Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Glat muskulatur i blæren Strip Kontraktilitet som en metode til at evaluere nedre urinveje Farmakologi

Published: August 18, 2014 doi: 10.3791/51807
Automatic Translation
1, 2, 2, 1,2
1Department of Medicine, Renal division, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Pharmacology and Chemical Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Dette håndskrift præsenterer en enkel, men kraftfuld, in vitro-metode til evaluering af den glatte muskulatur kontraktilitet som reaktion på farmakologiske midler eller nerve stimulation. Vigtigste anvendelser er narkotika screening og forståelse væv fysiologi, farmakologi og patologi.

Abstract

Vi beskriver en in vitro-metode til måling af glat muskulatur i blæren kontraktilitet og dets anvendelse til undersøgelse af fysiologiske og farmakologiske egenskaber af den glatte muskulatur samt ændringer induceret af patologi. Denne metode giver vigtige oplysninger for forståelsen af blære funktion, mens overvinde væsentlige metodologiske vanskeligheder i in vivo forsøg, såsom kirurgiske og farmakologiske manipulationer, der påvirker stabiliteten og overlevelsen af de præparater, anvendelse af humant væv og / eller brug af dyre kemikalier. Det giver også en måde at undersøge egenskaberne for hver enkelt blære komponent (dvs. glat muskulatur, slimhinder, nerver) hos raske og patologiske tilstande.

Urinblæren fjernes fra et bedøvet dyr, anbringes i Krebs-opløsning og skåret i strimler. Strimlerne anbringes i et kammer fyldt med varm Krebs-opløsning. Den ene ende er fastgjort til en isometrisk overfladeaktivitetn transducer til at måle kontraktion kraft, den anden ende fastgjort til en fast stang. Væv stimuleres ved direkte tilsætning af forbindelser til badet eller ved elektrisk feltstimulering elektroder, der aktiverer nerver, svarende til udløsning blærekontraktioner in vivo. Vi demonstrere brugen af ​​denne metode til at evaluere spontan glatte muskler kontraktilitet under udviklingen og efter en eksperimentel rygmarvsskade, arten af ​​neurotransmission (sendere og receptorer, der er involveret), faktorer involveret i modulering af glatte muskel aktivitet, rolle enkelte blære komponenter og arter og orgel forskelle i respons på farmakologiske midler. Derudover kan det bruges til at undersøge intracellulære signalveje involveret i sammentrækning og / eller afslapning af den glatte muskulatur, narkotika struktur-aktivitet-relationer og evaluering af senderen udgivelse.

In vitro-glat muskel kontraktilitet metode har været anvendt i udstrakt grad for over 50 år, og har leveret data, der væsentligt har bidraget til vores forståelse af blære funktion samt til farmaceutisk udvikling af forbindelser i øjeblikket anvendes klinisk til blære ledelse.

Introduction

Blæren glatte muskulatur slapper at tillade urin opbevaring og kontrakter for at fremkalde urin elimination. Afslapning er medieret af iboende glatte muskelceller egenskaber og tonic frigørelse af noradrenalin (NA) fra de sympatiske nerver, som aktiverer beta-adrenerge receptorer (β 3 AR i menneskelig) i detrusor. Voiding opnås ved at hæmme sympatisk input og aktivere det parasympatiske nerver, der frigiver ACh / ATP til sammentrække glat muskulatur i blæren 1. Talrige patologiske tilstande, herunder hjerne og / eller rygmarvsskade, neurodegenerative sygdomme, diabetes, blæreafløbshindring eller interstitiel cystitis, kan dybt ændre blære funktion, med alvorlig indvirkning på patientens livskvalitet 2. Disse betingelser ændrer kontraktilitet af den glatte muskulatur ved at påvirke en eller flere komponenter i blæren: den glatte muskulatur, afferente eller efferente nerver og / ellerslimhinde.

Adskillige in vivo og in vitro metoder til at studere blære funktion er blevet udviklet. In vivo cystometry er den primære måling af blærefunktion. Selvom dette er et intakt præparat, der tillader indsamling af oplysninger under tæt på fysiologiske betingelser, er der en række forhold, hvor brugen af ​​glatte muskelceller strimler foretrækkes. Disse omfatter situationer, hvor kirurgisk og / eller farmakologiske manipulationer kan påvirke overlevelse og stabilitet in vivo forberedelse, eller når undersøgelser vil kræve anvendelse af humant væv eller dyre kemikalier. Denne metode fremmer også en undersøgelse af virkningerne af narkotika, alder og patologi på hver komponent af blæren, dvs glat muskulatur, slimhinder, afferent og efferente nerver.

