Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van amide koppelingsreacties van isonicotinezuur en diaminoalkanes te overbruggen liganden geschikt voor gebruik in de synthese van meerkernige platina complexen, die aspecten van de antikankergeneesmiddelen BBR3464 en picoplatin combineren vormen.
Introduction
Platinum antikankergeneesmiddelen blijven een van de meest gebruikte familie van middelen bij de behandeling van menselijke kanker 1. Ondanks hun succes, zijn ze in hun toepassing beperkt door ernstige dosis-limiterende bijwerkingen 2-4. De beperkte doses die kunnen worden toegediend aan patiënten betekent ook dat tumoren resistentie 5 kan ontwikkelen. Als zodanig, nieuwe medicijnen verder worden ontwikkeld om het bijwerkingenprofiel verbeteren en het overwinnen van verworven resistentie, zoals phenanthriplatin 6 en phosphaplatin 7.
In de late jaren 1990, werd een trinucleair platina medicijn ontwikkeld, BBR3464 (schema 1) 8, dat is tot 1000 x cytotoxischer in vitro dan de toonaangevende platina geneesmiddel, cisplatine. BBR3464 kan ook verworven resistentie in een panel van humane kankercellijnen 9 overwinnen. Helaas is de verhoogde activiteit van BBR3464 geëvenaard door 50 - tot 100 - voudig hogere toxiciteit diezijn de gebruiksmogelijkheden van 10-12. Het is ook gemakkelijk afgebroken in het lichaam, waardoor weinig van het geneesmiddel bereikt kanker kernen intact 9.
Picoplatin een mononucleaire platina gebaseerde geneesmiddelen waarbij 2-methyl-pyridine ligand (schema 1) 13 bevat. De methylgroep van dit medicijn beschermt tegen aanvallen van biologische nucleofielen; met name cysteïne en methionine bevattende peptiden / eiwitten 14-16. Als zodanig is het geneesmiddel vrij stabiel en heeft een veel hogere concentratie die kanker kernen bereikt in vergelijking met zowel BBR3464 en cisplatine 17. De verminderde reactiviteit betekent ook picoplatin heeft een hoger maximaal getolereerde dosis in vergelijking met BBR3464 en cisplatine 10,18,19.
Dit project daarom getracht de eigenschappen van BBR3464 en picoplatin combineren om nieuwe geneesmiddelen die kunnen verworven weerstand die verbeterde biologische stabiliteit en minder ernstige bijwerkingen effe weergegeven overwinnen producerencts (bijvoorbeeld figuur 1). Daarbij, een reeks van dinucleaire platina complexen werden bereid met bispyridine overbruggen liganden 20. De liganden zijn gemaakt met amide koppelingsreacties met isonicotinezuur of derivaten daarvan, zoals 2-methyl-isonicotinezuur, variabele lengte diaminoalkanes. Reactie van een molequivalent van de liganden met twee molequivalenten transplatin levert het gewenste platinacomplexen (schema 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Synthese van N, N '-. (Alkaan-1, n-diyl) diisonicotinamide
- Droog een hals of drie-hals rondbodem kolf in een oven (100 ° C, 1 uur) zodat alle vocht is verwijderd.
- Voeg vaste isonicotinezuur of zijn derivaat voor kolf met een magnetische roerstaaf. Als de diaminoalkane ligand (en) zijn vaste stoffen bij kamertemperatuur, daarna 0,5 mol (het aantal mol isonicotinezuur) wordt toegevoegd aan de kolf in dit stadium.
- Cap de nek (s) van de kolf met rubberen septa en vervang de lucht in de kolf met stikstof hetzij door middel van een continue stroom stikstof of door het gebruik van stikstof gevulde ballonnen.
- Gebruik een injectienaald en een spuit watervrij dimethylformamide of dimethylsulfoxide (4 ml per 500 mg isonicotinezuur of 2-methyl-isonicotinezuur) aan de vaste lossen. Als de vaste stoffen niet gemakkelijk oplossen, verwarm dan de oplossing voorzichtig.
- Voeg 7 mol equivalenten (om de eenmount van isonicotinezuur gebruikt) triethylamine (zwakke base) en 0,5 mol equivalenten van de diaminoalkane. Als de oplossing een vloeistof is bij kamertemperatuur, voeg dan 1,5 molequivalent.
- Voeg een mol equivalent 1-propylfosfonzuuranhydride (koppelingsmiddel) onder voortdurend roeren en laat de reactie te voltooien dan 5-12 uur.
