Summary
Detta protokoll beskriver användningen av amid-kopplingsreaktioner av isonikotinsyra och diaminoalkaner att bilda överbryggande ligander som är lämpliga för användning vid syntes av multinukleära platinakomplex, som kombinerar aspekter av cytostatika BBR3464 och picoplatinen.
Introduction
Platina cytostatika förblir en av de mest använda familj av medel för behandling av cancer hos människor 1. Trots sina framgångar, de är begränsade i sin tillämpning av svåra dosbegränsande biverkningar 2-4. De begränsade doser som kan ges till patienter innebär också att tumörer kan utveckla resistens 5. Som sådan, nya läkemedel fortsätter att utvecklas för att förbättra biverkningsprofil och övervinna förvärvad resistens, som phenanthriplatin 6 och phosphaplatin 7.
I slutet av 1990, var en av tricykliska platina läkemedel utvecklas, BBR3464 (Schema 1) 8, som är upp till 1000 x mer cytotoxiskt in vitro än den ledande platina läkemedel, cisplatin. BBR3464 har också möjligheten att övervinna förvärvad resistens i en panel av humana cancercellinjer 9. Tyvärr är det en ökad aktivitet av BBR3464 motsvaras av 50 - till 100 - faldigt högre toxicitet sombegränsar dess användning 10-12. Det är också lätt bryts ned i kroppen, vilket innebär lite av läkemedlet når cancer kärnor intakta 9.
Picoplatin är en mononukleär platina-baserade läkemedlet som innehåller en 2-metyl-pyridin-ligand (Schema 1) 13. Metylgruppen av detta läkemedel skyddar den från angrepp av biologiska nukleofiler; i synnerhet cystein och metionin-innehållande peptider / proteiner 14-16. Som sådan är den drogen ganska stabil och har en mycket högre koncentration som når cancerkärnor jämfört med både BBR3464 och cisplatin 17. Dess minskad reaktivitet innebär också picoplatin har en högre maximal tolererad dos jämfört med BBR3464 och cisplatin 10,18,19.
Projektet sökte därför att kombinera egenskaperna hos BBR3464 och picoplatin att ta fram nya läkemedel som kan övervinna förvärvad resistens som visar förbättrad biologisk stabilitet och mindre allvarliga sido effect (t.ex. Figur 1). I att göra så, var en rad bicykliska platinakomplex beredd med bispyridin bryggligander 20. De ligander görs med användning av amid-kopplingsreaktioner med isonikotinsyra, eller dess derivat såsom 2-metyl-isonikotinsyra, längd diaminoalkaner variabla. Reaktion av en molekvivalent av liganderna med två molekvivalenter av transplatin ger de önskade platinakomplex (Schema 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Syntes av N, N '-. (Alkan-1, n-diyl) diisonicotinamide
- Torka en enda hals eller tre-halsad rundbottnad kolv i en ugn (100 ° C, 1 timme) för att säkerställa att all fukt har avlägsnats.
- Lägg fast isonikotinsyra, eller dess derivat, till kolven tillsammans med en magnetisk omrörarstav. Om diaminoalkan ligand (s) är fasta substanser vid rumstemperatur, varefter 0,5 mol (till siffer moler isonikotinsyra) tillsättes till kolven i detta skede.
- Cap halsen (er) i kolven med gummi septa och byta ut luften i flaskan med kväve, antingen genom en kontinuerlig kvävgasström eller med hjälp av kvävefyllda ballonger.
- Använd en injektionsnål och en injektionsspruta för att lägga till vattenfri dimetylformamid eller dimetylsulfoxid (4 ml per 500 mg av isonikotinsyra eller 2-metyl-isonikotinsyra) för att lösa upp det fasta ämnet. Om det fasta materialet inte löser sig lätt, sedan värma lösningen försiktigt.
- Lägg till 7 molekvivalenter (till enmount of isonikotinsyra användes) trietylamin (svag bas) och 0,5 molekvivalenter av den diaminoalkan. Om lösningen är en vätska vid rumstemperatur, tillsätt sedan 1,5 molekvivalenter.
- Lägg till en molekvivalent av 1-propylfosfonsyra-anhydrid (kopplingsmedel) under kontinuerlig omröring och tillåta reaktionen att slutföra över 5-12 timmar.