Blære strimler har været beskæftiget i årenes løb af mange grupper til at besvare en række videnskabelige spørgsmål. De blev anvendt til at evaluate ændringer i myogene spontan aktivitet induceret af patologi. Denne aktivitet menes at medvirke til, hvor meget og frekvens symptomer på overaktiv blære (OAB), og er derfor et mål for lægemidler, der udvikles til OAB 3-9. Blære strimler blev også brugt til at undersøge myogene og neuronale faktorer, der modulerer glat muskel-tonus med det formål at opdage ionkanaler og / eller receptorer, og / eller intracellulære signalveje, der kan målrettes til at inducere enten afslapning eller sammentrækning af den glatte muskulatur 3,10- 13. Andre undersøgelser har fokuseret på arten af neurotransmission, herunder sendere og receptorer involveret og ændringer induceret af patologi 14,15. Desuden er metoden blevet brugt til sammenligninger mellem væv fra forskellige arter 16- 18, mellem organerne 19-21, samt evaluering af narkotika struktur-aktivitets relationer 22-24. En udvidelse af denne fremgangsmåde er blevet anvendt til measure effekten af lægemidler på senderen frigivelse fra efferente nerver 25. Endvidere en række forskellige væv (blære, urinrøret, mave-tarmkanalen, GI) høstet fra dyr eller mennesker (fra kirurgi eller organdonor væv godkendt til forskning) og fra en række forskellige dyremodeller, herunder rygmarvsskade (SCI), blæreafløbshindring (BOO) eller interstitiel cystitis (IC) kan undersøges ved hjælp af denne teknik.

I dette papir vil vi illustrere brugen af ​​denne metode sammen med de nødvendige forsøgsprotokoller, til at behandle en række videnskabelige spørgsmål, der er nævnt ovenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer er beskrevet her, er godkendt af IACUC udvalget på University of Pittsburgh.

1. Opløsninger

  1. Forbered Krebs-opløsning i henhold til opskriften. Sammensætning i mM: NaCI 118, KCI 4,7, CaCl2 1,9, MgSO4 1,2, NaHCO3 24,9 KH 2 PO4 1,2, dextrose 11,7.
  2. Luftes Krebs med 95% O 2, 5% CO2 og placere den i et 37 ° C vandbad skal anvendes i hele eksperimentet. Placer side ~ 200 ml beluftet Krebs-opløsning ved stuetemperatur, der skal anvendes til væv dissektion.
  3. Mål pH (~ 7,4) og osmolaritet (~ 300 mOsm) i beluftet Krebs.

2. forsøgsopstilling (Skematisk figur 1A)

  1. Fyld beluftet (95% O 2, 5% CO 2) kamre med 10 ml Krebs.
  2. Start cirkulerende vand pumpe til at opvarme kamrene til 37 ° C; tænde det nødvendige udstyr: forstærker (r), stimulator (s) og optagelse software.
  3. Kalibrere transducere med en 1 g vægt.

3. væv (figur 1B)

Fjern blæren fra en voksen naive Sprague Dawley rotter (200-250 g ~ 10-12 uger gamle) følge disse trin:

  1. Forbered dissektion område og nødvendige instrumenter: elektriske barbermaskiner, pincet med tænder, skalpelblad, dissekere saks, microscissors to dissekere pincet (forfattere foretrækker Dumont pincet # 3), væv klip (eller silkesutur), en Sylgard belagt dissektion fad med Krebs og væv dissektion ben.
  2. Bedøver dyret med isofluran inhalation (4% i O 2) i den induktion kammer. Brug veterinær salve på øjnene for at forhindre tørhed, mens under anæstesi. Løbende overvåge niveauet af anæstesi ved at observere respirationsfrekvens, reaktion på ydre stimuli, og tab af bageste lemmer trække refleks.
  3. Når dyret er bedøvet barbering nederst på maven etrea. Expose bækken organer via en midterlinjen abdominal incision. Identificer blæren og urinrøret. Fjern blæren ved at skære ved blærehalsen tæt proximale urinrøret. Placer vævet straks i Sylgard belagt fad fyldt med beluftet Krebs-opløsning.
  4. Hvis det er nødvendigt, fjernes yderligere væv på dette tidspunkt: urinrøret, stykker af gastrointestinale (GI) kanal og / eller prostatacancer, osv
  5. Sacrifice dyret ved hjælp IACUC godkendte metoder (f.eks bedøvende overdosis eller CO 2 kvælning efterfulgt af en sekundær metode).
  6. Indsæt væv dissekere stifter gennem blære dome, nakke og urinledere, at stabilisere væv til yderligere dissektion. Du må ikke strække vævet. Fjern fedt, bindevæv, proximale urinrør og urinledere hvis til stede.
  7. Åbn blæren fra basen til kuplen for at skabe et fladt ark, serosa nedad / luminale opad (figur 1B). Placer dissekere benene på hvert hjørne af vævet. Fjern blære dome og hals væv.
  8. Hvis formålet med forsøget er at bestemme bidraget af slimhinden (urothelium og lamina propria - se diagram 1C) til kontraktion af glat muskulatur, sammenligne egenskaberne af detrusor strimler med og uden slimhinden fastgjort. For dette, før skære vævet i strimler, fjern forsigtigt slimhindelaget hjælp iris foråret saks og fine pincet under et dissektionsmikroskop. Ved afslutningen af ​​forsøget fastsætte strimlerne for H & E-farvning for at bekræfte fuldstændig fjernelse af mucosa. Bemærk, at denne procedure er lettere i muse blære end i rotte blæren.
  9. Skær vævet længderetningen fra base til kuppel i strimler på ~ 2 x 8 mm (figur 1B). Bind eller vedhæfte et væv klip til begge ender af hver strimmel.
    BEMÆRK: En rotte blære kan normalt skæres i 4 strimler, men det antal strips kan stige eller falde, afhængigt af dyret / blære størrelse.
  10. Overfør strimlerne til experimental kamre. Sæt den ene ende af hver strimmel til en krafttransducer, der måler væv sammentrækning, og den anden til en fast glas / metalstang.
    BEMÆRK: vævskamre varierer i størrelse (0,2 ml til 20 ml eller større). Typiske kamre til gnavere blærer er 5-20 ml, der giver tilstrækkelig højde for strimlerne at være helt nedsænket i opløsningen. Nogle kamre kommer med indbygget stimulation elektroder, andre ikke. Der bør udvises omhu for at sikre, at alle tilslutninger af elektroderne er i god stand, ellers elektrisk felt stimulation ikke er pålidelig.
  11. Påfør en defineret mængde kraft til hver strimmel ved forsigtigt at strække vævet før baseline spænding når 1 g (~ 10 MN). Oprindeligt vævet tendens til at slappe af, der er registreret som et fald i baseline spænding. Vask væv cirka hver 15 minutter ved hjælp af den varme beluftet Krebs og justere baseline spænding til 1 g efter hver vask. Tillad væv i ligevægt for ~ 1-2 timer eller indtil baseline spænding er stabil (dvs ingen yderligere væv afslapning).
  12. Test vævslevedygtighed ved tilsætning af KCI (80 mM) direkte til badet for ~ 5 min, eller indtil et plateau respons er nået. Reaktionerne høje koncentrationer af KCI kan også gentages under forsøget eller ved afslutningen af ​​eksperimentet og anvendes til at normalisere reaktioner på andre stoffer eller mellem strimlerne (se normalisering under dataanalyse afsnit).
  13. Vask væv flere gange (3-5x) med varmt beluftet Krebs for at tillade væv at vende tilbage til præ-behandling betingelser.