2. Zuivering van de liganden
- Voor bispyridine liganden gemaakt met behulp diaminoalkane liganden met 10 of meer methyleengroepen, wacht tot de producten uit de oplossing neerslaan als de reactie vordert.
- Voor bispyridine liganden gemaakt met diaminooctaan, precipiteren van het product door toevoeging van ~ 40 ml water.
- Voor bispyridine gemaakt met diaminoalkanes van 05:58 methyleengroepen, voeg ~ 40 ml water en laat de verbindingen kristalliseren in 1-3 dagen.
- Verzamel elk bispyridine ligand door vacuümfiltratie en herkristalliseer van ongeveer 400-500 ml kokend water per 200mg ligand. Opmerking: meer water nodig voor de langere bispyridine liganden vanwege hun veel lagere oplosbaarheid in water.
- Voeg NaOH en KOH (pH 9) aan de oplossing zodat de verbindingen vrije basen bij herkristallisatie.
3. Synthese en zuivering van de dinucleaire platina complexen
- Volledig ontbinden trans-diamminodichloridoplatinum (II), transplatin, in heet (70-80 º C) water (150 ml per 200 mg transplatin) een duidelijk sterk geel gekleurde oplossing produceren.
- Voeg een 0,5 mol equivalent van de bispyridine ligand en roer de oplossing bij een temperatuur tot het ligand oplost (heldere oplossing). Wacht tot de oplossing te draaien bijna kleurloos, zet het vuur uit en roer bij kamertemperatuur voor een paar extra uren.
- Verwijder het oplosmiddel door rotatieverdamping, wat een geel gekleurd poeder oplevert.
- Te zuiveren, de platina complex (es) door het oplossen in een minimale hoeveelheid warm water (~ 50 &# 186; C). Als resterende geel of wit gekleurde vaste stoffen aanwezig zijn, dan filteren deze af.
- Aceton Aan de oplossing totdat een wit neerslag gevormd dat lijkt op een polymère vorm van de metaal complexen kan zijn en tot 10% van het reactieproduct. Vervolg de toevoeging van aceton (~ extra 20-30 ml) tot er geen neerslag meer verschijnt. Let op: deze witte neerslag is een onzuiverheid.
- Verwijder het precipitaat door filteren van de inhoud door nylon filtreerpapier (0,2 um poriegrootte) en roterend verdampen van de resterende oplossing tot droog, waarbij een zuiver product oplevert. Opmerking: Indien nodig kan dan extra acetonprecipitatie stappen worden uitgevoerd tot het complex is zuiver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bispyridine liganden en hun dinucleaire platina complexen gekarakteriseerd met 1H, 13C en 195 Pt NMR (tabellen 1 en 2) en electrospray ionisatie massaspectroscopie. Nauwkeurige smeltpunten kan worden bepaald met differentiële scanning calorimetrie en zuiverheid wordt het best bepaald door elementenanalyse voor C, H en N percentage content. Van de meeste gebruik 1H NMR als het is snel en eenvoudig te gebruiken, waardoor resultaten binnen minuten na isolatie van de eindproducten met resonanties die definitief aantoont succesvol amidekoppeling en platina coördinatie (tabellen 1 en 2).
Isonicotinezuur drie resonanties; twee doubletten in het aromatische gebied (7-9 ppm) en een zeer brede resonantie rond 13 ppm van het carbonzuur proton. De diaminoalkane proton resonanties liggen allemaal in het alifatische gebied tussen 1 en 4 ppm. Als thij lengte van de diaminoalkane keten toeneemt vele methyleen resonanties worden gelijkwaardig, en als zodanig, zijn minder pieken waargenomen in het alifatische gebied dan verwacht; hoewel zij aanzienlijk intenser en kan los worden toegekend door de integraties (tabellen 1 en 2). Zie bijvoorbeeld de figuren 1 en 2 voor de chemische structuur en 1H-NMR spectra van de N, N '- (octaan-1 ,8-diyl) bis (isonicotinamide), biao ligand. Vanwege symmetrie in het molecuul vijf alifatische resonanties normaal zou verwachten voor biao; maar de vier binnenste methyleen pieken zijn allemaal magnetisch gelijkwaardig en te zien zijn als een grote weerklank bij ~ 1.2 ppm.
Het amine proton resonantie van de ontkoppelde diaminoalkane keten ligt in het alifatische gebied en is de belangrijkste resonantie als het beweegt aanzienlijk downfield, in het aromatische gebied, bij koppeling to het carbonzuur. De daaropvolgende amide protonresonantie wordt gezien rond 8,7 ppm voor al deze liganden, een relatief breed triplet resonantie (figuur 2).
