Summary
Este protocolo descreve o uso de reacções de acoplamento de amida do ácido isonicotínico e diaminoalcanos para formar ponte ligandos adequados para utilização na síntese de complexos de platina multinucleadas, que combinam os aspectos dos fármacos anticancerígenos BBR3464 e picoplatin.
Introduction
Drogas anticâncer Platinum permanecer um membro da família mais amplamente utilizado de agentes no tratamento de câncer humano 1. Apesar de seu sucesso, eles são limitados em sua aplicação por graves efeitos colaterais dose-limitante 2-4. As doses limitadas que podem ser administrados a doentes que significa que os tumores podem desenvolver resistência 5. Como tal, os novos medicamentos continuam a ser desenvolvidos para melhorar o perfil de efeitos colaterais e superar a resistência adquirida, como phenanthriplatin 6 e phosphaplatin 7.
No final de 1990, uma droga trinuclear platina foi desenvolvido, BBR3464 (Esquema 1) 8, que é de até 1.000 x mais citotóxica in vitro do que a principal droga de platina, cisplatina. BBR3464 também é capaz de superar a resistência adquirida em um painel de linhas celulares de cancro humanos 9. Infelizmente, o aumento da atividade de BBR3464 é acompanhada por 50 - a 100 - vezes maior toxicidade, o quelimita seu uso 10-12. Ela também é facilmente degradado no corpo, ou seja, pouco do fármaco atinge núcleos cancerosas intactas 9.
Picoplatin é um fármaco à base de platina mononuclear que contém um ligando 2-metil-piridina (Esquema 1) 13. O grupo metilo da droga que protege contra o ataque por nucleófilos biológicos; em particular, metionina e cisteína, contendo péptidos / proteínas de 14-16. Como tal, a droga é muito estável e tem uma concentração muito mais elevada que atinge os núcleos de cancro em comparação com ambos BBR3464 e cisplatina 17. A sua reactividade reduzida também significa picoplatin tem uma dose máxima tolerada mais elevada em comparação com a cisplatina e BBR3464 10,18,19.
Assim, este projecto procurou combinar as propriedades de BBR3464 e picoplatin para produzir novos medicamentos que são capazes de superar a resistência adquirida que exibir maior estabilidade biológica e menos grave-effe ladocts (por exemplo, Figura 1). Ao fazer isso, uma série de complexos de platina dinucleares foram preparadas com bispyridine ponte ligantes 20. Os ligantes são feitas usando reacções de acoplamento de amida com o ácido isonicotínico ou seus derivados, como 2-metil-isonicotínico, diaminoalcanos de comprimento variável. A reacção de um equivalente molar dos ligandos com dois equivalentes molares de transplatin produz os complexos de platina desejado (Esquema 1).
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Protocol
1 Síntese do N, N '-. (, N-alcano-diilo 1) diisonicotinamide
- Seque um único pescoço ou balão de fundo redondo de três pescoço em um forno (100 º C, 1 h) para garantir que toda a umidade seja removida.
- Adicionar ácido isonicotínico sólido, ou um seu derivado, para o frasco, juntamente com uma barra de agitação magnética. Se o ligando (s) diaminoalcano são sólidos à temperatura ambiente, em seguida, 0,5 mole (para as moles Número de ácido isonicotínico) é adicionado ao balão nesta fase.
- Tapar o pescoço (s) do frasco com septos de borracha e substituir o ar na garrafa com azoto, quer por meio de uma corrente contínua de azoto ou através do uso de azoto balões cheios.
- Use uma agulha hipodérmica e uma seringa para adicionar dimetilformamida ou dimetilsulfóxido anidro (4 ml por 500 mg de ácido isonicotínico ou o ácido 2-metil-isonicotínico) para dissolver o sólido. Se os sólidos não se dissolvem facilmente, em seguida, aquecer lentamente a solução.
- Adicionar 7 equivalentes Mole (a ummontagem de ácido isonicotínico usado) de trietilamina (base fraca) e 0,5 equivalentes molares do diaminoalcano. Se a solução é um líquido à temperatura ambiente, em seguida adicionar 1,5 equivalentes molares.
- Adicionar um equivalente molar de anidrido 1-propilfosfónico (agente de acoplamento), com agitação contínua, e permitir que a reacção se complete durante 5-12 hr.
2. Purificação dos ligandos
- Para bispyridine ligantes feitos usando ligandos diaminoalcano com 10 ou mais grupos metileno, espera para o produto a precipitar a partir da solução como a reacção progride.