2. Rening av liganderna
- För bispyridin ligander görs med diaminoalkan ligander med 10 eller fler metylengrupper, vänta på produkterna för att falla ut ur lösningen eftersom reaktionen fortskrider.
- För bispyridin ligander med användning av diaminooktan, utfällning av produkten genom tillsats av ~ 40 ml vatten.
- För bispyridin utförs med diaminoalkaner av 2-6 metylengrupper, tillsätt ~ 40 ml vatten och gör det möjligt för föreningarna att kristallisera under 1-3 dagar.
- Samla varje bispyridin ligand genom vakuumfiltrering och omkristallisera från cirka 400 till 500 ml kokande vatten per 200mg av liganden. Anm: Mer vatten behövs för längre bispyridin ligander på grund av deras mycket reducerad vattenlöslighet.
- Lägg NaOH och KOH (pH 9) till lösningen för att säkerställa att föreningarna är fria baserna vid omkristallisering.
3. Syntes och rening av de bicykliska platinakomplex
- Fullt upplösa trans diamminodichloridoplatinum (II), transplatin, i varmt (70-80 ° C) vatten (150 ml per 200 mg transplatin) för att framställa en klar starkt gulfärgad lösning.
- Lägg till nya 0,5 molekvivalent av den bispyridin ligand och omrör lösningen vid temperaturen tills ligand löst sig (klar lösning). Vänta tills lösningen att vända nära färglös, stäng av värmen och rör i rumstemperatur i ytterligare några timmar.
- Avlägsna lösningsmedlet genom roterande indunstning, vilket kommer att ge ett gult färgat pulver.
- Rena, platinakomplexet (er) genom upplösning i en minimal mängd varmt vatten (~ 50 &# 186, C). Om återstående gula eller vita färgade fasta ämnen är närvarande och filtrera dem av.
- Lägg aceton till lösningen, tills en vit fällning bildas, vilken verkar vara en polymer form av metallkomplex och utgör upp till 10% av reaktionsprodukten. Fortsätt att tillsätta aceton (~ extra 20-30 ml) tills ingen ytterligare fällning visas. Obs: denna vit fällning är en förorening.
- Avlägsna denna fällning genom filtrering av innehållet genom nylonfilterpapper (0,2 | im porstorlek) och roterande indunsta den återstående lösningen till torrhet, vilket kommer att ge en ren produkt. Anm: Vid behov kan sedan ytterligare acetonfällningssteg utföras förrän komplexet är ren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bispyridin ligander och deras respektive bicykliska platinakomplex karakteriseras av ett H, 13 C och 195 Pt-NMR (tabellerna 1 och 2) och elektrosprayjonisering masspektroskopi. Accurate smältpunkter kan bestämmas med användning av differentialscanningkalorimetri och renhet bestäms bäst genom elementaranalys för C, H och N procentuella innehållet. Mest nytta är 1H NMR eftersom den är snabb och enkel att använda, ger resultat inom minuter av isolering av slutprodukterna med resonanser som definitivt kan visa framgångsrika amidkoppling och samordnings platina (Tabell 1 och 2).
Isonikotinsyra har tre resonanser; två dubletter i den aromatiska regionen (7-9 ppm) och en mycket bred resonans runt 13 ppm för karboxylsyran proton. De diaminoalkan protonresonanserna är alla belägna i alifatiska området mellan 1 och 4 ppm. Som tHan längden på diaminoalkan kedjan ökar många av metylen resonanser blir likvärdig, och som sådan, är färre toppar observeras i alifatiska regionen än vad som förväntas; även om de är mycket mera omfattande och kan tilldelas löst genom sina integrationer (tabellerna 1 och 2). Till exempel se figurerna 1 och 2 för den kemiska strukturen och ett H-NMR-spektra för N, N '- (oktan-1 ,8-diyl)-bis (isonikotinamid), biao, ligand. På grund av symmetri i molekylen fem alifatiska resonanser som normalt kan förväntas för biao; men de fyra inre mest metylen toppar alla är magnetiskt ekvivalenta och visa upp som en stor resonans vid ca 1,2 ppm.
Aminen protonresonans av okopplad diaminoalkan kedjan är belägen i den alifatiska regionen och är den viktigaste resonans när den rör sig avsevärt nedfälts, in i den aromatiska regionen, vid koppling to karboxylsyran. Den efterföljande amidprotonen resonans ses runt 8,7 ppm för alla dessa ligander, som en relativt bred triplett resonans (Figur 2).
