Summary
생리와 병리 설정에서 치료 화합물을 평가하는 데 사용할 수있는 피부 상처 치유의 쥐 모델.
Abstract
상처 치유 및 복구는 인간의 삶에서 발생하는 가장 복잡한 생물학적 과정이다. 부상 후, 여러 생물 학적 경로가 활성화됩니다. 예를 들어, 당뇨병 환자에서 발생하는 손상 상처 치유, 같은 절단 등의 심각한 불리한 결과를 초래할 수 있습니다. 상처 복구를 촉진 새로운 에이전트를 개발하기 위해 증가 자극 그러므로 있습니다. 이러한 테스트는 이러한 종종 비실용적 돼지와 같은 큰 동물 모델에 국한되어 있습니다. 그들은 경제적 인 기계적인 조사를 허용 유전자 조작, 의무이기 때문에 쥐, 이상적인 전임상 모델을 나타냅니다. 그러나, 그것은 주로 수축을 통해 발생할 때 마우스 치유가 인간의 근본적으로 다른 상처. 우리의 생쥐 모델은 상처 주위에 부목을 통합하여이를 극복한다. 상처를 부목으로 복구 프로세스가 긴밀를 반영 상피, 세포 증식 및 혈관 신생, 그때 의존인간의 상처 치유의 생물학적 처리합니다. 일관성과 치료를 필요로하는 반면,이 쥐 모델은 복잡한 수술 기법을 포함, 예를 들어, 혈관 신생을 촉진하거나 염증을 억제 할 수 유망한 에이전트의 강력한 테스트를 할 수 없습니다. 두 개의 상처가 준비되어 더욱이, 각각의 마우스 시험 화합물과 같은 동물에 차량 제어 모두의 응용 프로그램을 사용, 자신의 제어 역할을합니다. 결론적으로, 우리는 인간의 그것과 비교할 상처 치유의 실제, 배우기 쉬운, 강력한 모델을 보여줍니다.
Introduction
손상된 상처 치유 중요한 병적 상태와 세계적으로 사망에 대한 책임이며, 이는 당뇨병 1,2의 환자에 특히 사실이다. 인간, 상처 치유는 3 중복 의미가있는 프로세스의 연속이다. 직후에 남긴 상처, 염증 프로세스가 시작됩니다. 염증 세포는 세포 증식, 이동 및 혈관 신생 과정을 촉진 인자를 놓습니다. 재 상피화 및 새로운 조직의 형성 이후에 같은 콜라겐 매트릭스 단백질의 세포 사멸하고 다시 조직을 모두 수반 개조의 단계가있다.
상처 치유의 복잡성은 현재 체외에서 복제 된이 동물 모델의 사용을 필요로 할 수 없습니다. 지금까지, 상처 치유 연구는 치료 과정은 동일하고 인간에게 비교를 보장하기 위해, 같은 돼지 같은 큰 동물 모델에 한정되어있다. 그러나 큰 애니을 사용하여이러한 연구를위한 LS 집에 어려울 항상 실제 4 수 없습니다 수 있습니다. 실험실 쥐 쉽게 유전자 5-7 역학적 조사 조작 할 수있는 경제적 인 동물 모델을 나타냅니다. 그러나 생쥐 상처 수축 8의 과정 차적으로 인해 인간의 다르게 치료. 이것은 부분적으로 인간에서 크게 결석 panniculus carnosus라는 광범위한 피하 횡문근 층 때문입니다. 마우스,이 근육 층은 피부가 독립적으로 깊은 근육의 이동 할 수 있으며 피부 아래에 입힐 수있는 총알의 급속한 수축에 대한 책임이 있습니다.