Coördinatie van de platina-groep aan de bispyridine liganden wordt waargenomen door selectieve verschuivingen van aromatische resonanties het ligand's (0,15 ppm downfield verschuiving van de Ha resonanties en 0,07 ppm upfield verschuiving van de Hb resonanties) en de naleving van platina koppeling aan de doublet resonantie voor de Ha protonen (figuur 3). Coördinatie van de platina groep de bispyridine ligand kan eveneens gemakkelijk worden waargenomen met 195 Pt NMR. De chemische verschuiving van een platina resonantie is direct gerelateerd aan de soorten atomen gecoördineerd 21. Chlorido liganden verschuiven 195 Pt resonanties downfield (richting 0 ppm) en ik ben (m) ino liganden verschuiven de resonanties upfield (richting -2500 ppm). De dinucleaire platinacomplexen hier gesynthetiseerd tonen een enkele r esonance ongeveer -2300 ppm door de 3 x uur (m) ino en 1 x chlorido coördinatie toestand (figuur 4) 22. Ongereageerde transplatin onzuiverheid zou laten zien als een resonantie rond -2100 ppm terwijl als twee liganden reageerde met een enkel transplatin molecule (4 x uur (m) ino milieu) dan is deze onzuiverheid zou upfield zijn van -2400 ppm 22.
Schema 1 De chemische structuren van de platina drugs picoplatin en BBR3464 en het algemene syntheseschema voor de synthese van de bispyridine liganden en hun dinucleaire platina-complexen.; R = H of CH3; . n = 1-6 tegenionen voor de platina-complexen zijn weggelaten; met de hier beschreven werkwijze zijn ze dichloride zouten.
tp_upload/51740/51740fig1highres.jpg "/>
Figuur 1 De chemische structuur van het N, N '-.. (Octaan-1 ,8-diyl) bis (isonicotinamide) ligand, biao en het proton nummeringsschema voor toewijzing van de resonanties in het 1H NMR Noteer de gelijkwaardigheid van de vier methyleen protonen (He) in het midden van het molecuul.
Figuur 2 De 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) spectrum van N, N '-. (Octaan-1 ,8-diyl) bis (isonicotinamide), biao Noteer de locatie van het triplet amide resonantie op ongeveer 8.7. ppm, een stijging van 1-2 ppm voor de diaminooctaan amine resonantie voor koppeling.
Figuur 3. Het 1H NMR (D2O, 400 MHz) spectrum van trans-[{Pt (NH 3) 2 Cl} 2 μ Biao] 2 +. Opmerking platina koppeling aan de aromatische Ha resonantie bij 8,82 ppm.
Figuur 4. Het 195Pt NMR (D2O, 400 MHz) spectrum van trans-[{Pt (NH 3) 2 Cl}. 2 μ-Biao] 2 + Let op de enkele brede resonantie rond -2300 ppm die verenigbaar is met een PtN 3 Cl milieu; N = am (m) ine.
Tabel 1 Het 1H NMR karakterisatie gegevens van de bispyridine liganden in DMSO-d6 400 MHz d = doublet..; t = triplet; q = kwartet; m = multiplet.
Tabel 2. Het 1H NMR karakterisatie gegevens van de dinucleaire platina complexen D 2 </ Strong> O op 400 MHz d = doublet.; t = triplet; q = kwartet; m = multiplet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit werk dinucleaire platina complexen zijn gesynthetiseerd als potentiële antikankermiddelen. Daarbij werden bispyridine overbruggen liganden gesynthetiseerd via een amide-koppelingsreactie met isonicotinezuur en variabele lengte diaminoalkanes. Eerder de synthese van bispyridine liganden en hun methyl analogen met 2 tot 8 methyleengroepen en hun respectieve platinacomplexen gemeld. In dit artikel is de synthese en zuivering methode is herzien waardoor het sneller en goedkoper en hebben dit aangetoond door het synthetiseren bispyridine liganden met 8, 10 en 12 methyleengroepen (de kortste met de acht methyleengroepen, Biao, werd gemaakt om de nieuwe te vergelijken zuiveringswerkwijze de oudere methode). Dinucleaire platina complexen werden ook gemaakt met behulp van deze liganden.
