Полированные и железобетона тоньше череп-Window для долгосрочных изображений из мозга мыши

Summary

Представлен метод формирования изображения окна в мышь череп, который охватывает миллиметров и стабилен в течение месяца без воспаление головного мозга. Этот метод хорошо подходит для продольного исследования кровотока, клеточной динамики, и клетка / сосудистые структуры с использованием двух-фотонной микроскопии.

Abstract

В естественных изображений корковых функций требует оптического доступа к мозгу без нарушения внутричерепного окружающей среды. Представлен метод формирования полированного и железобетонных разбавленной черепа (портов) в окно мыши череп, который охватывает несколько миллиметров в диаметре и стабилен в течение месяца. Череп разбавленной от 10 до 15 мкм в толщину с ручной буровой для достижения оптической прозрачностью, а затем обложил цианакрилатного клея и покровного стекла: 1) обеспечивает жесткость, 2) подавляют костный подроста и 3) уменьшить рассеяние света от неровностей на поверхности кости. С черепа не нарушена, любое воспаление, которое может повлиять на процесс изучается значительно снижается. Изображений глубине до 250 мкм ниже поверхности коры может быть достигнуто с помощью двухфотонного лазерной сканирующей микроскопии. Это окно хорошо подходит для изучения мозгового кровотока и клеточной функции как наркоз и проснуться препаратов. Кроме того, он предлагает опможность управлять клеточной активности использования optogenetics или нарушать кровоток в сосудах целевых облучения циркулирующего фотосенсибилизаторов.

Protocol

1. Подготовка к операции ^я

1. Очистите хирургических инструментов, sonicating в смеси Maxizyme и хирургических молока в ультразвуковой очиститель. Автоклава хирургические инструменты перед каждым экспериментом.
2. Убедитесь, что все необходимые реагенты и расходные материалы имеются. Список реактивов и расходных материалов приведены в таблице 2. Реагенты и расходные материалы, которые вступают в контакт с открытыми ткани должны быть стерильными, когда это возможно.
3. Вызвать анестезии. Типичные анестетики подходит для выживания исследования представлены в таблице 1. Убедитесь, хирургический наркоз плоскости, проверяя отсутствие ног рефлекс крайнем случае. Оптимальный возраст мыши составляет от 3 до 6-недельного возраста. Черепов молодых мышей являются более мягкими и тонкими трудно. Пожилые мышей толще черепа, которые будут кровоточить еще во время прореживания процедуры.
4. Защита животных в стереотаксической раме ^1. Список хирургического оборудования приведены в таблице 2.
5. Поддержание температуры телатуры при 37 ° C с использованием обратной связи регулируется ректального датчика и тепло панели.
6. Применение глазной мази для глаз, чтобы сохранить влагу.
7. Бритье головы с небольшой электрической бритвой.
8. Очистите кожу головы Бетадин, а затем потереть на 70% (объем / объем) изопропилового спирта.
9. При желании, убедитесь, что сердца и дыхания находятся в пределах нормального диапазона использования пульсоксиметр. Для мыши, эти цифры должны центре около 10, 2 Гц, соответственно.
10. Теплый аликвоту стерильной фильтрацией искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) до 37 ° C (125 мМ NaCl, 10 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, 3,1 мМ CaCl _2, 1,3 мМ MgCl _2, рН 7,4), (все химические вещества из Sigma) ^2.