Samordning av platinagruppen till de bispyridin ligander observeras genom selektiva förskjutningar av liganden är aromatiska resonanser (0,15 ppm nedåt fältet förskjutning av Ha resonanser och 0,07 ppm upfield förskjutning av Hb-resonanser) och efterlevnaden av platina koppling på dubb resonans för Ha protoner (Figur 3). Samordning av platinagrupperna till bispyridin liganden kan lätt iakttas med hjälp av 195 Pt NMR. Den kemiska förskjutning av en platina resonans är direkt relaterad till de typer av atomer koordinerade 21. Chlorido ligander skift 195 Pt resonanser i fältet nedanför (mot 0 ppm) och är (m) ino ligander skifta resonans upfield (mot -2,500 ppm). De bicykliska platinakomplex som syntetiserats här visar en enda r esonance omkring -2300 ppm på grund av den 3 x am (m) ino och 1 x chlorido samordning tillstånd (fig. 4) 22. Oreagerat transplatin orenhet skulle visas som en resonans runt -2100 ppm medan om två ligander reagerade med ett enda transplatin molekyl (4 x am (m) ino miljö) då denna förorening skulle vara uppåt fältet av -2400 ppm 22.
Schema 1 De kemiska strukturerna för platina läkemedel picoplatinen och BBR3464 och den allmänna syntesschema för syntesen av bispyridin ligander och deras respektive dinukleär platinakomplex.; R = H eller CH3; . n = 1-6 motjoner för platinakomplex har utelämnats; med hjälp av den metod som beskrivs här är de diklorid salter.
tp_upload/51740/51740fig1highres.jpg "/>
Figur 1 Den kemiska strukturen av den N, N '-.. (Oktan-1 ,8-diyl) bis (isonikotinamid) ligand, biao och protonen numreringsschema som används för tilldelning av de resonanser i ett H-NMR Obs likvärdighet av de fyra metylenprotoner (HE) i mitten av molekylen.
Figur 2 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) spektrum av N, N '-. (Oktan-1 ,8-diyl) bis (isonikotinamid), Biao Notera platsen för triplett amid resonans på runt 8,7. ppm, upp 1-2 ppm för diaminooktan amin resonans före koppling.
Figur 3. The 1 H-NMR (D2O, 400 MHz)-spektrum av trans-[{Pt (NH3) 2 Cl} 2 μ-biao] 2 +. Obs platina koppling på den aromatiska Ha resonans vid 8,82 ppm.
Figur 4. The 195 Pt-NMR (D2O, 400 MHz)-spektrum av trans-[{Pt (NH3) 2 Cl}. 2 μ-biao] 2 + Notera den enda bred resonans omkring -2300 ppm, vilket är förenligt med en PTN 3 Cl miljö; N = am (m) in.
Tabell 1 De 1 H NMR-karakteriseringsdata för de bispyridin ligander i DMSO-dg 6 vid 400 MHz d = dubblett.. t = triplett; q = kvartett; m = multiplett.
Tabell 2. De 1 H NMR-karakteriseringsdata för de bicykliska platinakomplex i D 2 </ Strong> O vid 400 MHz d = dubblett.; t = triplett; q = kvartett; m = multiplett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta arbete dinukleär platinakomplex har syntetiserats som potentiella läkemedel mot cancer. På så bispyridin bryggligander syntetiserades via en amid kopplingsreaktion med hjälp isonikotinsyra och längd diaminoalkaner variabel. Tidigare syntes av bispyridin ligander och deras metylestrar analoger med 2-8 metylen-grupper och deras respektive platinakomplex har rapporterats. I denna uppsats har syntes och rening metod reviderats vilket gör det snabbare och billigare och har visat detta genom att syntetisera bispyridin ligander med 8, 10 och 12 metylengrupper (kortast med de åtta metylengrupper, Biao, gjordes för att jämföra den nya reningsmetod till den äldre metoden). Bicykliska platinakomplex har också gjorts med användning av dessa ligander.
Syntesen av de bispyridin ligander fördes i vattenfritt lösningsmedel och under inert kväveatmosfär med hjälp av trietylamin som en svag bas ochpropylfosfonsyra anhydriden som kopplingsmedel. Antingen DMF eller DMSO kan användas som lösningsmedel, fastän isonikotinsyra upplöses bättre i DMSO än det gör i DMF. För endera lösningsmedel, mild upphettning under en rinnande ström av hett vatten kan användas för att underlätta upplösningen.