이 제한을 극복하기 위해, 쥐 상처 치유는 부목을 사용한다 (그림 1) 8,9에 의해 인간의 상처 치유를 복제하도록 구성 할 수 있습니다. 이 비디오에서 우리는 다시 epithelializa의 인간 프로세스를 상처 수축을 제거하고 더 가깝게 근사 splinted 쥐 상처 모델을 보여TION 및 새로운 조직의 형성. 이 모델에서 panniculus carnosus을 포함 두 개의 전층 절개는 마우스의 정중선의 양쪽에 배부 한에 생성됩니다. 실리콘 부목은 접착제의 도움으로 상처 주위에 배치하고 부목는 중단 된 봉합사로 고정되어 있습니다. 각 마우스함으로써 동물의 수를 줄이고, 하나의 상처를 치료하고 다른 차량 제어를받는과 함께 자신의 제어 역할을합니다. 국소 응용 프로그램에 따라 투명 폐쇄성 드레싱이 적용됩니다. 또한 국소 응용 프로그램 및 / 또는 상처 영역 10,11의 측정을 위해 필요한 경우 드레싱을 제거 할 수 있습니다. 에서 실험 완료, 상처 봉합, 형태 학적 구조와 신생 혈관의 정도는 면역에 의해 평가 될 수있다. 이 경제 모델을 수행하기 쉬운 또한 당뇨병이나 다른 pathophysiologies의 맥락에서 상처 치유를 평가하기 위하여 이용 될 수있다.
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Protocol
1. 부목 및 폐색 드레싱의 준비
- 0.5 mm 두께의 실리콘 시트 및 사용 가위 나 실리콘 디스크를 만들 수있는 생검 펀치에 10mm 원을 설명합니다.
- 센터 10 밀리미터 원의 중간에 5mm 생검 펀치 부목으로 사용되는 디스크처럼 - "도넛"을 형성하는 구멍을 만들기 위해 단단히 누르십시오.
- 이러한 Opsite 및 원형 드레싱을 만들 때 사용하는 가위로 투명 폐색 드레싱에 10mm 원을 설명합니다.
2. 실험 동물
- 수행 할 모든 실험 동물 윤리위원회의 승인을 얻습니다.
- 상업 개종 (예를 들어, 잭슨 연구소)에서 8 주 이전 (22~26g) 남성 C57BL/6J 마우스를 사용합니다.
- 21의 표준 조건에서 쥐를 유지 ° C와 음식과 물을 무료로 액세스 할 수있는 12 시간 빛 어두운주기.
- (선택 사항) : 당뇨병은 알약 복강 인제로 6~7주 오래된 마우스에서 유도 될 수정기적으로 혈당 모니터링 (AccuChek glucometer에)에 의해 확인 된 고혈당과 165 ㎎ / ㎏ 스트렙토 조 토신 (구연산 버퍼, 산도 4.5)의 ction의. 당뇨병 쥐 다뇨가있을 수 있습니다 그래서 그들의 침구 습기를 제거하고 가중치를 면밀히 모니터링해야 더 자주 변경해야 할 수 있습니다.
3. 마취 및 수술 준비
- 100 % 산소 isoflurane을 5 %을 (유량 1 L / 분)을 사용하여 전신 마취를 유도하고 isoflurane을 1-3%을 사용하여 마취를 유지합니다.
- 억제 된 마우스의 깊은 페달 반사를 확인하고 발생하기 쉬운 위치에 마우스를 놓습니다.
- 더 뒤로 아래로 두 견갑골 사이 3cm로 목 기지에서 가위로 털을 제거하여 수술 영역을 준비합니다.
- 탈모 크림 라이트 응용 프로그램은 2 분 이상 더 이상 적용 할 수 있습니다. 젖은 거즈 면봉은 모든 크림을 보장 할 수 있으며, 나머지 모피가 제거됩니다.
- 로 피부를 닦아알코올 면봉와 10 %의 두 응용 프로그램 포비돈 요오드 (베타 딘)과 마우스를 주름 잡아 드리운다.
4. 절단 및 상처의 부목
- 쥐 상처 치유 모델의 도식 표현은 그림 1에 제시되어있다.