2. Монтаж Глава кадров

1. Снимите кожу головы в течение всей спинной поверхности черепа с парой щипцов и хирургические ножницы. Обрежьте кожу с боков до краев височных мышц с обеих сторон черепа и послеerior для мышц шеи (рис. 1А).
2. Используйте лезвие скальпеля для удаления тонких надкостницы с поверхности черепа.
3. Очистите череп с влажным хлопок наконечником аппликатором и сухой поверхности черепа с потоком воздуха от пыли может. Затем нанесите тонкий слой клея цианакрилатного по всей поверхности черепа. Дайте клею высохнуть. Этот слой клея, необходимые для надлежащего соблюдения зубного цемента в последующих шагах. Цианакрилатного клея не должны быть стерилизованы.
4. Прикрепите металлический разъем на поверхности черепа, от области нужное окно. Для анестезии препаратов, небольшая гайка может быть прикреплен к черепу с прикосновением цианакрилатного клея, который впоследствии может быть пьяным в изображение установки с помощью болтов (рис. 1B, 1L и 1N). Печать заднюю гайку с лентой, чтобы клей не входит в темы во время прикрепления к черепу. Гайки и лента должна быть стерилизована в автоклаве до операции.
5. Для подготовки изображения проснулся, придают более жесткие пользовательский разъем с двумя точками крепления (рис. 1М и 1Н). Просверлите два отверстия в черепе по противоположной коры полушария с половиной мм сверло заусенцев, а затем ввести два # 000 саморезов. Эти винты поможет закрепить голову монтировать к черепу. Наносить только на один полный оборот винта, чтобы избежать давления на основного мозга. Затем приложите пользовательские панели крест металла с небольшим прикосновением цианакрилатного клея на мозжечке. Позвольте цианакрилатного клей полностью высохнуть. Этот металл разъем значительно сокращает число степеней свободы и упрощает перемещение той же области изображения в продольных исследованиях. Широкий бар крест дает широкие возможности для размещения электродов и стимуляции вибриссы. Подробные планы создания пользовательских крепление головы и крепление устройств можно ознакомиться в Интернете (зики / links.html "> http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). винты и перекладина должны быть стерилизованы в автоклаве до операции.
6. Покройте всю поверхность черепа, за исключением расположения окна слоем стоматологического цемента (рис. 1С и 1D). Убедитесь, что все открытые края кожи покрыты цементом. Компоненты зубной цемент не должны быть стерилизованы.

3. Генерация полированные и усиленные тоньше, череп (портов) в окне

1. Убедитесь, что сверло заусенцы остры и избежать их повторного использования. Использование низких скоростях на бормашины, тонкий 2 мм на 2 мм регионе за соматосенсорной коры с половиной мм заусенцев. Переключение между смачивания череп с ACSF и сушки поверхности черепа с нежным потоком воздуха от газов тряпкой, мокрый для охлаждения, и сухой для разбавления. Это требует прореживания через губчатый слой черепа, которые могут кровоточить, но могут быть проверочныеред, смывая с ACSF (рис. 1д). Череп начинает сгибаться под небольшим давлением буровой, когда она составляет ~ 50 мкм, и мягкой мозговой оболочки сосудов должны быть видны через мокрую кости (рис. 1е). При этом толщина, небольшие белые пятна в кости становятся видимыми на несколько секунд сразу после сухой поверхности черепа увлажняется.
2. На данный момент, тонкие кости еще больше. Используйте медленный дрели, т.е. 1000 оборотов в минуту, который бреет поверхности черепа и только легким касанием. Использование небольших контролируемых движений, держа сверло, как перо, и только применить силу в боковом направлении. Кость должна быть ~ 10 до 15 мкм на конечной толщины (рис. 1Г). Когда кости достаточно тонкие, мелкие белые пятна в кости больше не будет видна, когда сухой поверхности черепа увлажняется.
3. Польские окна региона порошка оксида олова. Прикрепить готовых сверло, которое опускают в аквариум силиконовым герметиком и собращается, в результате чего конической кнут (вставка на рис. 1 полугодие). Силиконовые кнут должен быть готов по крайней мере за день до операции, и стерилизовать 70% изопропанола до использования. Нанесите небольшое щепотка порошка на окно вместе с каплей ACSF (рис. 1 полугодие). Перемешивать раствор в окно на срок до десяти минут, осторожно касаясь кончиком бича движущихся к поверхности черепа. Смыть порошок оксида олова полностью из окна с помощью ACSF и сухой кости тщательно струю воздуха. Неровности поверхности и сторонник чипов кости оставленные бурение на предыдущих этапах, должны быть удалены после полировки (рис. 1 полугодие и 1I). Порошок оксида олова не должны быть стерилизованы.
4. Вырезать квадратных куска нет. 0 остекление немного меньше, чем размер окна. Используйте писец мягко забить отделены горизонтальными и вертикальными линиями в покровным стеклом с использованием прямой край. Затем положите крышку скольжения в чашку Петри и кпОка блюдо на край стола, чтобы отделить осколки стекла. Весь чашке Петри может быть автоклаве для обеспечения стерильности.
5. Поместите соответствующего размера покровного стекла рядом с сухой окна. Нанесите небольшое прикосновение цианакрилатного клея над окном с помощью иглы сломанных деревянных аппликатор хлопок, и быстро нажать нарезанные части покровного стекла поверх клея. Избегайте создания пузырьков под покровного стекла. Аккуратно надавите на крышку стекла на поверхности черепа, и удерживайте в течение нескольких секунд (рис. 1J и 1O). Дайте клею высохнуть в течение 15 минут. Превышение цианакрилатного клея могут быть удалены из верхней поверхности покровного стекла с лезвие скальпеля после его высушивают. Печать края покровного стекла с зубным цементом и образуют слегка приподняты и удерживать воду для погружения линз (рис. 1K и 1O).