4. Stimulering protokoller

  1. For at undersøge virkningerne af patologi på spontan myogene aktivitet eller glat muskel-tonus, anvender glatte muskelstrimler fra forskellige dyremodeller såsom SCI BOO eller nyfødte. Figur 2 illustrerer anvendelsen af denne metode til at undersøge ændringer i blæren spontan aktivitet under udviklingen og efter SCI. Endvidere kan farmakologiske midler anvendes til at modulere spontaneous aktivitet. Figur 3 illustrerer virkningen af KCNQ kanalmodulatorer, flupirtin og XE991, på spontan aktivitet og glat muskel-tonus.
  2. For farmakologiske glatte muskelstimulation konstruere koncentration respons kurver ved at tilføje forbindelser fra koncentrerede stamopløsninger direkte til badet ved fastlagte tidsintervaller. Stofbrug og køretøj i parallelle baner til at redegøre for køretøjer og påvirkninger.
    1. Gør stamopløsninger af de ønskede testforbindelser på 1000x den endelige bearbejdning koncentration. For carbachol (CCh), en muscarinreceptor agonist, forberede følgende bestande: 10 -5 M, 3 x 10 -5 M, 10 -4 M, 3 x 10 -4 M, 10 -3 M, 3 x 10 -3 M , 10 -2 M. Endelige koncentrationer i badet er 10 -8 M til 10 -5 M (figur 4C, D). For neuromedin B (NMB), en bombesinreceptoren undertype 1 agonist, forberede følgende bestande: 10 -8 M, 10 -7M, 10 -6 M, 10 -5 M, 10 -4 M, 10 -3 M og endelige koncentrationer i badet er 10 -11 M til 10 -6 M. Både CCh og NMB ventes at stige væv kontraktilitet.
    2. Til et 10 ml vævsbad tilsættes 10 ul af hver CCh stamopløsning, så snart svaret når et plateau (figur 4C, D). I parallelle baner tilføje lige store mængder af køretøjet (vand). Ligeledes tilsættes 10 ul af hver neuromedin B stamopløsning hver ~ 5 min.
      BEMÆRK: Vær opmærksom på excitatoriske effekt af NMB og CCh på glat muskeltonus i strimler fra forskellige arter i figur 4.
    3. Undersøg afslapning egenskaber af de glatte muskler i præ-kontrakt væv med en excitatorisk middel, sædvanligvis CCh eller KCI.
    4. For at blokere en agonist respons forbehandle væv til 10-20 min med antagonisten at tillade vævspenetration før agoniststimulering.
  3. For neurale stimulation af den glatte muskulatur, også kaldet elektrisk felt stimulering (EFS) følge trin 1 til 3.13 og fortsætte som beskrevet nedenfor. EFS er beregnet til at aktivere selektivt nerver versus glatte muskulatur. Parametre for stimulering bør nøje udvalgt for at undgå direkte glatte muskelstimulation.
    1. Etablere stimuleringsparametre: type stimulus (enlige impulser eller tog), varighed (puls varighed og tog varighed), hyppighed og intensitet, som beskrevet i trin nedenfor og illustreret i figur 5A, B.
      1. For enkelt puls stimulering, sæt puls varighed, inter-stimulus interval og antallet af stimuli ønskede. Sædvanlige stimulering varighed parametre er enlige pulser af 0,05-0,3 ms varighed leveret ved ønskede intervaller (figur 5A). Følg trin 4.3.1.4 til stimulus intensitet.
      2. Til tog stimulering indstille toget varighed og inter tog interval. Typiske værdier for blære væv 3-10 sek leveret mindst 1 mi hinanden (figur 5B). Hvis væv træthed indtræder (dvs. EFS-sammentrækninger falde under kontrol periode), øge inter toget interval.
      3. Fastsætte hyppigheden af ​​toget stimuli (antal impulser i et tog - Figur 5B). Kør en frekvenskurve spænder fra 0,5 til 50 Hz. Typiske frekvenser til blæren er 10-20 Hz, som giver reproducerbare og stabile sammentrækninger medieret af ATP og ACh. Overhold frekvensafhængige reaktioner på EFS stimulering i mus blære strimler i figur 5 viser, hvordan denne metode kan anvendes til at vurdere bidraget af kolinerge og purinerge mekanismer til neurotransmission.
      4. Etablering af intensiteten af ​​stimulus: systematisk øge intensiteten (spænding) af stimulus, indtil amplituden af ​​sammentrækning når et plateau (hvis hjælp togene holde frekvensen konstant).
      5. Indstille intensiteten af ​​stimulus afhængigtFormålet med eksperimentet. Hvis målet er at øge neuralt fremkaldte kontraktioner, derefter bruge submaksimal intensitet, således at amplituden af ​​sammentrækning er ~ 50% af maksimal kontraktion. Hvis målet er at mindske neuralt fremkaldte sammentrækninger, derefter indstille intensiteten til ~ 80% af maksimal amplitude for at undgå væv træthed.
    2. Når stimulering parametre (varighed, hyppighed og intensitet) er etableret, tillade ~ 20-30 min for EFS- fremkaldte sammentrækninger at stabilisere sig før narkotika testning.
      BEMÆRK: For at kontrollere selektiviteten af EFS for neural transmission, blok neurale transmission med Na +-kanal blokker, tetrodotoxin (TTX, 0,5-1 uM). Udføre dette trin ved begyndelsen af ​​eksperimentet, som TTX vasker forholdsvis let. Desuden udføre denne ved slutningen af ​​forsøget (se trin 4.3.5. Nedenfor).
    3. Forbered stamopløsninger på 1.000 x de endelige arbejder koncentrationer for: alfa, beta-methylen ATP (ABMA, en purinergisk receptoraktivatorog desensitiverende) 10 -2 M atropin (en muskarinreceptorantagonist) 10 -3 M (figur 5C). Observere andre eksempler i figur 6. Den 5HT4-receptor-agonist, cisaprid (3 x 10 -6 M, 10 -6 M, 3 x 10 -5 M, 10 -5 M, 3 x 10 -4 M, 10 -4 M, 3 x 10 -3 M, 10 -3 M), øger væv kontraktilitet og SB-203186 (3 x 10 -3 M), en 5HT4 receptorantagonist, vender cisaprid virkninger.
    4. For at teste effekten af ABMA og atropin om EFS (figur 5C), udføre to kontrol frekvenskarakteristikkurver. Der tilsættes 10 ul 10 -2 M ABMA til badet til en slutkoncentration på 10 uM. Dette vil kontrakten vævet på grund af direkte stimulering af purinerge receptorer i den glatte muskulatur. Efter respons vender tilbage til udgangspunktet, gentag frekvenskarakteristikkurver. Tilsæt 10 ul 10 -3 M atropin for en endelig koncentration af 1 uM. Efter ~ 10 minutter (nødvendig for atropin at blokere muscarinreceptorer) gentagne frekvenskarakteristikkurver. I parallelle baner tilsættes 10 ul af køretøjet, vand, på hvert trin.
      BEMÆRK: For andre eksempler i figur 6, tilsættes 10 ul af hver cisaprid stamopløsning ved fastlagte tidsintervaller (~ hver 15 min, se diskussion), efterfulgt af 10 pi SB-203186 stamopløsning direkte til badet og overvåge deres indvirkning på EFS-inducerede kontraktion. I parallelle strimler tilsættes 10 ul af køretøjet, DMSO. Observere virkningerne af cisaprid, en 5HT4-receptor-agonist, på EFS-fremkaldte sammentrækninger i humane blære og ileum væv i figur 6. Derudover observere effekten af DMSO køretøjet til cisaprid på EFS-fremkaldte sammentrækninger i human blære og ileum væv .
    5. Ved udgangen af EFS protokollen kontrollere selektiviteten af EFS ved at blokere neurale transmission med Na +-kanal blokker, tetrodotoxin (TTX; 0,5-1 &# 181; M). Hvis TTX resistente sammentrækninger er stadig til stede, anbefales det at justere varigheden og intensiteten af ​​stimulus i efterfølgende eksperimenter.
  4. Til bestemmelse af virkningerne af lægemidler på før eller efter synaptiske steder (figur 7A) følge trin 1 til 4.3.2. Etablere reproducerbare reaktioner på carbachol og EFS, derefter tilføje narkotika X.
  5. Ved afslutningen af ​​forsøget, frigøre eller løsne strimlerne duppes dem forsigtigt på et stykke silkepapir for at fjerne ekstra væske og måle hver strimmel vægt ved hjælp af en balance. Også måle væv længde ved hjælp af en skydelære til at bestemme tværsnitsareal. Denne information bruges til normalisering af data (se afsnit 5.4).

