Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Amid-Kupplungen von Isonicotinsäure und Diaminoalkane zu Brückenliganden, die zur Verwendung in der Synthese von mehrkernigen Platinkomplexe, welche Aspekte der Antikrebs-Arzneimittel und BBR3464 picoplatin kombinieren bilden.
Introduction
Platin-Antikrebsmittel weiterhin eine der am weitesten verbreiteten Familie der Mittel bei der Behandlung von menschlichen Krebs 1. Trotz ihres Erfolgs sind, werden sie in ihrer Anwendung durch schwere Dosis-limitierenden Nebenwirkungen 4.2 beschränkt. Die begrenzten Dosen, die an Patienten verabreicht werden können, bedeutet auch, dass Tumoren können Widerstand 5 zu entwickeln. Als solche neue Medikamente weiterhin entwickelt, um die Nebenwirkungsprofil zu verbessern und zu überwinden erworbenen Resistenz, wie phenanthriplatin 6 und 7 phosphaplatin werden.
In den späten 1990er Jahren wurde ein dreikernigen Platin-Medikament entwickelt, BBR3464 (Schema 1) 8, das ist bis zu 1.000 x zytotoxischer in vitro als der führende Platin-Medikament Cisplatin. BBR3464 ist auch in der Lage, erworbene Resistenz in einem Panel von menschlichen Krebszelllinien 9 zu überwinden. Leider ist die erhöhte Aktivität der BBR3464 um 50 abgestimmt - bis 100 - fach höhere Toxizität, dieschränkt seine Verwendung 10-12. Es ist auch leicht im Körper abgebaut, was bedeutet, wenig von der Droge erreicht Krebszellkerne intakt 9.
Picoplatin ist ein mononuklearen Platin-basierten Medikament, das eine 2-Methyl-Pyridin-Liganden (Schema 1) 13 enthält. Die Methylgruppe des Arzneimittels schützt sie vor dem Angriff von biologischen Nukleophilen; insbesondere Cystein und Methionin enthält Peptiden / Proteinen 14-16. Als solches ist das Medikament sehr stabil und hat eine wesentlich höhere Konzentration, verglichen mit sowohl BBR3464 und Cisplatin 17 Krebszellkerne erreicht. Seine reduzierte Reaktivität bedeutet auch eine höhere picoplatin maximal verträgliche Dosis verglichen mit BBR3464 und Cisplatin 10,18,19.
Dieses Projekt daher versucht, die Eigenschaften von BBR3464 picoplatin und kombinieren, um neue Medikamente, die in der Lage, erworbene Resistenz, die eine verbesserte biologische Stabilität und weniger schwere Neben effe anzuzeigen überwinden produzierenCTS (z. B. Fig. 1). Dabei wurde eine Reihe von zweikernigen Platinkomplexe mit Bispyridin Brückenliganden 20 hergestellt. Die Liganden werden mit Amidkupplungsreaktionen mit Isonicotinsäure, oder dessen Derivate, wie 2-Methyl-isonicotinsäure variabler Länge Diaminoalkane gemacht. Umsetzung von einem Mol-Äquivalent des Liganden mit zwei Moläquivalenten Transplatin ergibt die gewünschte Platin-Komplexe (Schema 1).
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Protocol
1. Synthese von N, N '-. (Alkan-1, n-diyl) diisonicotinamide
- Trocknen Sie einen einzigen Hals-oder Dreihalskolben in einem Ofen (100 ° C, 1 h), um sicherzustellen, dass alle Feuchtigkeit entfernt.
- Hinzufügen festen Isonicotinsäure, oder dessen Derivat, in den Kolben mit einem magnetischen Rührstab. Wenn das Diaminoalkan Ligand (en) sind Feststoffe bei Raumtemperatur, dann 0,5 Mol (bezogen auf die Anzahl Mole des Isonicotinsäure) wird in den Kolben in dieser Stufe zugegeben.
- Kappe der Hals (s) des Kolbens mit einer Gummimembran und Ersetzen der Luft im Kolben mit Stickstoff entweder durch einen kontinuierlichen Stickstoffstrom oder durch den Einsatz von Stickstoff gefüllten Ballons.