Denna gamla metod krävs längre reaktionstider (flera dagar) och en flerstegsreningsprocess innefattande vätske / vätskeextraktion mot dietyleter och neutralisering med NaHCO 3, som nu elimineras. Liganden syntesreaktioner är nu avslutade inom några timmar vid rumstemperatur efter det att alla reaktionskomponenterna tillsätts tillsammans i ett steg. De bispyridin ligandema utfällas från lösning med tillsats av vatten (för ligander med 8 eller färre metylen-grupper) och fällas ut från lösningen vid bildning av de 10 och 12 metylengrupp ligander. Alla de ligander kan omkristalliseras ur kokande vatten och i vissa fall deras långsamma recrystallsering kan ge kristaller lämpade för röntgendiffraktion.
De bicykliska platinakomplex framställes genom omsättning av två mol av transplatin till en mol av bispyridin ligander. Den trans labializing effekten av chlorido ligander säkerställer att huvudprodukten är samordning av platina läkemedel genom en enda plats på bispyridin ligander (kväveatomen i ringen). De bicykliska platinakomplex har god löslighet som dikatjon alter i både vatten, DMF och DMSO.
Rening åstadkoms genom fraktionerad utfällning med användning av aceton. Den oidentifierade föroreningen utfälles innan produkten och avlägsnas genom filtrering genom småporig filterpapper. Det är viktigt att notera att acetonutfällning fungerar bättre med ökande mängd av produkten som skall renas. Vid mängder mindre än 200 mg, metoden inte fungerar så bra och kan krävas upprepade aceton utfällningar. För belopp runt 200 mg ellermer vi har upptäckt att enkla aceton fällningssteg i allmänhet bara behövs.
Samtidigt som detta papper detaljer syntesen av specifika ligander och platinakomplex, kan de tekniker som används här tillämpas för att syntetisera ett mycket bredare spektrum av ligander och multinukleära platinakomplex. Till exempel, med lämpliga skyddsgrupper andra diaminoalkan ligander, såsom spermin och spermidin, kan användas för att göra bispyridin ligander. Icke-symmetriska bispyridin ligander kan också göras med hjälp av isonikotinsyra i ena änden och 2-metyl-isonikotinsyra i andra änden. Dessa icke-symmetriska ligander kan genereras genom användning av FMOC / BOC-skydd på en ände av de diaminoalkan kedjor. Den oskyddade aminen av kedjan kan bringas att reagera med en isonikotinsyra-derivatet med användning av amid-kopplingsreaktioner som beskrivs. Den skyddande gruppen klyvs därefter från diaminoalkan kedja och ett annat derivat av isonikotinsyra är fäst med hjälp av enannan amid kopplingsreaktionen. Tricykliska platinakomplex kunde också potentiellt göras med användning av någon av dessa ligander via en anpassning av en metod med användning av pyrazolyl-baserade ligander för att göra av tricykliska, BBR3464-liknande, komplexbinder 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 151882 | 99.9% D |
| DMSO-d6 | Aldrich | 156914 | 99.96% D |
| 1,8-diaminooctane | Aldrich | D22401 | 98% |
| 1,10-diaminodecane | Aldrich | D14204 | 98% |
| 1,12-diaminododecane | Aldrich | D1,640-1 | 98% |
| Isonicotinic acid | Aldrich | I17508 | 99% |
| 1-Propylphosphonic anhydride solution | Aldrich | 431303 | 50 wt% in ethyl acetate |
| Trans-diaminodichloridoplatinum(II) | Aldrich | P1525 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | Z76855 | >99.9%, anhydrous |
| N,N’-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | 99.8%, anhydrous |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886 | >99% |
| Nylon filter membranes | Whatman | 7402-004 | Pore size, 0.2 µm |
| Magnetic stirring hotplate | |||
| Magnetic stirring bar | |||
| Round bottom or three neck flask | |||
| Rubber septums of sufficient size for chosen round bottom or three neck flask | |||
| 5 ml hypodermic syringes | |||
| Hypodermic needles | |||
| Rubber party ballons | |||
| Rubber bands | |||
| A source of N2 gas | |||
| Rotary evaporator | |||
| Drying oven | |||
| NMR tubes | |||
| NMR spectrometer | |||
| 500 ml beakers | |||
| Glass or plastic pipettes |
References
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Trans. 39, 8113-8127 (2010).