- Para bispyridine ligantes feitos usando diaminooctano, precipitar o produto por adição de ~ 40 mL de água.
- Para bispyridine feito usando diaminoalcanos de 2-6 grupos metileno, adicionar ~ se 40 ml de água e permite que os compostos a cristalizar ao longo de 1-3 dias.
- Recolhe cada ligando bispyridine por filtração a vácuo e deixa-se recristalizar a partir de cerca de 400-500 ml de água em ebulição por 200mg de ligante. Nota: Mais água é necessária para os ligantes mais bispyridine devido à sua muito reduzida solubilidade em água.
- Adicionar NaOH e KOH (pH 9) para a solução para assegurar que os compostos sejam bases livres mediante recristalização.
3. Síntese e Purificação dos Complexos de platina dinucleares
- Totalmente dissolver trans-diamminodichloridoplatinum (II), transplatin, em água quente (70-80 º C) (150 ml por 200 mg de transplatin) para produzir uma solução de cor amarelo claro fortemente.
- Adicionar um equivalente molar de 0,5 de ligando bispyridine e agita-se a solução à temperatura até dissolver o ligante (solução clara). Espere até que a solução para transformar perto incolor, desligue o fogo e mexa em temperatura ambiente por algumas horas adicionais.
- Remover o solvente por evaporação rotativa, o que irá originar um pó de cor amarela.
- Purifica-se o complexo de platina (s) por dissolução numa quantidade mínima de água quente (~ 50 &# 186; C). Se restantes sólidos de cor amarela ou branca estão presentes, em seguida, filtrar estas fora.
- Adicionar acetona à solução até que um precipitado branco se formou, que parece ser uma forma polimérica dos complexos de metal e representa até 10% do produto de reacção. Continuar a adição de acetona (~ extras 20-30 ml) até que não haja mais formação de precipitado. Nota: este precipitado branco é uma impureza.
- Remove-se este precipitado por filtração os conteúdos através de papel de filtro de nylon (tamanho de poro 0,2 fim) e rotativo, evaporando a solução remanescente até à secura, o que irá originar um produto puro. Nota: Se for necessário, em seguida, os passos adicionais de precipitação de acetona pode ser realizada até que o complexo é puro.
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Representative Results
Os ligantes bispyridine e respectivos complexos de platina dinucleares são caracterizadas por 1 H, 13 C e 195 Pt-RMN (Tabelas 1 e 2), e por espectroscopia de massa por ionização por electropulverização. Os pontos de fusão precisos pode ser determinada utilizando calorimetria diferencial de varrimento e a pureza é melhor determinado por análise elementar para C, H e N teor percentual. De maior utilização é de 1 H-RMN, uma vez que é rápida e fácil de usar, que dá resultados dentro de minutos de isolamento dos produtos finais com ressonâncias que podem definitivamente demonstrar sucesso de acoplamento de amida e de coordenação de platina (Tabelas 1 e 2).
Ácido Isonicotínicos tem três ressonâncias; dois dupletos na região aromática (7-9 ppm) e uma ressonância muito larga a cerca de 13 ppm para o protão de ácido carboxílico. As ressonâncias de protões diaminoalcano estão todos localizados na região alifático entre 1 e 4 ppm. Como tele comprimento dos diaminoalcano cadeia aumenta muitas das ressonâncias metileno tornam-se equivalentes, e, como tal, menos picos são observados na região alifático do que seria de esperar; embora sejam significativamente mais intenso e pode ser atribuído livremente pelas suas integrações (Tabelas 1 e 2). Por exemplo, ver as Figuras 1 e 2 para a estrutura química e espectros de 1 H RMN de de N, N '- (octano-1 ,8-di-il) bis (isonicotinamida), Piao, ligando. Devido à simetria da molécula cinco ressonâncias alifáticos que seria normalmente esperado para biao; mas os quatro picos mais metileno internos são todos magneticamente equivalente e mostrar-se como um grande ressonância a 1,2 ppm.
A ressonância do protão de amina de cadeia diaminoalcano desacoplada está localizado na região alifático e é a ressonância mais importante, uma vez que se move de forma significativa a jusante, na região aromática, depois do acoplamento to ácido carboxílico. A subsequente de ressonância do protão da amida é visto cerca de 8,7 ppm para todos estes ligandos, como uma relativamente ampla ressonância tripleto (Figura 2).