- Verwenden Sie eine Injektionsnadel und eine Spritze zu wasserfreiem Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid (4 ml pro 500 mg Isonikotinsäure oder 2-Methyl-Isonikotinsäure) hinzufügen, um den Feststoff zu lösen. Wenn die Feststoffe nicht leicht zu lösen, dann erhitzt man die Lösung sanft.
- In 7 Mol-Äquivalenten (zu der einBerg der Isonikotinsäure verwendet) Triethylamin (schwache Base) und 0,5 Mol-Äquivalenten der Diaminoalkan. Wenn die Lösung eine Flüssigkeit bei Raumtemperatur, dann fügen Sie 1,5 Moläquivalente.
- In einem Mol-Äquivalent 1-Propylphosphonsäureanhydrid (Kopplungsmittel) unter ständigem Rühren, die die Reaktion auf über 5-12 h abzuschließen.
2. Reinigung der Liganden
- Für Bispyridin Liganden unter Verwendung Diaminoalkan Liganden mit 10 oder mehr Methylengruppen, warten Sie auf die Produkte aus der Lösung ausfällt als die Reaktion fortschreitet.
- Für Bispyridin Liganden unter Verwendung Diaminooctan, fällt das Produkt durch Zugabe von ~ 40 ml Wasser.
- Für Bispyridin unter Verwendung Diaminoalkane von zwei bis sechs Methylengruppen, fügen ~ 40 ml Wasser und erlaubt es, die Verbindungen über 1-3 Tage kristallisieren.
- Sammeln jedes Bispyridin-Liganden durch Vakuum-Filtration und Rekristallisation von etwa 400-500 ml kochendem Wasser pro 200mg Ligand. Hinweis: Mehr Wasser für die längeren Bispyridin Liganden aufgrund ihrer stark reduzierten Wasserlöslichkeit erforderlich ist.
- Mit NaOH und KOH (pH 9) zu der Lösung, um sicherzustellen, daß die Verbindungen frei von Basen nach Umkristallisation.
3. Synthese und Reinigung von den zweikernigen Platin-Komplexe
- Vollständig auflösen trans diamminodichloridoplatinum (II), Transplatin, in heißem (70-80 ° C) Wasser (150 ml pro 200 mg Transplatin) eine klare stark gelb gefärbte Lösung zu erzeugen.
- Fügen Sie eine 0,5 Mol Äquivalent der Bispyridin Liganden und rühren Sie die Lösung bei der Temperatur, bis die Liganden löst sich (klare Lösung). Warten Sie, bis die Lösung nahezu farblos drehen, schalten Sie die Hitze, und bei Raumtemperatur für ein paar zusätzliche Stunden.
- Das Lösemittel wird durch Rotationsverdampfung, die eine gelb gefärbte Pulver erhalten wird.
- Zu reinigen, die Platin-Komplex (es) durch Auflösen in einer minimalen Menge von warmem Wasser (~ 50 &# 186; C). Wenn restlichen gelb oder weiß gefärbt Feststoffe vorhanden sind, dann filtern diese aus.
- Hinzufügen von Aceton zu der Lösung, bis ein weißer Niederschlag gebildet wird, der auf eine polymere Form der Metallkomplexe zu sein scheint und für bis zu 10% des Reaktionsproduktes. Die Zugabe von Aceton (~ zusätzliche 20-30 ml), bis kein Niederschlag mehr erscheint. Hinweis: Diese weiße Niederschlag ist eine Verunreinigung.
- Entfernen Sie diesen Niederschlag durch Filtern der Inhalte durch Nylon-Filterpapier (0,2 um Porengröße) und Rotationsverdampfung des restlichen Lösung zur Trockene, die ein reines Produkt erhalten wird. Hinweis: Falls erforderlich, können dann zusätzliche Acetonpräzipitation Schritte, bis der Komplex ist reine durchgeführt werden.