- Kiernan, M. C. The pain with platinum: oxaliplatin and neuropathy. Eur. J. Cancer. 43, 2631-2633 (2007).
- Markman, M., et al. Clinical features of hypersensitivity reactions to carboplatin. J Clin. Oncol. 17, 1141-1145 (1999).
- Ding, D., Allman, B. L., Salvi, R. Review: Ototoxic characteristics of platinum antitumor drugs. Anatomical Rec. 295, 1851-1867 (2012).
- Galluzzi, L., et al.
- Park, G. Y., Wilson, J. J., Song, Y., Lippard, S. J. Phenanthriplatin, a monofunctional DNA-binding platinum anticancer drug candidate with unusual potency and cellular activity profile. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 11987-11992 (2012).
- Moghaddas, S., et al. next generation platinum antitumor agents: A paradigm shift in designing and defining molecular targets. Inorg. Chim. Acta. 393, 173-181 (2012).
- Farrell, N. P. Platinum formulations as anticancer drugs clinical and pre-clinical studies. Curr. Top. Med. Chem. 11, 2623-2631 (2011).
- Wheate, N. J., Collins, J. G. Multi-nuclear platinum complexes as anti-cancer drugs. Coord. Chem. Rev. 241, 133-145 (2003).
- Gourley, C., et al. A phase I study of the trinuclear platinum compound, BBR3464, in combination with protracted venous infusional 5-fluorouracil in patients with advanced cancer. Cancer Chemoth. Pharmacol. 53, 95-101 (2004).
- Calvert, A. H., et al. Phase II clinical study of BBR3464, a novel, bifunctional platinum analogue, in patients with advanced ovarian cancer. Eur. J. Cancer. 37, (2001).
- Jodrell, D. I., et al. Phase II studies with BBR3464, a novel tri-nuclear platinum complex, in patients with gastric or gastro-oesophageal adenocarcinoma. Eur. J. Cancer. 40, 1872-1877 (2004).
- William, W. N., Glisson, B. S. Novel strategies for the treatment of small-cell lung carcinoma. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 611-619 (2011).
- Raynaud, F., et al. cis-Amminedichloro(2-methylpyridine) Platinum(II) (AMD473), a novel sterically hindered platinum complex: In vivo activity, toxicology, and pharmacokinetics in mice. Clin. Cancer Res. 3, 2063-2074 (1997).
- Holford, J., et al. biochemical and pharmacological activity of the novel sterically hindered platinum co-ordination complex cis-[amminedichloro(2-methylpyridine)] platinum(II) (AMD473). Anti-Cancer Drug Des. 13, 1-18 (1998).
- Munk, V. P., et al. Investigations into the interactions between DNA and conformationally constrained pyridylamine platinum(II) analogues of AMD473. Inorg. Chem. 42, 3582-3590 (2003).
- Wheate, N. J., Collins, J. G. Multi-nuclear platinum drugs: A new paradigm in chemotherapy. Curr. Med. Chem. - Anti-Cancer Agents. 5, 267-279 (2005).
- Beale, P., et al. A phase I clinical and pharmacological study of cis-diamminedichloro(2-methylpyridine) platinumm II (AMD473). British journal of cancer. 88, 1128-1134 (2003).
- Sessa, C., et al. Clinical and pharmacological phase I study with accelerated titration design of a daily times five schedule of BBR3464, a novel cationic triplatinum complex. Ann. Oncol. 11, 977-983 (2000).
- Brown, S. D., et al. Combining aspects of the platinum anticancer drugs picoplatin and BBR3464 to synthesize a new family of sterically hindered dinuclear complexes; their synthesis, binding kinetics and cytotoxicity. Dalton Trans. 41, 11330-11339 (2012).
- Still, B. M., Anil Kumar, P. G., Aldrich-Wright, J. R., Price, W. S. 195Pt NMR - Theory and application. Chem. Soc. Rev. 36, 665-686 (2007).
- Wheate, N. J., Cullinane, C., Webster, L. K., Collins, J. G. Synthesis, cytotoxicity, cell uptake and DNA interstrand cross-linking of 4,4'-dipyrazolylmethane-linked multinuclear platinum anti-cancer complexes. Anti-Cancer Drug Des. 16, 91-98 (2001).
