Summary
这个协议描述了使用异烟酸和二氨基烷烃的酰胺偶联反应，以形成适合于在多核铂配合物，其中结合的抗癌药物BBR3464和吡铂方面的合成中使用的桥接配体。
Introduction
铂抗癌药物残留的药物在人类癌症的治疗1最广泛使用的家庭中的一个。尽管取得了成功，它们在各自的应用程序有严重的剂量限制性副作用2-4限制。有限的剂量可给予患者也意味着肿瘤可产生耐药性5。因此，新的药物不断被开发以改善的副作用特性和克服获得性抗性，如phenanthriplatin 6和phosphaplatin 7。
20世纪90年代后期，三核铂类药物的开发，BBR3464（ 方案1）8，比领先的铂类药物，顺铂在体外高达1000倍以上的细胞毒性。 BBR3464也能够克服获得抗性的人类肿瘤细胞株9的面板。不幸的是，BBR3464的活性增加匹配由50 - 100 - 倍的毒性，这限制了它的使用10-12。它也易于降解在体内，这意味着该药物很少到达肿瘤细胞核完好9。
吡铂是一种单核铂为基础的药物，其中包含2 -甲基-吡啶配体（ 方案1）13。这种药物的甲基保护它免受攻击生物亲核试剂;特别是半胱氨酸和含有肽/蛋白质14-16蛋氨酸。因此，该药物是相当稳定的，并具有高得多的浓度与两个BBR3464，顺铂17相比到达癌的细胞核。它的反应性降低也意味着吡具有较高的最大耐受剂量与BBR3464，顺铂10,18,19比较。
因此，该项目旨在结合BBR3464和吡铂的属性，以产生新的药物，是能够克服的获得性耐药的显示改进的生物稳定性和不太严重的副作用EFFE仙（ 例如 ， 图1）。在这样做时，制备了双吡啶桥联配体20的范围内的双核铂络合物。的配位体使用的酰胺偶联反应，用异烟酸，或如2 - 甲基 - 异烟酸，可变长度的二氨基烷烃及其衍生物制成。的配位体的1摩尔当量与transplatin的2摩尔当量反应得到所需的铂络合物（ 方案1）。
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Protocol
1对N，N'的合成1 - （烷-1，N-二基）diisonicotinamide
- 干燥烘箱中（100℃，1小时）一个单颈或三颈圆底烧瓶中，以确保除去所有水分。
- 添加固体异烟酸，或其衍生物，以连同磁力搅拌棒的烧瓶中。如果二氨基配体（S）的固体在室温下，然后0.5摩尔（以异烟酸的摩尔数）加入到烧瓶中，在这个阶段。
- 帽用橡胶隔片烧瓶的颈部（次），要么通过连续的氮气流中或通过使用氮气填充的气球代替空气与氮气的烧瓶中。
- 用皮下注射针和注射器添加无水二甲基甲酰胺或二甲亚砜（每500毫克异烟酸，2 - 甲基 - 异烟酸4毫升）以溶解固体。如果固体不容易溶解，然后轻轻加热溶液。
- 新增7摩尔当量（以一安装三乙胺（弱碱）和二氨基烷烃0.5摩尔当量使用异烟酸）的。如果溶液是液体在室温下，再加入1.5摩尔当量。
- 添加1 - 丙基膦酸酐（偶联剂）1摩尔当量在连续搅拌下，让反应完成超过5-12小时。
的配体的2。纯化
- 对于双吡啶配体用二氨基配有10个以上亚甲基制成，等待产品从溶液中沉淀随着反应的进行。
- 使用二氨基联吡啶配体的制造中，在约40毫升的水沉淀产物。
- 使用五点五十八亚甲基基团的二氨基烷烃双吡啶制成，添加〜40毫升的水，并允许该化合物结晶过1-3天。
- 通过真空过滤收集每个双吡啶配体及由约400-500毫升沸水重结晶，每200毫克配体。注：需要，因为它们大大减少水中的溶解度越长双吡啶配体更多的水。
- 添加NaOH和KOH（pH为9）的溶液，以确保化合物是经重结晶游离碱。
3，合成了双核铂配合物的纯化
- 充分溶解反式 diamminodichloridoplatinum（II）中，transplatin，在热的（70-80℃）水（每200毫克transplatin 150毫升）中，以产生清晰的强黄色溶液。
- 添加双吡啶配体的0.5摩尔当量和搅拌溶液在温度，直到配体溶解（透明溶液）。等待该溶液转接近无色，关火，并在室温下搅拌了几个额外小时。
- 通过旋转蒸发除去溶剂，将得到黄色粉末。
- 净化，铂络合物（ES）溶解在温水的最低金额（〜50＆＃186，C）。如果剩余的黄色或白色的固体都存在，然后过滤这些了。
- 加丙酮至这似乎是金属配合物的聚合形式，并代表最多的反应产物的10％，直至白色沉淀物形成的溶液。继续加入丙酮（〜额外20-30毫升），直至没有更多的沉淀出现。注意：此白色沉淀物是杂质。
- 通过尼龙滤纸（0.2微米孔径）和旋转剩余的溶液至干，将得到的纯品的蒸发过滤的内容中移除该沉淀物。注：如有必要，可直到复杂的是纯粹的进行再额外丙酮沉淀步骤。
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Representative Results
