोट के प्रकार का कार्डियोमायोसाइट्स6 के निम्नलिखित पुनर्जनन पर पर्याप्त प्रभाव पड़ सकता है। सर्जिकल तकनीक के आधार पर, पुनर्जनन के लिए दिल की प्रतिक्रिया अलग-अलग हो सकती है। क्रायोइंजरी बड़े पैमाने पर कोशिका मृत्यु का कारण बनती है और ज़ेबराफ़िश17 के दिल में फाइब्रोटिक निशान पैदा करती है, इस प्रकार एक मॉडल बनाती है जो स्तनधारी रोधगलन जैसा दिखता है। एपिकल रिसेक्शन वेंट्रिकुलर ऊतकों के एक हिस्से को काटकर किया जाता है, जो स्थायी निशान पैदा किए बिना ज़ेबराफिश10 और एक्स उष्णकटिबंधीय11 में किया गया है। इस अध्ययन ने एपिकल रिसेक्शन का प्रदर्शन किया, जो एक सरल ऑपरेशन है और क्रायोइंजरी की तुलना में कम सर्जिकल उपकरणों की आवश्यकता होती है। वंशावली-अनुरेखण विश्लेषण का उपयोग करते हुए, एक पिछले अध्ययन से पता चला है कि कार्डियक पुनर्जनन कार्डियोमायोसाइट्स के प्रसार से संबंधित है जो माउस6 और ज़ेब्राफिश18 के दिल में पहले से मौजूद हैं, लेकिन उभयचरों के लिए कोई रिपोर्ट मौजूद नहीं है। इसलिए, एक्स उष्णकटिबंधीय में एपेक्स रिसेक्शन का मॉडल पुनर्योजी प्रतिक्रियाओं के अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।
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Protocol
उष्णकटिबंधीय से संबंधित सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल जिनान विश्वविद्यालय पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे।
1. सर्जरी
- प्रीऑपरेटिव तैयारी: एक्स ट्रॉपिलिस के दिल में शीर्ष शोधन के लिए नेत्र कैंची, नेत्र बल, सुई बल, शोषक गेंद, फिल्टर पेपर और सर्जिकल सीवन / सुइयों को तैयार रखें। विस्तृत जानकारी के लिए सामग्री तालिका देखें। उपयोग करने से पहले, ऑटोक्लेविंग द्वारा सभी सर्जिकल उपकरणों को निष्फल करें, और भविष्य में उपयोग के लिए पर्याप्त मात्रा में बर्फ तैयार करें।
- ट्रॉपिकल्स को ट्राइकेन के साथ एनेस्थेटाइज करके 4 मिनट19 के लिए कमरे के तापमान पर 500 एमएल ट्राइकेन समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल) में रखकर और फिर इसे ऑपरेटिंग टेबल पर बर्फ की सतह पर रखें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि मेंढक ऑपरेटिंग प्रक्रिया के दौरान जाग न जाए।
सावधानी: पूरी प्रक्रिया में 5-10 मिनट की आवश्यकता होती है; संज्ञाहरण का समय बहुत लंबा नहीं होना चाहिए, अन्यथा एक्स उष्णकटिबंधीय ऑपरेशन के बाद जागने में सक्षम नहीं हो सकता है। - थोराकोटॉमी
- उष्ण कटिबंधीय पेट को ऊपर रखें, और ऑपरेशन के दौरान जानवर की त्वचा के सूखने से बचने के लिए आसुत पानी में भिगोए गए धुंध के साथ मेंढक के पेट को कवर करें।
- धीरे से छाती को बल के साथ दबाएं, छाती के केंद्र को निचले अग्रभाग के समानांतर ढूंढें, नेत्र कैंची के साथ त्वचा को उठाएं, और धीरे से ~ 1 सेमी का एक छोटा चीरा लगाएं। नेत्र कैंची का उपयोग करके, त्वचा के नीचे मांसपेशियों की परत उठाएं, और केंद्रीय छाती की मांसपेशियों में एक घाव बनाएं। चूंकि हृदय घाव स्थल की ऊपरी स्थिति में स्थित है, घाव से दिल को निचोड़ने के लिए नेत्र बल के साथ छाती को धीरे से दबाएं।
जैसा कि एक्स उष्णकटिबंधीय की त्वचा रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स का उत्पादन कर सकती है, एक्स उष्णकटिबंधीय की सर्जिकल साइट पर पारंपरिक कीटाणुशोधन प्रक्रियाओं को नियोजित करना अनावश्यक है। कोई भी कीटाणुनाशक एक्स उष्णकटिबंधीय की त्वचा को नुकसान पहुंचाएगा।
