En polerad och förstärkt Gallrad-skalle Fönster för långsiktig Imaging för mus Brain

Summary

Vi presenterar en metod för att bilda en avbildning fönster i mus skalle som sträcker sig över millimeter och är stabil under månader utan inflammation av hjärnan. Denna metod lämpar sig väl för longitudinella studier av blodflödet, cellulära dynamik, och cell / vaskulär struktur genom att använda två-foton-mikroskopi.

Abstract

Avbildning in vivo av kortikalt funktion kräver optisk tillgång till hjärnan utan störning av den intrakraniala miljön. Vi presenterar en metod för att bilda en polerad och förstärkt förtunnad skallen (portar) fönster i musen skallen som spänner över flera millimeter i diameter och är stabil i månader. Skallen förtunnas till 10 till 15 pm i tjocklek med en handburen borrmaskin för att uppnå optisk klarhet, och därefter täcktes med cyanoakrylatlim och ett täckglas för att: 1) ger styvhet, 2) inhibera benåterväxt och 3) reducera ljusspridning av oegentligheter på benet ytan. Eftersom skallen inte överskrids, är någon inflammation som kan påverka processen som studeras kraftigt. Bildgivande djup på upp till 250 pm under den kortikala ytan kan åstadkommas med användning av två-foton-mikroskopi laserskanning. Detta fönster är väl lämpad för att studera cerebralt blodflöde och cellulär funktion i både sövda och vakna beredningar. Det erbjuder ytterligare ophet att manipulera cellaktivitet med användning optogenetics eller att störa blodflödet i målinriktade kärl genom bestrålning av cirkulerande fotosensibilisatorer.

Protocol

1. Förberedelser för Kirurgi ⁱ

1. Rengör de kirurgiska verktyg genom ultraljudsbehandling i en blandning av Maxizyme och kirurgiska mjölk i ett ultraljud renare. Autoklavera kirurgiska verktyg innan varje experiment.
2. Se till att alla nödvändiga reagenser och förbrukningsvaror finns tillgängliga. En lista av reagens och engångsmaterial tillhandahålls i tabell 2. Reagens och engångsmaterial som kommer i kontakt med exponerad vävnad bör vara steril, om möjligt.
3. Inducera anestesi. Typiska anestetika som är lämpliga för överlevnad studier beskrivs i Tabell 1. Se till kirurgisk plan för anestesi genom att kontrollera på grund av bristande tå nypa reflex. Den optimala åldern av mus är 3 till 6 veckors ålder. De skallar av yngre möss är mjukare och svårare för tunn. Äldre möss har tjockare skallar som kommer att blöda mer under gallring förfarandet.
4. Fästa djuret i en stereotaxisk ram ^1. En lista över kirurgisk utrustning tillhandahålls i tabell 2.
5. Bibehålla kroppen temperaturning vid 37 ° C med användning av en återkoppling regleras rektal sond och värme dynan.
6. Applicera oftalmisk salva för ögonen att behålla fukt.
7. Raka hårbotten med en liten elektrisk rakkniv.
8. Rengöra hårbotten med betadin, följt av svabbning med 70% (volym / volym) isopropanol.
9. Om så önskas, kontrollera att hjärta och andning priser ligger inom ett normalt intervall med hjälp av en pulsoximeter. För en mus, dessa siffror bör inriktas på 10 och 2 Hz, resp.
10. Värma en alikvot av sterilfiltrerad artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) till 37 ° C (125 mM NaCl, 10 mM glukos, 10 mM HEPES, 3,1 _mM CaCl2, 1,3 _mM MgCl2, pH 7,4) (alla kemikalier från Sigma) ^2.