的双吡啶配体和它们各自的双核铂络合物的特征在于，用1 H，13 C和195的Pt NMR（ 表1和2），和电喷雾电离质谱法。准确的熔点可以使用差示扫描量热法和纯度最好是通过元素分析的C，H和N的百分含量测定来确定。最普遍使用的是1 H-NMR，因为它是快速和易于使用的，给人以共鸣，能够明确证明成功酰胺耦合和铂协调（ 表1和表2）最终产品的隔离分钟内的结果。
异烟酸有三个共振;在芳族区域的两个二重峰（7-9 ppm）的一个非常广泛的谐振约13 ppm的羧酸质子。的二氨基烷烃质子共振均位于脂肪族区域1和4 ppm的之间。为t他的二氨基烷烃链增长多亚甲基共振的长度成为相等的，因此，更少的峰中观察到的脂肪族区域比预期;虽然它们是显著更强烈，并且可以通过整合（ 表1和表2）松散地分配。例如参见图1和图2的化学结构和N，N'的1 H NMR谱- （辛烷-1,8 -二基）双（异烟酰胺），标，配体。由于对称性的分子在5脂族共振通常会被预期为标;但四个内最亚甲基峰是所有磁等价的，并显示为一个大的共振〜1.2 ppm的。
非耦合二氨基烷烃链的胺的质子共振位于脂肪族区域，并且是最重要的共振，因为它移动显著前冲，进芳香区域，在耦合吨Ø羧酸。随后的酰胺质子共振被看见周围8.7 ppm的所有这些配体，作为一个比较宽三重共振（ 图2）。
铂族的双吡啶配体的协调是通过配体的芳族共振（0.15 ppm的低磁场的哈共振转移和0.07 ppm的高场血红蛋白共振转移），并在二重共振遵守铂耦合的用于选择性地转移观察哈质子（ 图3）。铂基团的双吡啶配体的协调也可以用195的Pt NMR容易观察到。铂共振的化学位移直接相关的协调21原子的类型。 Chlorido配体转移195铂共振前冲（朝0 PPM）和AM（M）鲍配体转移的共振高场（朝-2,500 ppm的）。这里合成的双核铂配合物表现出单R esonance周围-2,300 ppm的由于3×上午（米）鲍和1×chlorido协调的状态（ 图4）22。未反应transplatin杂质会显示为一个共振周围-2,100 ppm的，而如果两个配体与单一transplatin分子（4×分（M）伊诺环境）反应，那么这种杂质会是-2,400 ppm的22高场。
方案1的铂类药物吡铂和BBR3464和用于双吡啶配体和它们各自的双核铂络合物的合成的一般合成方案的化学结构; R = H或CH 3; N = 1-6反离子的铂配合物已经被省略;通过使用这里描述的方法，它们是二氯化盐。
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图1中的N，N'的化学结构- （辛烷-1,8 -二基）双（异烟酰胺）配体，标，并用于在1 H-NMR的共振分配质子编号方案 ，请注意等价四亚甲基质子（赫）在该分子的中心。
图2中的1 H-NMR（DMSO-D 6，400兆赫）的N，N'谱- （辛烷-1,8 -二基）双（异烟酰胺），标注三重酰胺共振的位置在大约8.7。 ppm时，从1-2 ppm的耦合前二氨基胺共鸣。
图3：1 H-NMR（D 2 O，400兆赫）反式频谱[{铂（NH 3）2氯} 2μ标] 2 +。注意铂耦合的芳香哈共振8.82 ppm的。
图4，195铂核磁共振（D 2 O，400兆赫）的频谱反式- [{铂（NH 3）2氯}2μ标] 2 +注单宽共振周围-2,300 ppm的附带PTN 3氯环境相一致; N =时（m）我的。
表1在400兆赫峰d =双峰的双吡啶配体在DMSO-D 6中的1 H NMR的特征数据; t =三重峰; q =四重; m =多重峰。
表2的双核铂络合物在D 2的1 H NMR的特征数据</ STRONG> 0，在400 MHz的 D =双峰; t =三重峰; q =四重; m =多重峰。
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Discussion
在此工作的双核铂络合物合成了作为潜在的抗癌药物。这样做是通过使用异烟酸和可变长度的二氨基烷烃酰胺偶联反应合成的双吡啶桥连配体。先前的双吡啶配体和其甲基类似物具有2至8个亚甲基基团和它们各自的铂配合物的合成已有报道。在本文中，合成和纯化方法已修订，使其更快，更便宜，已经证明了这一点通过合成双吡啶配体与8，10和12的亚甲基（最短与八亚甲基，彪，被做了比较新的纯化方法的旧方法）。双核铂配合物利用这些配体也。
的双吡啶配位体的合成是使用三乙胺作为弱碱的无水溶剂和惰性氮气氛下完成，并丙基膦酸酐作为偶联剂。无论是DMF或DMSO中，可以用作溶剂，虽然异烟酸溶解在DMSO中比它在DMF中。对于任一溶剂，在热水的运行流温和加热可用于帮助溶解。