- वेंट्रिकुलर एपेक्स रिसेक्शन
- धीरे से पेरिकार्डियम को बल के साथ दबाएं, और दिल के शीर्ष के पास नेत्र कैंची का उपयोग करके धीरे से इसे तोड़ दें। सिस्टोलिक रक्त पंपिंग के कारण पेरिकार्डियम के बंद होने की प्रतीक्षा करें (चित्रा 1 ए, बी)।
- गैर-प्रमुख हाथ में बल के साथ दिल की नोक को पकड़ें, और हृदय संकुचन लय के अनुसार हृदय को थोड़ा ऊपर उठाएं। जब हृदय रक्त वाहिकाओं के माध्यम से रक्त को पुन: प्रसारित करने के लिए सिकुड़ता है, तो जल्दी से हृदय के शीर्ष (वेंट्रिकल का ~ 14%) को काट दें (चित्रा 1 सी)।
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि एपेक्स रिसेक्शन की मात्रा पूरे दिल का लगभग 14% है, दिल के वजन (एचडब्ल्यू) और सतह क्षेत्र का विश्लेषणकरें। बल और एक शोषक गेंद का उपयोग करके दिल को छाती में रखें।
नोट: बल के साथ सीधे दिल को न दबाएं; अन्यथा, दिल के अन्य हिस्से पंचर हो जाएंगे।
- 4-0 गैर-अवशोषक गैर-रेशम सर्जिकल थ्रेड सीवन (चित्रा 1 डी) के साथ त्वचा को सीवन करें। पोस्टऑपरेटिव मृत्यु दर को रोकने के लिए मांसपेशियों की परत में ट्यूरिंग से बचने के लिए सावधान रहें। सर्जरी के बाद 1 सप्ताह के भीतर त्वचा के घाव को स्वाभाविक रूप से ठीक करने की प्रतीक्षा करें।
- शाम ऑपरेशन समूह में, थोराकोटॉमी करें, पेरिकार्डियम खोलें, और सीवन, शीर्ष शोधन किए बिना।
2. सर्जिकल रिकवरी
- ट्रॉपिलिस को अपने पेट के साथ एक पेट्री डिश में रखें जिसमें विआयनीकृत पानी की थोड़ी मात्रा होती है (जानवर को पूरी तरह से बाढ़ न दें)। एक्स उष्णकटिबंधीय के ~ 10 मिनट के भीतर जागने की प्रतीक्षा करें।
- होश में आने पर, जानवर की गतिशीलता और गतिविधि का निरीक्षण करें, साथ ही गतिविधि के दौरान घाव सीवन भी। जिन मेंढकों ने अपना संतुलन वापस पा लिया है, उन्हें खेती के लिए शुद्ध पानी से भरे कंटेनर में स्थानांतरित करें। घाव के संक्रमण से बचने के लिए हर दिन पानी को शुद्ध पानी से बदलें।
नोट: इन उपायों के साथ, जीवित रहने की दर ~ 90% तक पहुंच सकती है। सर्जरी के दौरान एनेस्थीसिया और अत्यधिक रक्तस्राव का एक लंबा समय दोनों मृत्यु का कारण बनता है, जो आमतौर पर सर्जरी के दिन होता है।
3. कार्डियक चोट के बाद मरम्मत की स्थिति का पता लगाना
- सर्जरी के बाद कई समय बिंदुओं पर एक्स ट्रॉपिलिस के दिल को इकट्ठा करें।
- ट्राइकेन के साथ एक्स ट्रॉपिलिस को एनेस्थेटाइज करने के बाद, पेट खोलें, और हृदय के स्थान का पता लगाने के लिए अन्य आंतरिक अंगों और ऊतकों को हटाने के लिए बल का उपयोग करें।
नोट: शीर्ष शोधन के कारण, मरम्मत प्रक्रिया के दौरान हृदय अन्य ऊतकों और अंगों के साथ विकसित होने की संभावना है। कभी-कभी, यह मांसपेशियों की दीवार से चिपक जाता है और अलग करना आसान नहीं होता है, इसलिए इसे संग्रह के दौरान सावधानी से संभाला जाना चाहिए। - दिल को खोजने के बाद, दिल से अन्य अंगों को धीरे से फाड़ने के लिए बल का उपयोग करें। दिल को उजागर करने के लिए दिल के आसपास के अन्य ऊतकों को धीरे से छील दें। दिल को धीरे से उठाने के लिए बल का उपयोग करें, और कैंची का उपयोग करके इसे काट लें। किसी भी शेष रक्त को हटाने के लिए पीबीएस में तुरंत दिल रखें, और प्रलेखन के लिए स्टीरियोस्कोप के साथ इसे फोटोग्राफ करें (चित्रा 2)।
- ट्राइकेन के साथ एक्स ट्रॉपिलिस को एनेस्थेटाइज करने के बाद, पेट खोलें, और हृदय के स्थान का पता लगाने के लिए अन्य आंतरिक अंगों और ऊतकों को हटाने के लिए बल का उपयोग करें।