5. Dataanalyse

Analysere data ved hjælp af passende software (f.eks, Windaq, LabChart).

  1. For spontan aktivitet, skal du vælge et vindue på mindst 30 sekunder før og på toppen af ​​den lægemiddelinduceret respons og migasure amplitude og frekvens af myogene aktivitet (figur 3).
    1. Brug hurtig Fourier transformation analyse for at bestemme det frekvensspektrum, der bidrager til kontraktile reaktioner, og om der er forskelle mellem de forskellige dele af blæren (f.eks kuppel vs halsen) eller med udvikling, patologi og narkotika 8.
  2. For virkninger på glat muskel tone vælge et vindue på mindst 10-30 sekunder før og på toppen af ​​den lægemiddelinduceret respons og måle amplituden af ​​sammentrækning.
  3. For virkninger på neuralt-fremkaldte sammentrækninger måle amplitude, varighed og areal under kurven for sammentrækninger (mindst 3) før og på toppen af ​​den lægemiddel-inducerede respons.
    BEMÆRK: Det er nødvendigt at måle både amplitude og areal under kurven for EFS-inducerede sammentrækninger fordi purinerge og cholinerge komponenter har forskellige kinetik. Den purinergisk komponent er hurtig og forbigående (ATP aktiverer purinergic ionotrope kanaler såsom P2X1, der tillader hurtig tilstrømning af calcium, så de desensibilisering) og dermed bidrage mere til spidsamplituden reaktion og mindre til området under kurven. Den cholinerge komponent er langsommere og vedvarende (ACh aktiverer metabotropiske muskarine receptorer, som kræver mere tid til at aktivere intracellulære signalveje, der i sidste ende aktiverer ionkanaler der depolarisere den glatte muskulatur til at fremkalde en sammentrækning). Således er muscarin komponent fanget bedre ved at måle arealet under kurven.
  4. Normalisere data for at være i stand til at sammenligne resultater på tværs af strips og farmakologiske behandlinger. Den valgte for normalisering parameter bør ikke blive påvirket af testforbindelserne patologisk tilstand undersøgt eller eksperimentelle design. Blandt disse parametre anvendes strimler vægt tværsnitsareal, KCl responser (figur 4B),% af den maksimale respons (figur 7B) eller% af det maksimale respons til en anden kontraktilt middel(Fx CCh) eller afslappende midler (fx papaverin).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Spontan Myogenic aktivitet