这个老方法需要较长的反应时间（天数）和一个多步骤纯化工艺，包括液/液萃取对二乙醚及中和用NaHCO 3，这是目前消除。该配体的合成反应正在完成的在室温下几小时后，所有的反应物加到一起在一个步骤。的双吡啶配体从溶液中沉淀通过加入水（对于配体具有8个或更少个亚甲基），并从在形成溶液为10和12亚甲基基团的配位体中沉淀出来。所有的配体可从沸腾的水，在某些情况下，它们缓慢recrystall重结晶化可以产生适于X射线衍射的晶体。
的双核铂配合物是由transplatin的2摩尔反应的双吡啶配体的1摩尔制成。该chlorido配体的反式labializing效果确保了主要产物是通过对双吡啶配体（该环的氮原子）单活性中心配位的铂类药物。该双核铂配合物具有良好的溶解性为二价阳离子盐在水，DMF和DMSO。
净化是通过分级沉淀，用丙酮实现。本产品之前，身份不明的杂质沉淀和过滤，通过细孔滤纸被删除。重要的是要注意，丙酮沉淀作品更好地与产品的待纯化增加量。在低于200毫克量，该方法不工作，以及和丙酮反复降水可能被要求。对于约200毫克或金额以上我们已经发现，一般只需要单一的丙酮沉淀步骤。
虽然本文详述的特定的配体和铂配合物的合成，此处所使用的技术可以应用到合成更广范围的配位体和多核铂配合物。例如，用合适的保护基团等二氨基配体，如精胺和亚精胺，可用于制造双吡啶配体。非对称双吡啶配体也可以通过使用异烟酸在一端制成并在其另一端-2 - 甲基 - 异烟酸。这些非对称配位体可通过对二氨基烷烃链的一端使用FMOC / BOC-保护的产生。链的无保护的胺可与具有使用所述的酰胺偶联反应一异烟酸衍生物。该保护基，然后从二氨基烷烃链裂解和异烟酸的不同衍生物是使用一个附加的其它酰胺偶联反应。三核铂配合物也可能被使用的吡唑基配位体，以使通过三核的方法的适应使用任何这些配体的制造，BBR3464状，复合物22。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 151882 | 99.9% D |
| DMSO-d6 | Aldrich | 156914 | 99.96% D |
| 1,8-diaminooctane | Aldrich | D22401 | 98% |
| 1,10-diaminodecane | Aldrich | D14204 | 98% |
| 1,12-diaminododecane | Aldrich | D1,640-1 | 98% |
| Isonicotinic acid | Aldrich | I17508 | 99% |
| 1-Propylphosphonic anhydride solution | Aldrich | 431303 | 50 wt% in ethyl acetate |
| Trans-diaminodichloridoplatinum(II) | Aldrich | P1525 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | Z76855 | >99.9%, anhydrous |
| N,N’-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | 99.8%, anhydrous |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886 | >99% |
| Nylon filter membranes | Whatman | 7402-004 | Pore size, 0.2 µm |
| Magnetic stirring hotplate | |||
| Magnetic stirring bar | |||
| Round bottom or three neck flask | |||
| Rubber septums of sufficient size for chosen round bottom or three neck flask | |||
| 5 ml hypodermic syringes | |||
| Hypodermic needles | |||
| Rubber party ballons | |||
| Rubber bands | |||
| A source of N2 gas | |||
| Rotary evaporator | |||
| Drying oven | |||
| NMR tubes | |||
| NMR spectrometer | |||
| 500 ml beakers | |||
| Glass or plastic pipettes |
References
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Trans. 39, 8113-8127 (2010).