- ढाल निर्जलीकरण
- अतिरिक्त पीबीएस अवशेषों को सुखाने के लिए फिल्टर पेपर के साथ दिल को धब्बा दें, और उन्हें 24-अच्छी तरह से सेल कल्चर डिश में रखें। रात भर दिल के ऊतकों को ठीक करने के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 1-2 मिलीलीटर का उपयोग करें। अगले दिन, इथेनॉल निर्जलीकरण करें। सबसे पहले, रात भर 70% इथेनॉल का उपयोग करें, इसके बाद 80% इथेनॉल, 90% इथेनॉल, और ढाल निर्जलीकरण के लिए 100% इथेनॉल (हर बार 1 घंटे)। 100% इथेनॉल के उपयोग को तीन बार दोहराएं।
- पैराफिन एम्बेडिंग
- 6-8 मिनट के लिए जाइलीन के साथ निर्जलित हृदय ऊतक का इलाज करें। जाइलीन-उपचारित ऊतक को पैराफिन मोम से भरे एक ग्लास कंटेनर में 2-3 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
नोट: हवा के बुलबुले से बचना आवश्यक है क्योंकि वे एम्बेडिंग प्रक्रिया के दौरान अनुभाग को प्रभावित करते हैं।
- 6-8 मिनट के लिए जाइलीन के साथ निर्जलित हृदय ऊतक का इलाज करें। जाइलीन-उपचारित ऊतक को पैराफिन मोम से भरे एक ग्लास कंटेनर में 2-3 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- एम्बेडेड ऊतक को 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें, और इसे विभाजित करें।
- हृदय को विभाजित करने के बाद, अनुभाग11 पर मानक हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई) और मैसन की ट्राइक्रोम धुंधला तकनीक ों का प्रदर्शन करें।
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Representative Results
दिल 0 डीपीआर, 7 डीपीआर, 14 डीपीआर और 30 डीपीआर पर एकत्र किए गए थे। रूपात्मक विश्लेषण से पता चला कि दिल की चोट के कारण रक्त का थक्का 30 डीपीआर (चित्रा 2) पर गायब हो गया। इसी समय, रिसेक्शन समूह में 30 डीपीआर पर दिलों की उपस्थिति शाम ऑपरेशन समूह में दिलों के समान थी; कोई स्पष्ट घाव नहीं थे (चित्रा 2)। एपिकल रिसेक्शन के बाद, एक रक्त का थक्का बनता है और वेंट्रिकल में घाव को सील कर देता है, जैसा कि एच एंड ई (चित्रा 3) और मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग (चित्रा 4) द्वारा देखा गया है। 14 डीपीआर के भीतर, थक्का धीरे-धीरे गायब हो गया और फाइब्रिन द्वारा प्रतिस्थापित किया गया (चित्रा 4)। 14 डीपीआर से 30 डीपीआर तक, मायोकार्डियम ने धीरे-धीरे फाइब्रिन को बदल दिया और क्षतिग्रस्त वेंट्रिकल एपेक्स की मरम्मत की (चित्रा 4)। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण ने 30 डीपीआर (चित्रा 3 और चित्रा 4) पर शाम और कटे हुए दिलों के बीच कोई अंतर नहीं दिखाया। इस रूपात्मक और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण से पता चला कि वयस्क एक्स उष्णकटिबंधीय 30 डीपीआर तक घायल वेंट्रिकुलर एपेक्स की मरम्मत और पुन: उत्पन्न कर सकता है।
चित्र 1: शल्य चिकित्सा प्रक्रिया । (ए) पेरिकार्डियम द्वारा कवर किए गए एक उजागर दिल की प्रतिनिधि छवि। (बी) सिस्टोलिक चरण में एक दिल की प्रतिनिधि छवि, जिसके दौरान पेरिकार्डियम को छील दिया गया था; धराशायी रेखा हृदय के एपिकल रिसेक्शन की साइट को इंगित करती है। (सी) दिल के शीर्ष शोधन की प्रतिनिधि छवि। (डी) सर्जरी के बाद त्वचा सीवन की प्रतिनिधि छवि। स्केल बार = 1 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