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Representative Results
Die Bispyridin-Liganden und ihre jeweiligen Zweikernplatinkomplexe werden durch 1 H-, 13 C-und 195 Pt-NMR (Tabelle 1 und 2) und Elektrospray-Ionisations-Massenspektroskopie charakterisiert. Genaue Schmelzpunkte können unter Verwendung der Differentialscanningkalorimetrie und Reinheit wird am besten durch Elementaranalyse für C, H und N-Anteil bestimmt werden. Von den meisten Einsatz ist 1 H-NMR, wie es ist schnell und einfach zu bedienen, so dass innerhalb weniger Minuten von der Isolierung der Endprodukte mit Resonanzen, die definitiv nachweisen können, erfolgreich Amidkupplung und Platinkoordinations (Tabellen 1 und 2).
Isonikotinsäure hat drei Resonanzen; zwei Dubletts in der aromatischen Region (7 bis 9 ppm) und eine sehr breite Resonanz etwa 13 ppm für das Carbonsäureproton. Die Diaminoalkan Protonenresonanzen sind im aliphatischen Bereich zwischen 1 und 4 ppm liegt. Wie ter Länge der Kette zunimmt Diaminoalkan viele der Methylenresonanzen äquivalent, und als solche sind weniger Spitzen in der aliphatischen Region beobachtet als erwartet; obwohl sie deutlich intensiver und lose durch ihre Integration (Tabellen 1 und 2) zugeordnet werden. Siehe beispielsweise Fig. 1 und 2 für die chemische Struktur und die 1 H-NMR-Spektren des N, N '- (Octan-1 ,8-diyl) bis (isonicotinamid) biao, Liganden. Aufgrund der Symmetrie im Molekül fünf aliphatische Resonanzen normalerweise für biao erwarten; aber die vier innersten Methylenpeaks sind magnetisch äquivalent und zeigen sich als eine große Resonanz bei etwa 1,2 ppm.
Das Amin Protonenresonanz der ungekoppelten Diaminoalkan Kette in der aliphatischen Region und ist die wichtigste Resonanz wenn es sich bewegt deutlich zu tiefem Feld in dem aromatischen Region, die bei der Kupplungs to die Carbonsäure. Die anschließende Amid-Protonen-Resonanz ist um 8,7 ppm für alle diese Liganden angesehen, da ein relativ breites Triplett-Resonanz (Abbildung 2).
Koordination der Platin-Gruppe zu den Bispyridin Liganden wird durch gezielte Verschiebungen von aromatischen Resonanzen des Liganden (0,15 ppm tieffeldverschoben der Ha Resonanzen und 0,07 ppm Hochfeldverschiebung der Hb-Resonanzen) und die Einhaltung der Platin-Kopplung auf dem Wams Resonanz für die beobachtete Protonen Ha (Abbildung 3). Die Koordination der Platin-Gruppen zur Bispyridin Ligand kann auch einfach mit 195 Pt-NMR beobachtet werden. Die chemische Verschiebung eines Platinresonanz direkt auf die Arten von Atomen koordiniert 21 zusammen. Chlorido Liganden verschieben 195 Pt-Resonanzen zu tiefem Feld (in Richtung 0 ppm) und bin (m) ino-Liganden verschieben die Resonanzen hohem Feld (Richtung -2500 ppm). Die zweikernigen Platin-Komplexe synthetisiert zeigen hier eine einzige r esonance um -2300 ppm aufgrund der 3 x am (m) und 1 x ino Chloridoliganden Koordinationszustand (Abbildung 4) 22. Nicht umgesetztes Transplatin Verunreinigung würde als Resonanz zeigen rund -2100 ppm, während, wenn zwei Liganden mit einem einzelnen Molekül Transplatin (4 x am (m) ino-Umgebung) umgesetzt, dann würde diese Verunreinigung von -2400 ppm hochfeld 22 sein.
Schema 1 Die chemischen Strukturen der Platin Drogen picoplatin und BBR3464 und die allgemeine Syntheseschema für die Synthese der Bispyridin Liganden und ihren jeweiligen zweikernigen Platin-Komplexe. R = H oder CH 3; . n = 1-6 Gegenionen für die Platinkomplexe wurden weggelassen; durch die Verwendung der hier beschriebenen Methode sind sie dichlorid Salze.