2. Montering av huvudram

1. Avlägsna hårbotten under hela dorsala skallytan med en pincett och kirurgiska saxar. Trimma huden lateralt till kanterna av de temporala musklerna på båda sidor av skallen och eftererior till musklerna i halsen (Fig. 1 A).
2. Använd en skalpell blad för att ta bort den tunna benhinnan från ytan av skallen.
3. Rengör skallen med en fuktig bomull tippas applikatorn och torka skallen ytan med en ström av luft från en damm kan. Applicera sedan ett tunt lager cyanoakrylatlim till hela skallen ytan. Låt limmet torka ordentligt. Detta skikt av lim krävs för korrekt vidhäftning av dentalcement i efterföljande steg. Den cyanoakrylatlim behöver inte steriliseras.
4. Fästa en metall-kontakt till skallytan, bort från området av den önskade fönstret. För sövda preparat kan en liten mutter fästas skallen med en klick cyanoakrylat lim, som senare kan skruvas in i den avbildning inställning med hjälp av en bult (Fig. 1B, 1 liter och 1 N). Täta baksidan av muttern med tejp för att säkerställa att limmet inte kommer in trådarna under anknytning till skallen. Muttern och tejpen bör steriliseras genom autoklavering innan det kirurgiska ingreppet.
5. För vakna imaging preparat bifoga en styvare anpassad kontakt med två fästpunkter (bild 1M och 1 N). Borra två hål i skallen över den kontralaterala kortikala hemisfären med en ½ mm borr Burr, och sedan införa två # 000 självgängande skruv. Dessa skruvar kommer att hjälpa förankra huvudet montera på skallen. Applicera endast ett helt varv på skruven, för att undvika att applicera tryck på den underliggande cortex. Sedan fäster anpassade baren metallen kors med en liten klick cyanoakrylatlim över lillhjärnan. Låt cyanoakrylat limmet torka ordentligt. Denna metall kontakt minskar avsevärt graden av frihet och förenklar omlokalisering av samma avbildning fält i longitudinella studier. Ett stort kors bar ger gott om utrymme för elektrod placering och stimulering av vibrissae. Detaljerade planer för att generera anpassade huvudet fästet och fästanordning finns tillgängliga online (SICS / links.html "> http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). bör Skruvarna och tvärstången steriliseras genom autoklavering innan det kirurgiska ingreppet.
6. Täcka hela skallen ytan med undantag för placeringen av fönstret, med ett skikt av dentalcement (fig. 1C och 1D). Säkerställa att alla exponerade kanter av huden täcks av cement. Komponenterna i dentalcement behöver inte skall steriliseras.

3. Generation av en polerad och förstärkt Förtunnad-skallen (PORTS) Fönster

1. Se till att borra grader är vassa och undvika återanvända dem. Med en låg hastighet på tandläkarborr, tunn 2 mm 2 mm region över somatosensoriska cortex med en ½ mm borr. Växla mellan väta skallen med ACSF och därefter torkning skallen ytan med en mild luftström från en gas dammtrasa, fuktig för kylning och torra för gallring. Detta kräver förtunning genom det spongiösa lagret av skallen, vilket kan blöda, men kan ControllED genom spolning med ACSF (Fig. 1E). Skallen börjar att böjas under det låga trycket hos borren när den är ~ 50 pm, och de pial kärl bör vara synligt genom våt ben (fig. 1 F). Vid denna tjocklek kommer små vita fläckar inom benet blir synliga under några sekunder omedelbart efter den torra skallytan fuktade.
2. Vid denna punkt, tunn benet ytterligare. Använda en långsammare hastighet borr, dvs 1000 rpm, vilket rakar skallytan med endast en lätt beröring. Använd små kontrollerade rörelser samtidigt som du håller borren som en penna och gäller bara kraft i sidled. Benet bör på ~ 10 till 15 | im vid dess slutliga tjocklek (fig 1 g). När benet är tillräckligt tunn, kommer de små vita fläckar i benet inte längre är synlig när den torra skallytan fuktas.
3. Polera fönstret regionen med tennoxid pulver. Bifoga en pre-made borr som har doppats i silikon akvariet tätningsmedel ochdras, lämnar en avsmalnande piska (infälld, figur. 1H). Silikon visp bör beredas minst en dag innan operationen, och steriliseras med 70% isopropanol före användning. Placera en liten nypa pulver på fönstret tillsammans med en droppe ACSF (Fig. 1 H). Skaka slammet över fönstret för upp till tio minuter genom att försiktigt vidröra spetsen av den rörliga piskan till skallen ytan. Spola bort pulvret tennoxid grundligt från fönstret med ACSF och torka benet ordentligt med en svag luftström. Ojämnheter och tillhörande chips ben kvar genom att borra i de tidigare stegen bör tas bort efter polering (Fig. 1H och 1I). Den tennoxidpulvret behöver inte skall steriliseras.
4. Klipp kvadratiska bitar av nr. 0 täckglas något mindre än storleken på fönstret. Använd en skrivare för att försiktigt poäng separerade horisontella och vertikala linjer i locket slip med en rak kant. Placera sedan täckglas i en petriskål och kNock skålen mot en bordskant att separera glasbitarna. Hela petriskål kan sedan autoklaveras för att säkerställa sterilitet.
5. Placera en lämplig storlek täckglas i närheten av den torkade fönstret. Applicera en liten klick cyanoakrylatlim över fönstret med hjälp av spetsen på en trasig trä bomull spets applikator, och snabbt tryck förskurna bit täckglas ovanpå limmet. Undvik att skapa bubblor på undersidan av täckglaset. Tryck försiktigt luckan glaset mot skallen ytan, och håll i några sekunder (Fig. 1J och 1O). Låta limmet torka grundligt under 15 minuter. Överskott cyanoakrylatlim kan avlägsnas från den övre ytan av täckglaset med ett skalpellblad efter att den torkat. Försegla kanterna på täckglaset med dentalcement och bilda en något upphöjd och att hålla vattnet för doppning linsen (fig. 1K och 1O).