4. Восстановление

1. Поместите животное в теплой операции следующие клетки. Мониторингживотное периодически, пока он полностью оправится от анестезии.
2. Если препарат предназначен, чтобы выжить в течение более одного дня, обеспечить бупренорфин (0,03 мкг на грызунах г) для обезболивания. Мы обычно изображение животного хотя бы один день после первоначального внедрения.

5. Подготовка изображений

1. Стабилизация животных на оптический макет для работы с изображениями, используя кадр как руководитель поддержки (Рис. 1L и 1M). Сдержанность аппарат может быть изготовлен из коммерчески доступных компонентов оптико Qioptiq или ThorLabs. Наша отдельная пластина может транспортироваться между хирургическим и двухфотонного изображения люксы с животными, и все физиологические устройств мониторинга собраны в единое целое ^3.
2. Если изображение кровотока желательно, вводят 0,05 мл 5% (вес / объем) флуоресцентных красителей-декстран растворенного в стерильном физиологическом растворе или через хвостовую вену или вены подглазничной для обозначения сыворотке крови (рис. 2A и 2C-2H 4-7. Это должно быть сделано под общим наркозом. Подглазничной администрации вены может быть проще для начинающих, как декстран решения более вязкой. Хвостовую вену может быть трудно найти в темной мышей, а вены заметно снижается после неудачной инъекции. Для визуализации сосудистой с зеленым излучением, использовать изотиоцианат флуоресцеина декстран. Для излучения красного, использовать Texas Red декстран. С высоким молекулярным весом декстраны, краска останется в обращении в течение нескольких часов. Кроме того, животные с эндогенными флуоресцентные метки могут быть отображены непосредственно в соответствующих двухфотонного возбуждения волны. Решение декстран могут быть заморожены в порции для использования в будущем.
3. Аккуратно очистите поверхность окна влажной хлопок наконечником аппликатором.
4. Для длительной визуализации анестезии препараты, вводят внутрибрюшинно раствор стерильной лактата Рингера в объеме 3 мкл на грамм каждые 2 часа, чтобы поддерживать тело жидкости и энергетических потребностей. </ LI>
5. Когда изображение животных в бодрствующем состоянии, подголовники ограничивают лишь несколько часов в то время, чтобы снизить уровень стресса. Вернуть животное в дом клетке между изображениями сессий для пищи и воды.

6. Представитель Результаты

Успешный окно позволит изображений глубине до 250 мкм ниже пиальных поверхности в течение нескольких месяцев. Этот метод был использован для изучения в естественных условиях капиллярного кровотока ^{4, 8,} активации микроглии ^{8, 9,} и дендритные структуры в корковой паренхиме ^8. В одном примере, мы используем двухфотонного изображения, чтобы показать коры сосудистой из наркоза Thy1-желтый флуоресцентный белок (YFP) мыши, после того, как в сыворотке крови помечена внутривенного введения декстрана Texas Red (рис. 2). Dural суда часто видны чуть выше поверхности коры в твердой мозговой оболочки (рис. 2, стрелки). Большой мягкой мозговой оболочки артериол и венул лие на поверхности коры (рис. 2D). Проникающие отделение суда от этой сети поверхность и погружение в коре, где они разветвляются в плотную капиллярного русла, которая кормит корковой ткани (рис. 2, д-2H). Дендритных беседки глубокой YFP выражения корковых нейронов, сигнал эндогенного этой линии мышей, могут быть отображены одновременно во втором канале ¹⁰ (рис. 2, б-2H). Второй гармоники сигнала кости были собраны в третий канал, и может быть использован для оценки толщины разбавленной черепа после сбора изображений стеков (рис. 2, в 2С).