(ए) 0 डीपीआर से 30 डीपीआर तक एक्स ट्रॉपिलिस हार्ट का रूपात्मक विश्लेषण। (ए) 0 डीपीआर पर शाम (बाएं) और एपिकल रिसेक्शन समूहों (दाएं) से दिल की प्रतिनिधि छवियां, जिसमें हृदय का शीर्ष रिसेक्शन समूह में काफी अनुपस्थित है। (बी, सी) 7-14 डीपीआर पर शाम (बाएं) बनाम रिसेक्शन समूहों (दाएं) से दिल की प्रतिनिधि छवियां, जिसमें 7 डीपीआर पर रिसेक्शन समूह के दिलों में कई रक्त के थक्के दिखाई देते हैं। 14 डीपीआर पर, एपिकल रिसेक्शन साइट पर महत्वपूर्ण पुनर्जनन देखा जाता है, लेकिन दिल के शीर्ष के किनारे भी नहीं होते हैं। (डी) 30 डीपीआर पर शाम (बाएं) बनाम अलग समूहों (दाएं) से दिल की प्रतिनिधि छवि; कटे हुए हृदय का शीर्ष लगभग पूरी तरह से पुनर्जीवित हो गया है। स्केल बार = 1 मिमी। संक्षिप्त नाम: डीपीआर = दिन पोस्ट रिसेक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: 0 डीपीआर से 30 डीपीआर तक जेनोपस उष्णकटिबंधीय दिल का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण। 0 डीपीआर से 30 डीपीआर पर शाम और रिसेक्शन समूहों से दिल का उपयोग करके एच एंड ई धुंधला होने की प्रतिनिधि छवियां। (ए) शाम समूह से दिल का उपयोग करके एच एंड ई धुंधला होने की प्रतिनिधि छवि, जिसमें अनुमानित विच्छेदन विमानों को इंगित करने वाली धराशायी रेखाएं हैं। (बी) 0 डीपीआर पर रिसेक्शन समूह से दिल का उपयोग करके एच एंड ई धुंधला होने की प्रतिनिधि छवि। (C-E) 7-30 डीपीआर पर रिसेक्शन समूह से दिल का उपयोग करके एच एंड ई धुंधला होने की प्रतिनिधि छवियां, 7 डीपीआर (तीर) पर घाव के भीतर बड़ी मात्रा में लाल रक्त कोशिकाओं के जमा होने के साथ। फाइब्रिन का एक द्रव्यमान 14 डीपीआर (तीर) पर रिसेक्शन साइट में दिखाई दिया है। दिल 30 डीपीआर पर निशान के बिना पूरी तरह से पुनर्जीवित हो गए हैं। स्केल बार = 500 μm। संक्षिप्त नाम: डीपीआर = दिन पोस्ट रिसेक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: 0 डीपीआर से 30 डीपीआर तक एक्स उष्णकटिबंधीय दिल का मायोकार्डियल फाइब्रोसिस विश्लेषण। 0 डीपीआर से 30 डीपीआर पर शाम और अलग समूहों से मैसन के दिलों को धुंधला करने की प्रतिनिधि छवियां। (ए) मैसन के दिखावटी समूह से दिलों के धुंधला होने की प्रतिनिधि छवि, जिसमें अनुमानित विच्छेदन विमानों को इंगित करने वाली धराशायी रेखाएं हैं। (बी) 0 डीपीआर पर रिसेक्शन समूह से मैसन के दिल के धुंधला होने की प्रतिनिधि छवि। (C-E) 7-30 डीपीआर पर रिसेक्शन समूह से मैसन के दिल के धुंधला होने की प्रतिनिधि छवियां, जिसमें 7 डीपीआर (तीर) पर घाव के भीतर बड़ी मात्रा में लाल रक्त कोशिकाएं जमा हुईं। फाइब्रिन का एक द्रव्यमान 14 डीपीआर (तीर) पर रिसेक्शन साइट में दिखाई दिया है। दिल 30 डीपीआर पर निशान के बिना पूरी तरह से पुनर्जीवित हो गए हैं। स्केल बार = 500 μm। संक्षिप्त नाम: डीपीआर = दिन पोस्ट रिसेक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
एपिकल रिसेक्शन, जिसमें हृदय के शीर्ष के सर्जिकल विच्छेदन शामिल हैं, को ज़ेबराफिश और चूहों 6,18 में वर्णित किया गया है; हालाँकि, यह एक्स ट्रॉपिलिस में वर्णित नहीं किया गया है। यह रिपोर्ट हृदय की चोट के एक विश्वसनीय मॉडल का वर्णन करती है और दर्शाती है कि वयस्क एक्स उष्णकटिबंधीय का दिल बिना निशान के एपिकल रिसेक्शन के बाद पूरी तरह से पुनर्जीवित हो सकता है। हालांकि, कुछ कमियों में सुधार करने की आवश्यकता है, और कुछ विवरणों पर ध्यान देने की आवश्यकता है।