Spontan myogenic aktivitet er en vigtig glatte muskulatur egenskab, der gennemgår ændringer med postnatal udvikling 6-9 og patologi (fx SCI, BOO) 3-5. Fordi denne aktivitet menes at bidrage til symptomerne på overaktiv blære (OAB) 2, er en evaluering af receptorer, intracellulære signalveje og farmakologiske midler, som modulerer det, af stor interesse for at udvikle effektive behandlinger for OAB og andre glatte muskel dysfunktioner. Metoden præsenteres her nemt kan undersøge disse spørgsmål Figur 2 illustrerer forskellige mønstre af myogene spontan aktivitet under udviklingen i neonatale (i), juvenil (ii) voksen (iii) og rygmarv såret rotter. (SCI iv). Strips fra neonatale rotter udviser stor amplitude, lavfrekvente rytmiske sammentrækninger (figur 2AI), mens strips fra voksne rotterfiltre udviser lille amplitude og høj frekvens aktivitet (figur 2Aii III). Efter SCI den neonatale mønster genopstår (Figur 2Aiv). Ud over at bruge strips fra dyremodeller kan forskellige farmakologiske midler anvendes til at inducere spontane sammentrækninger i strimler fra naive dyr, med henblik på at forstå de mekanismer, der ligger til grund for de spontane sammentrækninger. Eksempler på egnede farmakologiske midler indbefatter muskarine receptoragonister (carbachol; CCh). Forbindelser, som øger ACh niveauer (såsom acetylcholinesteraseinhibitorer), lave koncentrationer af KCI (fx 20 mM) eller andre eksperimentelle lægemidler figur 3A-B, illustrerer graduering af spontan aktivitet ved farmakologiske midler, som virker på KCNQ kanaler placeret på den glatte muskulatur. Den KCNQ kanal oplukker, flupirtin, nedsætter amplitude og frekvens af spontan aktivitet i en koncentrationsafhængig måde (figur 3AI-iii), mensKCNQ kanalblokker, XE991, falder amplituden men øger hyppigheden af spontan aktivitet (figur 3BI-iii).

Glat muskel-tonus

Glat muskeltonus og kontraktilitet egenskaber er vigtige faktorer for korrekt funktion af blæren under opbevaring og tømme. Denne metode kan nemt screene effekterne af farmakologiske midler på glat muskel tone. Tal 3Aiv og 3Biv viser, at flupirtin nedsætter basal tone, i overensstemmelse med den glatte muskulatur afslapning, mens XE991 stiger glat muskeltonus. Figur 4 illustrerer koncentrationslejre afhængige stigninger i glat muskeltonus ved at aktivere bombesin receptorer med neuromedin B (NMB, Figur 4A, B) eller muscarinreceptorer med carbachol (CCH; figur 4C, D). Endvidere kan intracellulære signalveje, der medierer disse glatte muskelceller reaktioner undersøges usynge specifikke modulatorer (data ikke vist).

Neuralt-medierede responser og modulation af Neurotransmission

Blære sammentrækning opnås ved frigivelse af ACh / ATP fra det parasympatiske efferente nerver. Bidraget af muskarine og purinergiske systemer til blæren varierer blandt arter og patologiske tilstande, med fremherskende forøgelse purinergisk bidrag i patologier, såsom interstitiel cystitis, delvis obstruktion og overaktiv blære 26. 5C viser anvendelsen af denne fremgangsmåde til at bestemme bidrag muscarine og purinergiske komponenter neurotransmission i blære strimler fra musen. Bidraget fra den cholinerge komponent blev vurderet ved hjælp af muskarinreceptorantagonist, atropin. Bidraget fra purinergiske system blev vurderet ved hjælp af purinergisk receptoraktivator og desensitiverende, alfa, beta-methylene ATP (ABMA). Desuden blev den frekvensafhængige bidrag af hver komponent vurderes ved at variere stimuleringsfrekvensen fra lave til høje frekvenser (2-50 Hz).

Styrken af ​​blæren spiller en væsentlig rolle i brud effektivt. Ved hjælp af denne metode, kan receptorer og veje, der modulerer nervetransmission undersøges som drug mål for at tømme dysfunktioner. De 5HT4-receptorer er udtrykt pre-junctionalt i parasympatiske neuroner og deres aktivering øger ACh niveauer 27. Figur 6 illustrerer excitatorisk virkning af 5HT4-receptoragonist, cisaprid, i humane blære og ileum strimler.