Корковые сосудистой динамика глубокое воздействие анестетиков ^11. Во втором примере мы покажем, видео спонтанного vasoactivity собранные двухфотонной микроскопии от привыкшей спать мыши. Известный колебаний вазомоторный в диаметре просвета видны с пиальных артериол, а не с соседней венулы. Этобазальных спектр vasoactivity уменьшается с ⁴ уретана анестезии. Для количественной оценки спонтанных и вызванных изменениями в кровоток, мы используем адаптирована линия методы сканирования, чтобы захватить как сосудистый диаметр и красных кровяных телец скорости отдельных судов. Подробная ресурсов на количественные изображения кровотока с помощью двух-фотонного микроскопа имеются ^{3, 12.}

Рисунок 1. Порядок окно портов. (К) Изображения последовательных шагов в процедуре создания портов окна. См. текст для подробных инструкций. β = брегмы и λ = лямбда. (L) болт и гайка на голову во время съемки из наркоза препаратов. (М), пользовательских обрабатываются крест крепление головы планку бодрствования препаратов. В этом примере, разъем был имплантирован для повторной записи ЭГ. (N)Схема показывает вид сверху горы головы и положение различных компонентов. Гайки, используемые в панели L предназначен как альтернатива перекладину использования в панели М. Два # 000 саморезов добавляются с поперечиной крепления для дополнительной устойчивости с препаратами проснулся изображений. (O) Схема показывает сечение окна портов.

Рисунок 2. Двухфотонного визуализации сосудистой и нейронные структуры коры мыши. Все изображения были собраны через окно портов в Thy1-YFP мышь через 2 дня после того, как окно имплантации ^10. Максимальный прогноз более 150 мкм ткани в корональной ориентации показывает разбавленной черепа по отношению к сосудистой (A) и дендритов (B). Кости (синий) было обнаружено, собирая второй гармоники флуоресценции при 450 нм излучения с 900 нм возбуждение 6. Дендритные поля нейронов (зеленого цвета) являются эндогенными для Thy1-YFP линии трансгенных мышей. (CH) Максимальная прогнозы более чем на 50 мкм тканей в горизонтальной ориентации на различных глубинах под мягкой. Данные за тот же стек изображение, показанное в панели А и В. Dural суда могут быть видны только выше поверхности коры (стрелка на C).

Сокращения

ACSF = искусственной спинномозговой жидкости
Порты = полированной и железобетонных разбавленной черепа окно
YFP = желтый флуоресцентный белок

^я Убедитесь, что процедуры, описанные утверждаются локальной Уходу за животными и использование комитета.

Discussion

Двухфотонного изображений через окно портов требует передачи через разбавленной костей и твердой мозговой оболочкой, которая ослабляет свет лазера и добавляет оптических аберраций на больших глубинах ^8. Однако, несмотря на этот недостаток, изображения глубиной до 250 мкм ниже пиальных поверхности может быть достигнуто с 900 нм возбуждение. Большая глубина изображения может быть в принципе возможно больше длины волны возбуждения ^13. Основным преимуществом этого метода является отсутствие коры воспаления, которые могут существовать временно в методы, включающие полный краниотомии ^{14, 15.} Хорошо подготовленные портов окна должны показать не явных признаков воспаления кровеносных сосудов и после имплантации ^8. Это может быть оценено в естественных условиях в ходе эксперимента по структуре изображения сосудистой сети, или путем обнаружения морфологических изменений микроглии в CX (3) CR1-GFP мышей линии ^{8, 16, 17.} Кроме того, постфактум immunohistology должны быть всоздана для подтверждения отсутствия astrogliosis в поверхностных мозга, например, с помощью антител для глиального фибриллярного кислого белка ^8.