यद्यपि एपिकल रिसेक्शन एक दिल की चोट मॉडल स्थापित कर सकता है, मेंढकों की विविधता के कारण दिल के छांटने की समान सीमा सुनिश्चित करना चुनौतीपूर्ण है, जिनके पास अलग-अलग हृदय आकार हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि एक ही आकार के शीर्ष वाले दिल को बचाया जाता है, एक ही आकार के मेंढकों का चयन करना आवश्यक है, और ऑपरेटर को प्रयोग से पहले बड़े पैमाने पर अभ्यास करना चाहिए।
दूसरा, हृदय का सही और जल्दी से पता लगाने और उजागर करने की क्षमता प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि हृदय को खोजने की प्रक्रिया के परिणामस्वरूप आसन्न रक्त वाहिकाओं का पंचर हो सकता है और रक्तस्राव हो सकता है, इस प्रकार प्रक्रिया की प्रगति में बाधा उत्पन्न हो सकती है या यहां तक कि विफलता भी हो सकती है। संज्ञाहरण की अवधि बहुत कम या बहुत लंबी नहीं होनी चाहिए। यदि यह बहुत छोटा है, तो ऑपरेशन पूरा होने से पहले मेंढक जाग सकता है, और यदि यह प्रक्रिया बहुत लंबी है, तो इससे मेंढक की मृत्यु होने की संभावना है। जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग 2-5 में उल्लेख किया गया है, व्याख्यान सावधानी से किया जाना चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए कि पूरे दिल की तुलना में एपेक्स रिसेक्शन की मात्रा का अनुपात मेंढकों में लगभग समान है, हृदय के वजन (एचडब्ल्यू) और रिसेक्शन के साथ या बिना सतह क्षेत्र का विश्लेषणकिया जाता है, और चैंबरएक्सपोजर सुनिश्चित करने के लिए हृदय के शीर्ष के एक छोटे से हिस्से का विश्लेषण किया जाता है।
क्रायोइंजरी, एमआई, और एपिकल रिसेक्शन जेब्राफिश और चूहों 6,18,21 में कार्डियक चोट को प्रेरित करने के लिए तीन सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीके हैं। इस लेख की सीमा यह है कि केवल तीसरी विधि का उपयोग किया गया था, जिसका अर्थ है कि यह काम अन्य दो विधियों के साथ चोट के बाद विभिन्न पुनर्योजी प्रतिक्रियाओं के बारे में कोई जानकारी प्रदान नहीं करताहै। क्रायोइंजरी के परिणामस्वरूप स्तनधारी इन्फ्रैक्टस 21 के समान वेंट्रिकुलर दीवार के ~20% में बड़ी संख्या में कोशिकाओं की मृत्यु हो जाती है। एमआई, जिसे कोरोनरी धमनी रोड़ा भी कहा जाता है, चूहों6 में एपिकल रिसेक्शन की तुलना में एक्स ट्रॉपिलिस में उच्च जीवित रहने की दर है, लेकिन एक्स उष्णकटिबंधीय में प्राप्त करना अधिक कठिन है क्योंकि उष्णकटिबंधीय पंजे वाले मेंढकों के दिल चूहों की तुलना में छोटे होते हैं। इस अध्ययन में स्थापित एक्स ट्रॉपिलिस एपिकल रिसेक्शन विधि प्रदर्शन करने के लिए सरल है और इसमें उच्च पोस्टऑपरेटिव उत्तरजीविता दर है।
इस रिपोर्ट में विकसित एपिकल रिसेक्शन एक्स ट्रॉपिकलिस के दिलों में पुनर्जनन के आणविक तंत्र की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका होगा। एक पिछले अध्ययन से यह भी पता चला है कि एक्स. ट्रॉपिलिस में कार्डियक पुनर्जनन के लिए फोसल 1 अपरिहार्य है। उष्णकटिबंधीय में एपिकल रिसेक्शन दिल की चोट के इस मॉडल का उपयोग मानव हृदय पुनर्जनन से संबंधित जीन और आणविक तंत्र के अध्ययन को बढ़ावा देने के लिए कार्डियक पुनर्जनन के अंतर्निहित आणविक तंत्र के बारे में अधिक जानने के लिए किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2016YFE0204700), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82070257, 81770240), और पुनर्योजी चिकित्सा की प्रमुख प्रयोगशाला के अनुसंधान अनुदान, शिक्षा मंत्रालय, जिनान विश्वविद्यालय (ZSYXM202004 और ZSYXM202104), चीन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | GHTECH | 64-19-7-500ml | |