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Abbildung 1 Die chemische Struktur des N, N '-.. (Oktan-1 ,8-diyl) bis (isonicotinamid)-Liganden, Biao und die Protonennummerierungsschema für die Zuordnung der Resonanzen im 1 H-NMR Hinweis verwendet die Äquivalenz der vier Methylenprotonen (He) in der Mitte des Moleküls.
Abbildung 2 Die 1 H-NMR (DMSO-d 6, 400 MHz)-Spektrum von N, N '-. (Octan-1 ,8-diyl) bis (isonicotinamid) biao beachte die Lage der Triplett-Amid-Resonanz bei etwa 8,7. ppm, bis 1-2 ppm für die Diaminooctan Amin Resonanz vor der Kupplung.
3. Das 1 H-NMR (D 2 O, 400 MHz)-Spektrum von trans-[{Pt (NH 3) 2 Cl} 2 μ Biao] 2 +. Hinweis Platin Kupplung am aromatischen Ha-Resonanz bei 8,82 ppm.
4. Die 195 Pt-NMR (D 2 O, 400 MHz)-Spektrum von trans-[{Pt (NH 3) 2 Cl}. 2 μ Biao] 2 + Beachten Sie die einzige breite Resonanz um -2300 ppm, die im Einklang mit einer PtN 3 Cl Umfeld; N = am (m) ine.
Tabelle 1 Die 1 H-NMR-Charakterisierungsdaten der Bispyridin Liganden in DMSO-d 6 bei 400 MHz d = Dublett.. t = Triplett; q = Quartett; m = Multi.
Tabelle 2. Die 1 H-NMR-Charakterisierungsdaten der zweikerniger Platinkomplexe in D 2 </ Strong> O bei 400 MHz d = Dublett. t = Triplett; q = Quartett; m = Multi.
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Discussion
In dieser Arbeit haben zweikernigen Platin-Komplexe als potentielle Antikrebsmittel synthetisiert. Dabei wurden Bispyridin Brückenliganden über eine Amid-Kupplungsreaktion mit Isonikotinsäure und variabler Länge Diaminoalkane synthetisiert. Zuvor die Synthese Bispyridin-Liganden und deren Methyl-Analoga mit 2 bis 8 Methylengruppen und ihre jeweiligen Platin-Komplexe berichtet worden. In dieser Arbeit wurde die Synthese und Reinigungsverfahren überarbeitet so dass es schneller und billiger und haben dies durch Synthetisieren Bispyridin-Liganden mit 8, 10 oder 12 Methylengruppen (die kürzeste mit den acht Methylengruppen nachgewiesen, biao, wurde zum Vergleich das neue Reinigungsverfahren für die ältere Methode). Zweikernige Platin-Komplexe wurden unter Verwendung dieser Liganden hergestellt.
Die Synthese der Bispyridin-Liganden wurde in wasserfreiem Lösungsmittel und unter einer inerten Stickstoffatmosphäre unter Verwendung von Triethylamin als schwache Base beendet undPropanphosphonsäureanhydrid als Kupplungsmittel. Entweder DMF oder DMSO als Lösungsmittel verwendet werden, obwohl die Isonicotinsäure löst sich besser in DMSO als im DMF tut. Denn entweder Lösungsmittel, sanfte Erwärmung unter einem laufenden Strom von heißem Wasser kann verwendet werden, um die Auflösung zu unterstützen.
Das alte Verfahren verlängerte Reaktionszeiten (mehrere Tage) und einem mehrstufigen Reinigungsverfahren einschließlich Flüssig / Flüssig-Extraktion gegen Diethylether und Neutralisation mit NaHCO 3, die nun beseitigt ist erforderlich. Die Ligandensynthese Reaktionen werden nun in wenigen Stunden bei Raumtemperatur beendet, nachdem alle Reaktionsteilnehmer werden in einem Schritt zugegeben. Die Bispyridin Liganden aus der Lösung aus der Zugabe von Wasser (für Liganden mit 8 oder weniger Methylengruppen) und Ausfällung aus der Lösung bei der Bildung der 10 und 12 Methylengruppe-Liganden. Alle Liganden können aus kochendem Wasser und in einigen Fällen ihre langsame recrystall umkristallisierensierung können geeignete Kristalle für die Röntgenbeugung ergeben.