Forskellige eksperimentelle protokoller kan anvendes til at bestemme stedet for virkningen af ​​en testforbindelse. I Figur 7A illustrerer en protokol, der bruges til at vurdere præ vs post-synaptiske sites. Hvis stof X reducerer (eller øges) EFS svar, men har ingen effekt på CCh reaktion, den mest sandsynlige virkningssted er præ-forbindelsesepitop. Hvis stof X ændrer både EFS og CCh svar, så kan det handle på receptorer post-junctionalt eller både før og efter junctionalt.

Funktionen af hver komponent: Glat muskel, slimhinder og Neuronale

Forskellige patologiske tilstande kan påvirke forskellige dele af blæren. For eksempel interstitiel cystitis (IC) primært påvirker urinvejene, mens OAB kan resultere i ændret glat muskel kontraktilitet. Desuden kan forskellige receptorer udtrykkes i hver blære komponent og kunne således målrettet på en bestemt patologi. I modsætning til in vivo-metoder, som måler en Nettoeffekten af alle blære komponenter er dette in vitro-metode tillader undersøgelse af bestemte komponenter ved hjælp af en kombination af kirurgiske og farmakologiske procedurer. For at teste glatmuskelkontraktion / afslapning i fravær af neuronaletransmission, TTX (0,5-1 uM) kan tilsættes til badet. I figur 4 blev NMB og CCh testet i nærvær af TTX. For at teste det bidrag af slimhinden (urothelium og lamina propria) til den glatte muskulatur kontraktilitet, er strimler med og uden slimhindelaget sammenlignet. 7B viser, at reaktioner på CCh reduceres i nærværelse af slimhinden i grisen 28. Lignende resultater blev rapporteret i humane blære strimler 29. For at teste rollen af ​​nervefibre, kan adskillige fremgangsmåder tages. Den ene er at aktivere eller inhibere specifikke fibre ved hjælp af farmakologiske midler. For eksempel capsaicin aktiverer en specifik population af afferente nerver og forårsager artsafhængig glatmuskelsammentrækning eller afslapning 17,18. Guanethidin hæmmer frigivelsen af ​​noradrenalin fra sympatiske fibre, og dermed fjerne bidrag af disse fibre. En anden fremgangsmåde er til desensibilisering / fjerne specifikke fibre in vivoinden forsøget. For eksempel, systemisk behandling af dyret med capsaicin desensibiliserer capsaicin følsomme afferente nerver. Andre blære komponenter, der kan studeres i dette præparat interstitielle celler eller gap junctions ved at aktivere eller blokere dem med konkrete midler.

Artsforskelle

Mens de fleste lægemiddeludvikling er beregnet til behandling af humane sygdomme, er grundforskning udføres primært i animalsk væv. Findes artsforskelle i en række receptorer. For eksempel 5HT4 receptoragonister forbedre neuralt fremkaldte kontraktioner i den menneskelige blære, men ikke hos rotter blæren 19,30, EFS-inducerede kontraktioner næsten udelukkende atropin-følsomme mennesker og gamle verden abe detrusor fra stabile blærer 31, men bliver delvist atropin-resistent i human detrusor fra patienter med ustabil blære betingelser (f.eks neurogen, obstructed blærer) 15,32,33, capsaicin fremkalder en stimulerende respons i rotter og mennesker blære strips, ingen reaktion i svin blære strips og hæmmende reaktion på marsvin blære strimler 17,18. Figur 4 viser, bombesinreceptoren agonister har excitatoriske virkninger på rotte blære og ingen effekt på mus og svin blære strimler 16. Denne information er kritisk for at vælge den passende dyremodel til undersøgelse af en specifik receptor.

Sammenligning af følsomhed over organer

Lægemidler beregnet til behandling af blære lidelser kan også påvirke den glatte muskulatur fra andre organer, såsom mave-tarmkanalen, urinrøret, galdeblære, etc. Denne fremgangsmåde muliggør estimering af organer selektivitet og følsomhed over for et farmakologisk middel ved at sammenligne forskellige væv ved siden af hinanden. Som illustreret i figur 6, at 5HT4-receptoragonist, cisaprid, har forskelligeent effekt og potens i human blære vs ileumvævet.