| Acid Alcohol Fast Differentiation Solution | Beyotime | C0163M | |
| Acid Fuchsin | aladdin | A104916 | |
| Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution | Servicebio | G1001-500ML | |
| BioReagent | Beyotime | ST2600-100g | |
| Ethanol absolute | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-0.5L | |
| Hematoxylin Stain Solution | Servicebio | G1004-500ML | |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | |
| Operating Scissors | Prosperich | HC-JZ-YK-Z-10cm | |
| Paraffins | Leica | 39601095 | |
| Para-formaldehyde Fixative | Servicebio | G1101-500ML | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) powder | Servicebio | G0002-2L | |
| Phosphomolybdic acid hydrate | Macklin | P815551 | |
| Stereo microscope | Leica | ||
| surgical forceps | ChangZhou | zfq-11-btjw | |
| Surgical Suture | HUAYON | 18-5140 | |
| Tricaine | Macklin | ||
| Xylene | Guangzhou Chemical Reagent Factory | IC02-AR-0.5L |
References
- Thiara, B.
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (6), 2233-2244 (2008).
- Burke, A. P., Virmani, R.
- Sessions, S. K., Bryant, S. V. Evidence that regenerative ability is an intrinsic property of limb cells in Xenopus. Journal of Experimental Zoology. 247 (1), 39-44 (1988).
- Laflamme, M. A.
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Tzahor, E., Poss, K. D. Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart. Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Liao, S., et al. Heart regeneration in adult Xenopus tropicalis after apical resection. Cell & Bioscience. 7, 70 (2017).
- Marshall, L. N., et al. Stage-dependent cardiac regeneration in Xenopus is regulated by thyroid hormone availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3614-3623 (2019).
- Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Developmental Biology. 354 (1), 67-76 (2011).
- Cano-Martinez, A., et al. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Archivos de Cardiología de México. 80 (2), 79-86 (2010).
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. Journal of Experimental Zoology. 187 (2), 249-253 (1974).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Ellman, D. G., et al. Apex resection in zebrafish (Danio rerio) as a model of heart regeneration: A video-assisted guide. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5865 (2021).
- Lee-Liu, D., et al. Genome-wide expression profile of the response to spinal cord injury in Xenopus laevis reveals extensive differences between regenerative and non-regenerative stages. Neural Development. 9, 12 (2014).
- Wu, H. Y., et al. Fosl1 is vital to heart regeneration upon apex resection in adult Xenopus tropicalis. npj Regenerative Medicine. 6 (1), 36 (2021).
- Chablais, F., Jazwinska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. Journal of Visualized Experiments. (62), e3666 (2012).