4. Återvinning

1. Placera djuret i en varm bur efter operationen. Övervakadjuret regelbundet tills den återhämtat sig helt från anestesi.
2. Om beredningen är avsedd att överleva i mer än en dag, tillhandahålla buprenorfin (0,03 ug per g gnagare) för analgesi. Vi bilden vanligtvis djuret minst en dag efter den första implantationen.

5. Avbildning Framställning

1. Stabilisera djuret på en optisk skärbräda för avbildning med hjälp av ramen som ett huvudstöd (Fig. 1 liter och 1 M). En fasthållningsanordning anordningen kan göras från kommersiellt tillgängliga optomekaniska komponenter från Qioptiq eller ThorLabs. Vår separat platta kan transporteras mellan kirurgiska och två-photon imaging sviter med djuret och alla fysiologiska enheter övervakning samlade som en enhet ^3.
2. Om blodflödet avbildning önskas, injicera 0,05 ml av 5% (vikt / volym) fluorescerande-dextran färgämne löst i steril saltlösning, antingen genom svansvenen eller infraorbitala ven för att märka blodserum (fig. 2A och 2C till 2H 4-7. Detta måste göras under narkos. Infraorbitala ven administration kan vara lättare för nybörjare, eftersom dextran-lösningar är mer viskös. Svansvenen kan vara svårt att lokalisera i mörkt färgade möss, och venen tenderar att kollapsa efter en misslyckad injektion. För avbildning kärlsystemet med grön utsläpp, använd en fluoresceinisotiocyanat dextran. För röd emission, använd en Texas Red dextran. Med hög molekylvikt dextraner, kommer färgämnet förbli i cirkulationen under flera timmar. Alternativt kan djur med endogena fluorescerande markörer skall avbildas direkt på lämplig två-foton-excitation våglängd. Dextranlösningen kan frysas i alikvoter för framtida användning.
3. Försiktigt rengöra fönstret ytan med en fuktig bomull tippas applikator.
4. Vid långvarig avbildning av sövda preparat, injicera sterilt lakterad Ringers lösning intraperitonealt med en volym på 3 pl per gram var 2 timmar för att hålla kroppsvätskor och energibehov. </ Li>
5. När avbildning djur i vaket tillstånd, begränsa nackstödet till endast några timmar åt gången för att minska stress. Tillbaka djuret till hemmet buren mellan avbildning sessioner för mat och vatten.

6. Representativa resultat

En framgångsrik fönster kommer att tillåta avbildning djup upp till 250 pm under pial ytan under flera månader. Denna metod har använts för att studera in vivo kapillärt blodflöde ^{4, 8,} microglial aktivering ^{8, 9} och dendritiska strukturen inom kortikala parenkymet ^8. I ett exempel använder vi två-foton-avbildning för att visa den kortikala vaskulaturen hos en nedsövd Thy1-gult fluorescerande protein (YFP) mus, och efter det blodserum är märkt genom intravenös injektion av Texas Red dextran (fig. 2A). Durala kärl ofta synlig något över den kortikala ytan i dura mäter (fig. 2C, pil). Stora pial arterioler och venoler lie på kortikala ytan (Fig. 2D). Penetrerande fartyg grenen från denna yta nätverk och dyk in i hjärnbarken där de förgrena sig in i en tät kapillärbädd som matar den kortikala vävnaden (Fig. 2E till 2H). Dendritiska verktygshållare av djup YFP som uttrycker kortikala neuroner, en signal endogent för denna mus linje, kan avbildas samtidigt i en andra kanal ¹⁰ (fig. 2B för att 2H). Den andra harmoniska signalen av benet uppsamlades i en tredje kanal, och kan användas för att mäta tjockleken hos den förtunnade skallen efter uppsamling av bild staplar (fig. 2A till 2C).