Наиболее требовательным шагом в создании портов окно истончение костей от 10 до 15 мкм в толщину. Периодическое рассмотрение окна в широком микроскоп флуоресценции рассечение поля также полезны для оценки толщины черепа во время прореживания процедуры. Флуоресцентные метки возле поверхности коры должен быть отчетливо виден сквозь мокрые черепа. Для более точного измерения толщины черепа, второй гармоники сигнала от костей может быть измерена в трехмерном стека при двухфотонной микроскопии (рис. 2, в 2С). Если это будет сделано перед нанесением клея и покровного стекла, кости и может быть далее разбавленной если это необходимо. Недостаточная истончение приводит к плохому глубины изображения. Полировка будет по-прежнему тонкий череп при бурении уже не возможно, и поможетуменьшить неровности поверхности и сторонник чипов кости. В ходе предварительных исследований, мы обнаружили, что полировка улучшает недели глубины изображения после первой имплантации. Тем не менее, тщательный анализ на благо полировка не была выполнена.

Применение цианакрилатного клея и покровного стекла поверх костей является важным шагом к снижению рассеяния света и позволяет для более глубокого изображения. В связи с процессом бурения, поверхность костей будет неравномерным, даже после полировки, и, следовательно, рассеяние света. Применение цианакрилатного клей заполняет эти нарушения и стекла вышележащих крышки оставляет без рассеяния гладкой поверхности. Важно отметить, что показатели преломления для клея и покровного стекла, которые являются 1,45 и 1,52 в соответствии с указаниями производителя, тесно индексируются соответствует этому костной 1,55 ^18. Это улучшение по сравнению с воздухом или водой выше разбавленной черепа, которые имеют показатели преломления 1,00г 1.33. Чрезвычайно важно, цианакрилатного клея дальнейшем помогает препятствовать кости повторного роста. Это дает возможность продольного изображения на срок до трех месяцев, без необходимости дополнительного обслуживания после первой операции.

Вторая причина плохого глубины изображения это повреждение мягкой мозговой оболочки сосудов, ведущих к кровоизлияние или отек. Колебания из скважины должны быть минимизированы. В небольшом проценте случаев, кровоизлияния в оболочки, неизбежны. Это происходит потому, сосудистой мозговой оболочки непрерывно сосудистого сплетения черепа, который нарушается при истончение процедуры. Препараты с любой знак к югу от дурального кровотечения должны быть отброшены как дурального утолщения кровеносных сосудов и за этим последует. Успеха в окно Порты могут быть как 80% с практикой.

Для некоторых экспериментов, может быть необходимо для введения красителей / вирусов или вставить электроды в ткани под окном портов. Можно создать небольшойотверстие рядом с окном, через которое пипетки или электроды могут быть введены использованием стереотаксической руку или Саттер манипулятор ^19. Это отверстие может быть закрыты с костью воск, если животное будет снова отображаемого на будущих сессиях. Тем не менее, введение электродов, конечно, могут привести к воспалению в коре головного мозга и острой патологии, такие как распространение депрессии.

Порты окна должны быть хорошо подходит для любого изображения методом требуется оптический доступ к мозгу. Это включает в себя поверхность методы визуализации, такие как внутренние оптические изображения ²⁰ и лазерной спекл изображения ²¹ срезов или оптических методов, таких как конфокальной ²² или двухфотонной микроскопии ^23. Кроме того, портов, подготовка должна улучшить качество изображения в широком поле транскраниальная методы визуализации, такие как оптической когерентной томографии ²⁴ и ФА микроскопии ^25.

Наконец, порты окнаподходит для визуализации бодрствования животных покровного стекла добавляет жесткости в окно ^4. Головкой для крепления в дальнейшем стабилизировалась за счет введения двух самонарезающий # 000 винтами противоположного полушария до применения стоматологического цемента (рис. 1 л). Привыкание к голове фиксации важно снижение движение животного во время съемки. Новых животных можно постепенно привыкли к сдержанности головы в течение от 3 до 7 дней до изображений, начиная с 15 сеансов мин и работают до нескольких часов.