Coordenação do grupo da platina para os ligantes bispyridine é observado através de mudanças seletivas de ressonâncias aromáticos do ligante (0,15 ppm downfield turno das ressonâncias ha e 0,07 ppm upfield turno das ressonâncias HB) ea observância de acoplamento platina na ressonância gibão para o protões Ha (Figura 3). A coordenação dos grupos de platina para o ligando bispyridine também pode ser observada facilmente utilizando 195Pt RMN. O deslocamento químico de uma ressonância platina está diretamente relacionada com os tipos de átomos coordenados 21. Ligantes Chlorido deslocar 195 ressonâncias Pt downfield (para 0 ppm) e estou (m) ino ligantes mudar as ressonâncias upfield (em direção -2500 ppm). Os complexos de platina dinucleares sintetizados aqui mostram uma única r esonance torno -2300 ppm, devido ao 3 x h (m) e 1 x ino estado coordenação chlorido (Figura 4) 22. Não reagiu impureza transplatin iria mostrar como uma ressonância em torno de -2100 ppm enquanto que, se dois ligantes reagiu com uma única molécula transplatin (4 x am (m) ambiente ino), então este impureza seria upfield de -2400 ppm 22.
Esquema 1 As estruturas químicas dos fármacos de platina picoplatin e BBR3464 e o esquema geral de síntese para a síntese dos ligandos bispyridine e respectivos complexos dinucleares platina.; R = H ou CH 3; . n = 1-6 contra-íons para os complexos de platina foram omitidos; utilizando o método descrito aqui, eles são sais de dicloreto.
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A Figura 1 A estrutura química da N, N '-.. (Octano-1 ,8-di-il) bis (isonicotinamida) ligando, Piao, e o esquema de numeração de protões utilizado para atribuição das ressonâncias no 1 H NMR Nota a equivalência dos quatro protões de metileno (He) no centro da molécula.
A Figura 2 A 1 H RMN (DMSO-d 6, 400 MHz) Espectro de N, N '-. (Octano-1 ,8-di-il) bis (isonicotinamida), Biao Nota a localização da ressonância tripleto amida em torno de 8,7. ppm, um aumento de 1-2 ppm para a ressonância diaminooctano amina antes do acoplamento.
Figura 3. A 1 H RMN (D 2 O, 400 MHz) Espectro de trans-[{Pt (NH3) 2 Cl} 2 μ Biao] 2 +. Nota o acoplamento de platina na ressonância aromática Ha em 8,82 ppm.
Figura 4. A 195Pt RMN (D 2 O, 400 MHz) Espectro de trans-[{Pt (NH3) 2 Cl}. 2 μ-Biao] 2 + Observe o único ressonância ampla em torno de -2.300 ppm que é consistente com um ambiente PTN 3 Cl; N = am (m) ine.
Tabela 1 Os dados de 1 H RMN de caracterização dos ligandos bispyridine em DMSO-d 6 a 400 MHz d = dupleto..; t = tripleto; q = quarteto; m = multipleto.
Tabela 2. Os dados de caracterização 1 H RMN dos complexos de platina dinucleares em D 2 </ Strong> O a 400 MHz d = gibão.; t = tripleto; q = quarteto; m = multipleto.
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Discussion
Neste trabalho complexos dinucleares da platina têm sido sintetizados como agentes anti-cancerígenos potenciais. Ao fazê-lo bispyridine ligandos em ponte foram sintetizadas através de uma reacção de acoplamento de amida usando ácido isonicotínico e diaminoalcanos de comprimento variável. Anteriormente, a síntese de bispyridine ligantes e os seus análogos de metilo com 2 a 8 grupos de metileno e os seus respectivos complexos de platina têm sido relatados. Neste trabalho, o método de síntese e purificação foi revisto tornando mais rápido e mais barato e têm demonstrado isso por sintetizar ligantes bispyridine com 8, 10 e 12 grupos metileno (o mais curto com os oito grupos metileno, Biao, foi feito para comparar o novo método de purificação para o método mais antigo). Dinuclear complexos de platina também foram feitas usando esses ligantes.
A síntese dos ligandos bispyridine foi completada em solvente anidro e sob uma atmosfera de azoto inerte, usando trietilamina como uma base fraca eanidrido propilfosfónico como agente de acoplamento. De qualquer DMF ou o DMSO pode ser usado como solvente, apesar de o ácido isonicotínico dissolve melhor na DMSO do que o faz na DMF. Para qualquer solvente, aquecimento suave sob um riacho de água quente pode ser usada para facilitar a dissolução.