De synthese van het bispyridine liganden in watervrij oplosmiddel en onder een inerte stikstofatmosfeer uitgevoerd op triethylamine als een zwakke base enpropylfosfonzuuranhydride als koppelingsmiddel. Ofwel DMF of DMSO worden gebruikt als oplosmiddel, hoewel de isonicotinezuur lost beter de DMSO dan in DMF. Voor beide oplosmiddel voorzichtig verwarmen onder stromend warm water kan worden gebruikt om te helpen oplossen.
Deze oude methode vereist langere reactietijden (verscheidene dagen) en een meerstaps zuiveringswerkwijze waaronder vloeistof / vloeistof extractie met diethylether en neutralisatie met NaHCO3, die nu geëlimineerd. Het ligand synthese reacties worden nu in een paar uur bij kamertemperatuur voltooid nadat alle reagentia samen worden toegevoegd in een stap. De bispyridine liganden precipiteren uit de oplossing met de toevoeging van water (liganden met 8 of meer methyleengroepen) en uit oplossing precipiteren bij de oprichting van de 10 en 12 methyleengroep liganden. Alle liganden kan worden herkristalliseerd uit kokend water en in sommige gevallen hun langzame recrystallnisatie kunnen kristallen geschikt voor Röntgendiffractie verkregen.
De dinucleaire platina complexen worden bereid door reactie van twee mol transplatin een mol van de bispyridine liganden. Het trans-labializing effect van de chlorido liganden ervoor dat het hoofdproduct is coördinatie van het platina geneesmiddelen via een site op het bispyridine liganden (het stikstofatoom van de ring). De dinucleaire platina complexen hebben een goede oplosbaarheid zoals dication zouten in zowel water, DMF en DMSO.
Zuivering wordt bereikt door fractionele precipitatie met aceton. De onbekende onzuiverheid neerslaat voordat het product en wordt verwijderd door filtratie door smalle poriën filterpapier. Het is belangrijk op te merken dat de aceton precipitatie beter werkt met een toenemende hoeveelheid van het product te worden gezuiverd. Bij bedragen van minder dan 200 mg, is de methode niet zo goed werkt en herhaalde aceton neerslag kan worden gevergd. Voor bedragen ongeveer 200 mg ofmeer we hebben geconstateerd dat enkele acetonprecipitatie stappen zijn over het algemeen alleen nodig.
Hoewel dit document beschrijft de synthese van specifieke liganden en platina complexen, kan de technieken die hier gebruikt worden toegepast op een veel breder scala van liganden en meerkernige platinacomplexen synthetiseren. Bijvoorbeeld, met geschikte beschermende groepen diaminoalkane andere liganden, zoals spermine en spermidine, kunnen worden gebruikt om liganden bispyridine maken. Asymmetrische bispyridine liganden kunnen ook worden gemaakt met behulp isonicotinezuur ene kant en 2-methyl-isonicotinezuur op het andere uiteinde. Deze niet-symmetrische liganden kunnen worden gegenereerd door het gebruik van FMOC / BOC-bescherming aan een uiteinde van de diaminoalkane ketens. De onbeschermde amine met de ketting laten reageren met een isonicotinezuur derivaat met de amide koppelingsreacties beschreven. De beschermende groep wordt vervolgens gesplitst van de diaminoalkane keten en een ander derivaat van isonicotinezuur is bevestigd met eenandere amide koppelingsreactie. Trinucleaire platinacomplexen Tevens kan worden gemaakt met een van deze liganden via een aanpassing van een werkwijze met pyrazolyl-gebaseerde liganden aan trinucleaire maken BBR3464-achtige complexen 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 151882 | 99.9% D |
| DMSO-d6 | Aldrich | 156914 | 99.96% D |
| 1,8-diaminooctane | Aldrich | D22401 | 98% |
| 1,10-diaminodecane | Aldrich | D14204 | 98% |
| 1,12-diaminododecane | Aldrich | D1,640-1 | 98% |
| Isonicotinic acid | Aldrich | I17508 | 99% |
| 1-Propylphosphonic anhydride solution | Aldrich | 431303 | 50 wt% in ethyl acetate |
| Trans-diaminodichloridoplatinum(II) | Aldrich | P1525 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | Z76855 | >99.9%, anhydrous |
| N,N’-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | 99.8%, anhydrous |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886 | >99% |
| Nylon filter membranes | Whatman | 7402-004 | Pore size, 0.2 µm |
| Magnetic stirring hotplate | |||
| Magnetic stirring bar | |||
| Round bottom or three neck flask | |||
| Rubber septums of sufficient size for chosen round bottom or three neck flask | |||
| 5 ml hypodermic syringes | |||
| Hypodermic needles | |||
| Rubber party ballons | |||
| Rubber bands | |||
| A source of N2 gas | |||
| Rotary evaporator | |||
| Drying oven | |||
| NMR tubes | |||
| NMR spectrometer | |||
| 500 ml beakers | |||
| Glass or plastic pipettes |
References
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Trans. 39, 8113-8127 (2010).