- (그림의 2A-2B 참조) 어깨 높이에서 마우스의 정중선의 양쪽에 상처 두 개의 원형 패턴을 설명하기 위해 멸균 4mm 생검 펀치를 사용합니다.
- 개요 및 panniculus carnosus (그림 2E) 등의 피하 조직 (그림 2C-2D)를 통해 확장 전층 상처를 만들 수 홍채 가위의 중간에 피부를 들어 올려 톱니 모양의 집게를 사용하고, 소비세 원형 조각 조직의.
- 정중선 (그림 2F)의 반대편에 상처 과정을 반복합니다.
- 실리콘 부목의 각 측면에서 플라스틱 보호 코팅을 제거합니다.
- cyanoacryla을 적용테 접착제 (예를 들어, 최고 접착제 또는 크레이지 접착제) 실리콘 부목의 한쪽.
- 센터 상처에 부목 (그림 2G) 및 앵커 위치 (그림 2H)을 보장하기 위해 중단 된 6-0 나일론 봉합사로 부목.
- 다른 상처에 부목 과정을 반복합니다.
- 이 시간 시점에서 필요한 경우, 하나의 상처 (그림 2I), 그리고 다른 차량 제어를 테스트 할 치료 화합물 (100 μL)을 적용합니다.
- 투명 폐색 드레싱 (예를 들어, OpSite) (그림 2J-2K)으로 상처를 덮습니다.
- 통치자는 부목 아래에 배치 현미경이 (2리터 그림) 촬영됩니다.
6. 수술 후 관리
- Carprofen은 (5 ㎎ / ㎏) 수술 후 통증 완화를 위해 서브 피부 주사를 통해 매일 한 번 관리됩니다.
- 수술 동물은 개별적으로 갇힌 및 열 미터에서 유지 한 후ATS가 완전히 회복 될 때까지.
- 통증과 체중 감소의 증상에 대한 회 동물을 모니터링 할 수 있습니다. 우리가 통증이나 체중 감소의 더 심한 행동 디스플레이를 관찰합니다.
7. 상처 측정 및 치료
- 상처는 매일 측정 할 수 있습니다.
- 5 % isoflurane을 가스 (유량 1 L / 분)을 사용하여 전신 마취를 유도 한 후 마우스의 깊은 감각 반사 보장은 1-3 %의 isoflurane을 사용하여 표시되지 않습니다.
- 집게로 조심스럽게 껍질 폐색 드레싱.
- 상처 직경을 측정하기 위해 수술 캘리퍼스를 사용합니다. 우리는 X, Y 및 Z 축 (그림 2m-2O)뿐만 아니라 나중에 참조 할 수있다 (그림 2 P)에 대한 현미경 따라 3 개의 측정 값의 평균을 가지고 간다.
- 선택 사항 :이 때 동물이 레이저 도플러 영상 (그림 2 분기)를 사용하여 혈액 관류에 대한 평가 할 수 있습니다.
- 치료 화합물 및 차량 제어를 다시 응용 프로그램 perfor 수 있습니다이 시점에서 의대.
- 깨끗하고 투명한 폐쇄성 드레싱 후 다시 적용하고 완전히 회복 될 때까지 동물은 따뜻하게 유지됩니다.
- 참고 : 부목이 제대로 확보되지 않을 경우 상처는 쉽게 계약 할 것이다 (그림 2R).
8. 조직 학적 분석
- 마취의 과다 복용 10 일 후에 쥐를 안락사.
- 집게를 사용하고 메스 칼날이 껍질 멀리주의 부목 봉합을 제거합니다.
- 주위 상처 영역에서 폭, 전체 절제술을 만들고 인산 4 % 파라 포름 알데히드의 조직을 배양하기 위해 홍채 가위를 사용하여 4 ° C에서 하룻밤 (PBS) 염분 버퍼.