Este método antigo necessários tempos de reacção prolongados (vários dias) e um processo de purificação de múltiplos passos, incluindo a extracção líquido / líquido contra o éter dietílico e a neutralização com NaHCO3, a qual é agora eliminado. As reacções de síntese de ligandos são agora completada em poucas horas à temperatura ambiente, depois de todos os reagentes são adicionados em conjunto num único passo. Os ligantes bispyridine precipitar a partir da solução com a adição de água (para ligandos com 8 ou menos grupos metileno) e precipitar a partir da solução após formação para os 10 e os 12 ligantes grupo metileno. Todos os ligantes pode ser recristalizado a partir de água em ebulição e, em alguns casos, a sua lenta recrystallzação pode produzir cristais adequados para a difração de raios-X.
Os complexos de platina bicíclicos são formados por reacção de duas moles de transplatin para uma mole de ligandos bispyridine. O efeito de trans-labializing dos ligandos chlorido garante que o produto principal é a coordenação das drogas de platina através de um sítio único no ligandos bispyridine (o átomo de azoto do anel). Os complexos de platina dinucleares tem boa solubilidade como sais dication tanto na água, DMF e DMSO.
A purificação é conseguida por precipitação fraccionada utilizando acetona. A impureza não identificada antes que o produto precipita e é retirado por filtração através de papel de filtro de poros estreitos. É importante notar que a precipitação por acetona funciona melhor com uma quantidade crescente de produtos para ser purificada. No valor inferior a 200 mg, o método não funcionar tão bem e precipitações repetidas acetona pode ser necessária. Para valores em torno de 200 mg oumais descobrimos que as etapas individuais de precipitação acetona são geralmente apenas necessário.
Embora este documento detalha a síntese de ligandos específicos e complexos de platina, as técnicas utilizadas aqui podem ser aplicados para sintetizar uma variedade muito maior de ligandos e complexos de platina multinucleadas. Por exemplo, com grupos de protecção adequados outros ligandos diaminoalcano, tais como espermina e espermidina, pode ser usado para fazer ligandos bispyridine. Ligantes bispyridine não-simétricos pode também ser feita usando ácido isonicotínico em uma extremidade e de 2-metil-isonicotínico, na outra extremidade. Estes ligantes não-simétricos pode ser gerado através da utilização de FMOC / BOC-protecção de uma extremidade das cadeias de diaminoalcano. A amina desprotegido da cadeia pode ser reagido com um derivado de isonicotínico usando as reacções de acoplamento de amida descritos. O grupo protector é, então, clivado a partir da cadeia de diaminoalcano e um derivado diferente do ácido isonicotínico é ligado por meio de umoutra reacção de acoplamento de amida. Complexos de platina trinucleares também poderiam ser feitas usando qualquer um destes ligantes por meio de uma adaptação de um método utilizando ligantes baseados em pirazolilo fazer trinucleares, BBR3464 semelhante, os complexos de 22.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 151882 | 99.9% D |
| DMSO-d6 | Aldrich | 156914 | 99.96% D |
| 1,8-diaminooctane | Aldrich | D22401 | 98% |
| 1,10-diaminodecane | Aldrich | D14204 | 98% |
| 1,12-diaminododecane | Aldrich | D1,640-1 | 98% |
| Isonicotinic acid | Aldrich | I17508 | 99% |
| 1-Propylphosphonic anhydride solution | Aldrich | 431303 | 50 wt% in ethyl acetate |
| Trans-diaminodichloridoplatinum(II) | Aldrich | P1525 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | Z76855 | >99.9%, anhydrous |
| N,N’-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | 99.8%, anhydrous |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886 | >99% |
| Nylon filter membranes | Whatman | 7402-004 | Pore size, 0.2 µm |
| Magnetic stirring hotplate | |||
| Magnetic stirring bar | |||
| Round bottom or three neck flask | |||
| Rubber septums of sufficient size for chosen round bottom or three neck flask | |||
| 5 ml hypodermic syringes | |||
| Hypodermic needles | |||
| Rubber party ballons | |||
| Rubber bands | |||
| A source of N2 gas | |||
| Rotary evaporator | |||
| Drying oven | |||
| NMR tubes | |||
| NMR spectrometer | |||
| 500 ml beakers | |||
| Glass or plastic pipettes |
References
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