- Kiernan, M. C. The pain with platinum: oxaliplatin and neuropathy. Eur. J. Cancer. 43, 2631-2633 (2007).
- Markman, M., et al. Clinical features of hypersensitivity reactions to carboplatin. J Clin. Oncol. 17, 1141-1145 (1999).
- Ding, D., Allman, B. L., Salvi, R. Review: Ototoxic characteristics of platinum antitumor drugs. Anatomical Rec. 295, 1851-1867 (2012).
- Galluzzi, L., et al.
- Park, G. Y., Wilson, J. J., Song, Y., Lippard, S. J. Phenanthriplatin, a monofunctional DNA-binding platinum anticancer drug candidate with unusual potency and cellular activity profile. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 11987-11992 (2012).
- Moghaddas, S., et al. next generation platinum antitumor agents: A paradigm shift in designing and defining molecular targets. Inorg. Chim. Acta. 393, 173-181 (2012).
- Farrell, N. P. Platinum formulations as anticancer drugs clinical and pre-clinical studies. Curr. Top. Med. Chem. 11, 2623-2631 (2011).
- Wheate, N. J., Collins, J. G. Multi-nuclear platinum complexes as anti-cancer drugs. Coord. Chem. Rev. 241, 133-145 (2003).
- Gourley, C., et al. A phase I study of the trinuclear platinum compound, BBR3464, in combination with protracted venous infusional 5-fluorouracil in patients with advanced cancer. Cancer Chemoth. Pharmacol. 53, 95-101 (2004).
- Calvert, A. H., et al. Phase II clinical study of BBR3464, a novel, bifunctional platinum analogue, in patients with advanced ovarian cancer. Eur. J. Cancer. 37, (2001).
- Jodrell, D. I., et al. Phase II studies with BBR3464, a novel tri-nuclear platinum complex, in patients with gastric or gastro-oesophageal adenocarcinoma. Eur. J. Cancer. 40, 1872-1877 (2004).
- William, W. N., Glisson, B. S. Novel strategies for the treatment of small-cell lung carcinoma. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 611-619 (2011).
- Raynaud, F., et al. cis-Amminedichloro(2-methylpyridine) Platinum(II) (AMD473), a novel sterically hindered platinum complex: In vivo activity, toxicology, and pharmacokinetics in mice. Clin. Cancer Res. 3, 2063-2074 (1997).
- Holford, J., et al. biochemical and pharmacological activity of the novel sterically hindered platinum co-ordination complex cis-[amminedichloro(2-methylpyridine)] platinum(II) (AMD473). Anti-Cancer Drug Des. 13, 1-18 (1998).
- Munk, V. P., et al. Investigations into the interactions between DNA and conformationally constrained pyridylamine platinum(II) analogues of AMD473. Inorg. Chem. 42, 3582-3590 (2003).
- Wheate, N. J., Collins, J. G. Multi-nuclear platinum drugs: A new paradigm in chemotherapy. Curr. Med. Chem. - Anti-Cancer Agents. 5, 267-279 (2005).
- Beale, P., et al. A phase I clinical and pharmacological study of cis-diamminedichloro(2-methylpyridine) platinumm II (AMD473). British journal of cancer. 88, 1128-1134 (2003).
- Sessa, C., et al. Clinical and pharmacological phase I study with accelerated titration design of a daily times five schedule of BBR3464, a novel cationic triplatinum complex. Ann. Oncol. 11, 977-983 (2000).
- Brown, S. D., et al. Combining aspects of the platinum anticancer drugs picoplatin and BBR3464 to synthesize a new family of sterically hindered dinuclear complexes; their synthesis, binding kinetics and cytotoxicity. Dalton Trans. 41, 11330-11339 (2012).
- Still, B. M., Anil Kumar, P. G., Aldrich-Wright, J. R., Price, W. S. 195Pt NMR - Theory and application. Chem. Soc. Rev. 36, 665-686 (2007).
- Wheate, N. J., Cullinane, C., Webster, L. K., Collins, J. G. Synthesis, cytotoxicity, cell uptake and DNA interstrand cross-linking of 4,4'-dipyrazolylmethane-linked multinuclear platinum anti-cancer complexes. Anti-Cancer Drug Des. 16, 91-98 (2001).