Die zweikernigen Platin-Komplexe werden durch Umsetzung von zwei Mol zu einem Mol Transplatin der Bispyridin-Liganden hergestellt. Das trans labializing Wirkung der Liganden Chloridoliganden sichergestellt, dass das Hauptprodukt ist die Koordinierung der Platin Arzneimittel durch eine einzige Stelle auf der Bispyridin-Liganden (das Stickstoffatom des Rings). Die zweikernigen Platin-Komplexe haben eine gute Löslichkeit als Dikation Salze sowohl in Wasser, DMF und DMSO.
Die Reinigung erfolgt durch fraktionierte Fällung mit Aceton erreicht. Der nicht identifizierte Verunreinigung ausfällt, bevor das Produkt und wird durch Filtration durch enge Porenfilterpapier entfernt. Es ist wichtig zu beachten, dass der Acetonfällung funktioniert besser mit zunehmender Menge an Produkt, gereinigt werden. Bei Mengen von weniger als 200 mg, wird die Methode nicht so gut funktionieren und wiederholte Niederschläge Aceton erforderlich werden kann. Bei Beträgen um 200 mg odermehr haben wir festgestellt, dass einzelne Acetonpräzipitation Schritte werden in der Regel nur dann erforderlich.
Während dieses Papier beschreibt die Synthese von spezifischen Liganden und Platinkomplexe, können die Techniken, welche hier verwendet werden, um ein viel breiteres Spektrum von Liganden und kernigen Platin-Komplexe zu synthetisieren. Beispielsweise mit geeigneten Schutzgruppen Diaminoalkan andere Liganden, wie Spermin und Spermidin, können verwendet werden, um Liganden Bispyridin machen. Nicht-symmetrische Bispyridin Liganden könnten auch mit Isonicotinsäure an einem Ende hergestellt werden, und 2-Methyl-isonicotinsäure am anderen Ende. Diese nicht-symmetrische Liganden können durch die Verwendung von FMOC / BOC-Schutz an einem Ende der Diaminoalkan Ketten erzeugt werden. Das ungeschützte Amin der Kette mit einem Isonicotinsäure-Derivat unter Verwendung der beschriebenen Amidkupplungsreaktionen umgesetzt werden. Die Schutzgruppe wird dann von dem Diaminoalkan-Kette gespalten und ein anderes Derivat der Isonicotinsäure ist mit einem angeschlossenenandere Amid-Kupplungsreaktion. Dreikernige Platin-Komplexe könnte auch möglicherweise mit einer dieser Liganden über eine Anpassung einer Methode mit pyrazolyl-Liganden zu dreikernigen machen werden, BBR3464 artige Komplexe 22.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 151882 | 99.9% D |
| DMSO-d6 | Aldrich | 156914 | 99.96% D |
| 1,8-diaminooctane | Aldrich | D22401 | 98% |
| 1,10-diaminodecane | Aldrich | D14204 | 98% |
| 1,12-diaminododecane | Aldrich | D1,640-1 | 98% |
| Isonicotinic acid | Aldrich | I17508 | 99% |
| 1-Propylphosphonic anhydride solution | Aldrich | 431303 | 50 wt% in ethyl acetate |
| Trans-diaminodichloridoplatinum(II) | Aldrich | P1525 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | Z76855 | >99.9%, anhydrous |
| N,N’-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | 99.8%, anhydrous |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886 | >99% |
| Nylon filter membranes | Whatman | 7402-004 | Pore size, 0.2 µm |
| Magnetic stirring hotplate | |||
| Magnetic stirring bar | |||
| Round bottom or three neck flask | |||
| Rubber septums of sufficient size for chosen round bottom or three neck flask | |||
| 5 ml hypodermic syringes | |||
| Hypodermic needles | |||
| Rubber party ballons | |||
| Rubber bands | |||
| A source of N2 gas | |||
| Rotary evaporator | |||
| Drying oven | |||
| NMR tubes | |||
| NMR spectrometer | |||
| 500 ml beakers | |||
| Glass or plastic pipettes |
References
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