- Kiernan, M. C. The pain with platinum: oxaliplatin and neuropathy. Eur. J. Cancer. 43, 2631-2633 (2007).
- Markman, M., et al. Clinical features of hypersensitivity reactions to carboplatin. J Clin. Oncol. 17, 1141-1145 (1999).
- Ding, D., Allman, B. L., Salvi, R. Review: Ototoxic characteristics of platinum antitumor drugs. Anatomical Rec. 295, 1851-1867 (2012).
- Galluzzi, L., et al.
- Park, G. Y., Wilson, J. J., Song, Y., Lippard, S. J. Phenanthriplatin, a monofunctional DNA-binding platinum anticancer drug candidate with unusual potency and cellular activity profile. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 11987-11992 (2012).
- Moghaddas, S., et al. next generation platinum antitumor agents: A paradigm shift in designing and defining molecular targets. Inorg. Chim. Acta. 393, 173-181 (2012).
- Farrell, N. P. Platinum formulations as anticancer drugs clinical and pre-clinical studies. Curr. Top. Med. Chem. 11, 2623-2631 (2011).
- Wheate, N. J., Collins, J. G. Multi-nuclear platinum complexes as anti-cancer drugs. Coord. Chem. Rev. 241, 133-145 (2003).
- Gourley, C., et al. A phase I study of the trinuclear platinum compound, BBR3464, in combination with protracted venous infusional 5-fluorouracil in patients with advanced cancer. Cancer Chemoth. Pharmacol. 53, 95-101 (2004).
- Calvert, A. H., et al. Phase II clinical study of BBR3464, a novel, bifunctional platinum analogue, in patients with advanced ovarian cancer. Eur. J. Cancer. 37, (2001).
- Jodrell, D. I., et al. Phase II studies with BBR3464, a novel tri-nuclear platinum complex, in patients with gastric or gastro-oesophageal adenocarcinoma. Eur. J. Cancer. 40, 1872-1877 (2004).
- William, W. N., Glisson, B. S. Novel strategies for the treatment of small-cell lung carcinoma. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 611-619 (2011).
- Raynaud, F., et al. cis-Amminedichloro(2-methylpyridine) Platinum(II) (AMD473), a novel sterically hindered platinum complex: In vivo activity, toxicology, and pharmacokinetics in mice. Clin. Cancer Res. 3, 2063-2074 (1997).
- Holford, J., et al. biochemical and pharmacological activity of the novel sterically hindered platinum co-ordination complex cis-[amminedichloro(2-methylpyridine)] platinum(II) (AMD473). Anti-Cancer Drug Des. 13, 1-18 (1998).
- Munk, V. P., et al. Investigations into the interactions between DNA and conformationally constrained pyridylamine platinum(II) analogues of AMD473. Inorg. Chem. 42, 3582-3590 (2003).
- Wheate, N. J., Collins, J. G. Multi-nuclear platinum drugs: A new paradigm in chemotherapy. Curr. Med. Chem. - Anti-Cancer Agents. 5, 267-279 (2005).
- Beale, P., et al. A phase I clinical and pharmacological study of cis-diamminedichloro(2-methylpyridine) platinumm II (AMD473). British journal of cancer. 88, 1128-1134 (2003).
- Sessa, C., et al. Clinical and pharmacological phase I study with accelerated titration design of a daily times five schedule of BBR3464, a novel cationic triplatinum complex. Ann. Oncol. 11, 977-983 (2000).
- Brown, S. D., et al. Combining aspects of the platinum anticancer drugs picoplatin and BBR3464 to synthesize a new family of sterically hindered dinuclear complexes; their synthesis, binding kinetics and cytotoxicity. Dalton Trans. 41, 11330-11339 (2012).
- Still, B. M., Anil Kumar, P. G., Aldrich-Wright, J. R., Price, W. S. 195Pt NMR - Theory and application. Chem. Soc. Rev. 36, 665-686 (2007).
- Wheate, N. J., Cullinane, C., Webster, L. K., Collins, J. G. Synthesis, cytotoxicity, cell uptake and DNA interstrand cross-linking of 4,4'-dipyrazolylmethane-linked multinuclear platinum anti-cancer complexes. Anti-Cancer Drug Des. 16, 91-98 (2001).