Kortikala vaskulära dynamik djupt påverkas av bedövningsmedel ^11. I ett andra exempel visar vi en video av spontan vasoaktivitet samlas in av två-foton mikroskopi av en vana vaken mus. Prominenta vasomotoriska oscillationer i lumendiameter ses med en pial arteriol, men inte med en angränsande venol. Dettabasala intervallet vasoaktivitet minskar med uretan anestesi ^4. För att kvantifiera spontana och framkallade förändringar i blodflödet, använder vi anpassade line scanning tekniker för att fånga både den vaskulära diameter och röda blodkroppar hastighet enskilda fartyg. Detaljerade resurser på kvantitativa blodflöde avbildning med två-foton mikroskopi finns ^{3, 12.}

Figur 1. Förfarande för HAMNAR fönster. (A till K) Bilder från sekventiella steg i proceduren för att generera en HAMNAR fönster. Se text för detaljerade instruktioner. β = bregma och λ = lambda. (L) Skruv och mutter för att fästa huvudet under avbildning av sövda preparat. (M) Egen bearbetas cross fäste bar chef för vakna preparat. I detta exempel framställdes ett kontaktdon också implanteras för upprepade electrocorticogram inspelningar. (N)Schematiskt diagram som visar dorsala vy av huvudfästet och positionen av olika komponenter. Muttern som används i panelen L är tänkt som alternativ till korset bar med i panelen M. Två # 000 självgängande skruvar läggas till med tvärslå fäste för extra stabilitet med vakna imaging preparat. (O) Schematiskt diagram som visar tvärsnitt av en PORTS fönster.

Figur 2. Två-foton-avbildning av vaskulatur och neuronal struktur i mus cortex. Alla bilder har samlats in genom en HAMNAR fönster i en Thy1-YFP musen vid 2 dagar efter fönstret implantation ^10. Maximal utsprånget över 150 | im av vävnad i den koronala orientering visar den uttunnade skallen i förhållande till vaskulaturen (A) och dendriter (B). Benet (blå) detekterades genom att samla den andra harmoniska fluorescens vid 450 nm emission med 900 nm excitering 6. De dendritiska områden neuroner (grön) är endogena till Thy1-YFP transgen mus linje. (CH) Maximala prognoser över 50 m av vävnad i den horisontella riktningen på olika djup under Pia. Data är från samma bildstapel visas i paneler A och B. durala fartyg kan vara synliga precis ovanför kortikala ytan (pilen i C).

Förkortningar

ACSF = artificiell cerebrospinalvätska
HAMNAR = polerad och förstärkta förtunnad skallen fönster
YFP = gul fluorescerande protein

^Jag Se till att de beskrivna Förfarandena har godkänts av din lokala institutionella Animal Care and Use Committee.

Discussion

Två-foton-avbildning genom en PORTS fönster kräver transmission genom den förtunnade benet och dura, som dämpar det laserljus och adderar optiska aberrationer på större djup ^8. Trots denna nackdel, kan avbildning djup upp till 250 pm under pial ytan uppnås med 900 nm excitering. Större imaging djup kan i princip vara möjligt med längre exciteringsvåglängder ^13. En stor fördel med denna metod är avsaknaden av kortikala inflammation som kan finnas övergående i metoder innebär full kraniotomi ^{14, 15.} En väl förberedd HAMNAR fönster ska visa några uppenbara tecken på angiogenes och inflammation efter implantation ^8. Detta kan utvärderas in vivo under loppet av experimentet genom avbildning vaskulatur struktur, eller genom att detektera morfologiska förändringar av mikroglia i CX (3) CR1-GFP muslinje ^{8, 16, 17.} Vidare bör efterhand immunhistologi vara perbildas för att bekräfta frånvaron av astroglios i det ytliga cortex, exempelvis med användning av en antikropp för gliafibrillärt surt protein ^8.