- ° C -80에서 단층 화합물 및 동결의 조직과 장소에주의 dabbing하여 과량의 용액을 제거 ° C. 4에서 추가로 24 시간 동안 PBS 용액에 17 % 자당에 조직을 전송
- 헤 마톡 실린과 에오신 염색은 상처 구조와 상피 차이를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. Neovascularisation은 모세 혈관의 수 (폰 빌레 브란트 인자를 사용)를 결정하기 위해 면역 조직 화학 분석에 의해 평가 될 수있다.
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Representative Results
(주 0 직경 / 일 X 지름) - 상처 폐쇄 곡선은 상처의 평균 직경을 계산하여 백분율, 즉 100로 결과를 표현 의해 결정됩니다. 이 실험에서 치료 화합물 (또는 차량 제어)는 상처에 매일 적용되었다. 치료 화합물을 크게 가속 상처 봉합 (그림 3). 그것은 부목의 제거가 빠른 상처의 수축 (그림 2R)으로 이어질 인간의 관찰 상처 치유의 패턴에서 분기되므로 부목은 실험 기간 동안 유지해야하는 것이 중요하다.
그림 1. 쥐 상처 치유 모델의 도식 표현.이 모델에서는 두 가지 전체 두께 상처 경사에 작성됩니다각 마우스가 자신의 제어 역할을 할 수 있도록 정중선의 거기 쪽. 실리콘 부목은 인간의 그것과 복제 모델을 제공, 상처 수축을 방지하기 위해 상처 주변에 부착하고 봉합합니다.
그림 2. 상처 치유 수술과 수술 후 측정. 요오드와 알코올로 피부의 머리 제거 및 준비 다음은 (AB) 생검 펀치 부드럽게 정중선의 어느 것이 든 측, 배부에 두 개의 원을 설명하는 데 사용됩니다. (C) 작은 절개 그런 다음 생성되고 (D) 피부의 원형 조각 (E) (F) 두 개의 전층 상처를 만들 수 panniculosus carnosus, 등 제거됩니다. (G) 접착제는 다음 silic에 적용됩니다 하나의 부목과 부목은 상처 주변에 부착. (H) 부목은 다음 봉합으로 고정되어 있습니다. (I) (접착 할 수있는 치료는 국소 적으로 적용되고 (JK) 폐색, 투명 드레싱은 상처 위에 배치되고 부목을 준수 필요한 경우)를 사용. (L) 현미경 사진 매일 촬영하고 상처 영역 (m) Y-축 (N) x 축과 (O) z 축에 세 개의 직경 측정의 평균으로 계산된다. (p 하루에 10에서 상처) 대표 사진, 치료 화합물로 처리 된 오른쪽에 작은 상처 지적. (Q) 상처의 혈액 관류의 대표 레이저 도플러 이미지 일 6시. (R) 예 빠른 상처 실리콘 부목 제거 후 수축.
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그림 3. 대표 상처 폐쇄 그래프. 상처 영역은 X, Y 및 Z-축을 따라 세 가지 매일 직경 측정의 평균으로 계산된다. 상처 봉합은 0 일에서 초기 상처 영역의 백분율로 표시됩니다.
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Discussion
이 피부 상처 치유의 실험 쥐 모델입니다. 이 모델의 중요한 특징은 인간의 발생 과정이 유사하고, 재 상피화 및 새로운 조직의 형성이 발생할 수 있도록 상처 수축을 방지하는 실리콘 부목의 사용이다. 이 모델은 다목적 생리적 및 병리 모두 (예를 들면 당뇨병) 설정에서 상처 치유를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 모델은 경제적 인 환경에서 잠재적 인 상처 치유 나 혈관 치료를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 자신의 컨트롤로 작동하는 각각의 마우스로, 동물의 수는 최소화됩니다. 이 모델에 필요한 수술 기법 따라서이 모델은 널리 비교적 적은 수술 경험을 가진 사람들에 의해 사용될 수 있습니다, 매우 정교한하지 않습니다.