Den mest krävande steget vid generering av en PORTS fönster förtunning benet till 10 till 15 pm i tjocklek. Regelbunden undersökning av fönstret under ett brett fält fluorescens dissektionsmikroskop är också bra att mäta skallen tjocklek under gallring förfarandet. Fluorescensmärkningar nära kortikala ytan ska vara klart synliga genom den våta skallen. För en mer noggrann mätning av skallen tjocklek, kan den andra harmoniska signalen från benet mätas i en tredimensionell stapel enligt två-foton-mikroskopi (Fig. 2A till 2C). Om detta görs före applicering av limmet och täckglaset, benet och kan förtunnades ytterligare om så är nödvändigt. Otillräcklig förtunning resulterar i dålig avbildning djup. Polering kommer att fortsätta att förtunna skallen när borrningen inte längre är möjligt, och kommer att hjälpaatt minska ojämnheter och tillhörande chips ben. I preliminära studier har vi funnit att polering förbättrar veckor imaging djup efter den första implantationen. Emellertid har en rigorös analys av nyttan av polering inte utförts.

Tillämpningen av cyanoakrylatlim och täckglas ovanpå benet är ett kritiskt steg för att reducera ljusspridning och möjliggöra djupare avbildning. På grund av borrningsprocessen, kommer ytan av benet vara oregelbunden, även efter polering, och därför ljusspridning. Tillämpningen av cyanoakrylatlim fyller i dessa oegentligheter och den överliggande täckglaset ger en icke-spridning slät yta. Viktigare är brytningsindex för limmet och täckglaset, vilka är 1,45 och 1,52 i enlighet med tillverkarens specifikationer, är nära indexerad matchas med den för ben vid 1,55 ^18. Detta är en förbättring jämfört med luft eller vatten ovanför tunnas skallen, som har brytningsindex 1,00 end 1,33. Kritiskt hjälper cyanoakrylatlim ytterligare hindra ben återväxt. Detta möjliggör longitudinella avbildning upp till tre månader, utan behov av ytterligare underhåll som efter den första operationen.

En andra orsak till dålig ljudbild djup skada pial fartyg som leder till blödningar eller ödem. Vibrationer från borren bör minimeras. I en liten andel av fallen kommer blödning i duran är oundviklig. Detta beror på vaskulaturen av dura mater är kontinuerlig med den vaskulära plexus av skallen, vilket är störd under gallring förfarandet. Preparat med några tecken på sub-dural blödning bör kasseras som dural förtjockning och angiogenes kommer att följa. Framgången av portarna fönstret kan vara så hög som 80% med praxis.

För vissa försök kan det vara nödvändigt att injicera färgämnen / virus eller sätt elektroder in i vävnaden under HAMNAR fönstret. Det är möjligt att generera en litenhål intill fönstret, genom vilket pipetter eller elektroder kan införas med användning av en stereotaktisk arm eller Sutter manipulatorn ^19. Detta hål kan tätas med benvax om djuret skall avbildas på framtida sessioner. Emellertid införandet av elektroderna kan naturligtvis leder till inflammation i cortex och akut patologi såsom spridande depression.

Portar fönster ska vara väl lämpad för alla avbildningsmodalitet kräver optisk access till hjärnan. Detta inkluderar tekniker yta avbildning som inneboende optisk avbildning ²⁰ och laser speckle avbildning ^21, eller optiska Sektioneringspunkter tekniker såsom konfokal ²² eller två-foton mikroskopi ^23. Vidare bör en HAMNAR preparatet förbättra upplösningen i breda fält transkraniala avbildningstekniker, såsom optisk koherens tomografi ²⁴ och fotoakustisk mikroskopi ^25.

Slutligen är PORTS fönsterlämplig för avbildning av vakna djur som täckglaset lägger styvhet till fönstret ^4. Huvudfästet är ytterligare stabiliseras genom införande av två självgängande # 000 skruvar till den kontralaterala hemisfären före applicering av dentalcement (fig. 1 liter). Tillvänjning till huvud-fixering är viktig på minskad djurförflyttningar under avbildning. En ny djur kan gradvis vänja sig vid huvudstödets under en period av 3 till 7 dagar före avbildning, som börjar med 15 min sessioner och arbetar upp till flera timmar.