그것은 부목이 적절하게 준수하고 봉합과 피부에 정박하는 것이 필수적이며, t 그 재현성과 정확한 정량을 보장하기 위해여기에 두 개의 상처를 만드는 사이의 지연을 최소화입니다. 쥐 상처의 성향이 빠르게 때문에 마우스 부목을 매일 모니터링을 필요로 긁어 부목 또는 부분 제거 다음과 같은 완화를 계약한다. 접착제의주의 응용 프로그램은 또한 긁힘 촉진 할 수 부목의 주위에 건강한 피부의 자극을 최소화하기 위해 필요합니다. 그것은 무균 기술을 따라 철저하게 쥐 사이의 장비, 특히 캘리퍼를 소독하는 것도 매우 중요합니다. 상처가 매일 처리 또는 옷을 입고 될 수 없습니다 특히 폐쇄성 드레싱의 응용 프로그램은 또한 고려되어야한다. Opsite 및 Tegaderm (3M) 드레싱 12 비교하고, 그것이 Tegaderm 드레싱은 단지 1-2 일 동안 부착 남아있을 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 장기 상처 드레싱 다른 방법이 정 및 동료 (13)에 의해 설명 된 요구해야한다.
이 모델의 잠재적 인 약점 염증 D를 포함 할 수있다 봉합 고정하는 단말, 상처 및 전신 순환에 치료의 항목 사이의 치료 나 차량의 확산. 지역의 염증을 유도 봉합에 관해서, 봉합 상처 상대적으로 멀리 배치하고 각각의 상처는 상처 사이의 유사해야합니다 발생할 수 있습니다 같은, 따라서 모든 염증을 만들어 때문입니다. 마찬가지로, 상처와 상처 간의 부종의 부족 사이의 거리가 두 침대 사이의 확산을 최소화한다. 치료 컨트롤의 치유 9,10 상처를 가속화 할 수 있습니다 전신 순환을 입력 할 수있는 몇 가지 증거가있다. 전신 순환을 입력 처리의 범위를 결정하기 위해 littermate 마우스는 두 상처 만 차량으로 처리되는, 활용 될 수있다. 상처 만 차량과 치료 생쥐 사이에 폐쇄하고, 차량 및 치료를 모두받은 마우스의 속도의 차이는 그와 비교 될 수있다.
"> 결론적으로, 우리는 인간의 상처 치료에서 관찰 된 많은 기능을 전시 상처 치유의 비교적 간단한 쥐 모델을 증명하고있다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
저자는 국민 건강과 호주의 의학 연구위원회 (NHMRC) (: 632512 프로젝트 부여 ID)의 자금 지원을 인정하고 싶습니다. 루이스 던은 국립 심장 재단 경력 개발 원정대에 의해 NHMRC 초기 경력 친목과 크리스티나 Bursill에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick | Invitrogen | P18178 | Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter |
| Biopsy punch 5 mm | Steifel | BC-B1-0500 | To outline wound area to be excised |
| Vannas scissors 8.5 cm curved | World Precision Instruments | 501232 | For wound incision and excision |
| Dumonte #7b forceps, 11 cm | World Precision Instruments | 501302 | To grip skin when creating incision and excising skin |
| Graefe forceps, serrated 10cm | World Precision Instruments | 14142 | To help attach silicone splint to skin |
| Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm | World Precision Instruments | 14132 | |
| Malis forceps, smooth, straight, 12 cm | Codman and Shurtleff, Inc (J&J) | 80-1500 | To suture the silicon rings to the skin |
| Ruler, 0.5 mm gradation | n/a | ||
| Calipers 0.25 mm gradation | Duckworth and Kent | 9-653 | To measure wound area |
| Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m | Smith & Nephew | 66030570 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Pfizer | 462986 |
References
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