Figur 1
Figur 1. Eksperimentel opsætning og blære striben forberedelse. A) Skematisk af eksperimentelle opstilling. Blære strimler nedsænket i vævskamre fyldt med beluftet Krebs-opløsning holdt ved 37 ° C via en cirkulerende vand pumpe. Den ene ende af strimlen er fastgjort til en isometrisk krafttransducer til måling af væv kontraktilitet, den anden til en fast stang. Krafttransduceren er forbundet til en forstærker og computer til dataregistrering. Elektrisk feltstimulering elektroder forbundet til en stimulator placeres i kammeret, og anvendes til at fremkalde neuralt medierede blærekontraktioner. B) Fremstilling af vævsstrimler. Blæren er holdt nede i et fad, og de følgende procedurer udføres: # 1 lodret snit though ventrale halvdel af blæren fra urinrøret til kuppel at åbne blæren ind i en flad plade. # 2 horisontale nedskæringer fjerne kuplen og bunden af ​​blæren / proksimale urinrøret. . # 3 lodrette snit dividere midten blære i lige strimler (4 strips fra en rotte blære) C) Skematisk af striben komponenter: glat muskel og slimhinder, begge indeholdende afferent (blå) og efferente (grøn) nerver. Slimhinden består i urinvejene og lamina propria. Lamina propria indeholder blodkar [1], interstitielle celler [2], og muscularis mucosae [3]. Stiplede linje mærket # 2b angiver proceduren til fjernelse af slimhinden lag. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Myogenic spontan aktivitet under udviklingen og efterpatologi. A) Eksempler på spontan aktivitet i neonatal (I), juvenil (ii), spinal intakt voksen (iii) og rygmarvsskadede (SCI) voksen (iv) rotte blære strimler. SCI rotte blev anvendt ved 4 uger efter operationen. B, C) ​​Sammenfatning amplitude (B) og frekvens (C) på spontane sammentrækninger i de fire grupper undersøgt. (Gengivet med tilladelse fra Artim DE, Kullmann FA, Daugherty SL, Bupp E Edwards CL, de Groat WC Neurourol Urodyn 2011 Nov, 30 (8):.. 1666-74.) Klik her for at se en større version af dette figur.

Figur 3
Figur 3. Modulering af myogene spontan aktivitet og glat muskel-tonus. A) Virkningen af KCNQ kanalåbner, flupirtine, om spontan aktivitet og baseline tone hos voksne rotter blære strimler. (I) Flupirtin blev tilsat i stigende koncentrationer (kumulative) på de tidspunkter, der er angivet med pile. De udvidelser under spor show 4 min strip aktivitet under kontrol og efter anvendelse af 10 uM og 50 uM flupirtin. (Ii-iv) Sammenfatning af virkningerne af flupirtin (7 dele fra 4 rotter) på amplituden (ii) og frekvens (iii) i spontan aktivitet og baseline tone (iv), udtrykt som% ændring fra kontrol (præ-drug) værdier , som blev sat til 100%. B) Virkningen af KCNQ kanal blokker, XE991, om spontan aktivitet og baseline tone hos voksne rotter blære strimler. (I) XE991 blev tilsat i stigende koncentrationer (kumulative) på de tidspunkter, der er angivet med pile. De udvidelser under spor viser 2 min strip aktivitet under kontrol og efter anvendelse af 10 uM og 50 uM XE991. (Ii-iv) Sammenfatning af virkningerne af XE991 (9 strips fra 4 rotter) påamplitude (ii) og frekvens (iii) i spontan aktivitet og baseline tone (iv), udtrykt som% ændring fra kontrol (præ-drug) værdier, der blev fastsat til 100%. Klik her for at se en større version af dette tal .

Figur 4
Figur 4. artsforskelle. A) koncentrationsafhængig glatte muskelsammentrækninger som reaktion på bombesinreceptoren agonist, Neuromedin B (NMB), i rotte blære strimler. B) Oversigt over effekter af NMB på glat muskelsammentrækning i rotte blære strimler. Data er normaliseret til KCI (80 mM) respons. C, D) Manglende svar til NMB i mus (C) og svin (D) blære strimler. Carbachol (CCh) fremkalder stærk koncentration afhængig contraktioner i begge mus og svin strimler, hvilket indikerer, at strimlerne kan reagere på stimuli. TTX (0,5 uM) var til stede i badet i alle strimler. (Gengivet med tilladelse fra Kullmann FA, McKenna D, Wells GI Thor KB Neuropeptides 2013 Oct; 47 (5):.. 305-13) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Elektrisk felt stimulation. A) Skematisk af enkelt puls stimulation parametre. Forkortelser: D = varighed af puls, i = intensitet puls, IPI = inter impulsinterval B) Skematisk af toget stimulation parametre.. Forkortelser: TD = tog varighed, i = intensitet puls, ITI = inter tog interval. Indsat viser antallet af pulser i et tog og intervallet between dem, som sammen med toget varighed bestemme hyppigheden af toget stimulation. C)   Bidrag purinegic og cholinerge komponenter neuralt fremkaldte blærekontraktioner. EFS-FR repræsenterer stimulation frekvenser, 2, 5, 10, 20, 50 Hz. Tre stimuli leveret hver 90 sekunder blev testet for hver frekvens og hver frekvens serien blev gentaget to gange i kontrol, og to gange efter tilsætning hver forbindelse. Alfa, beta-methylen ATP, forkortet ABMA (bånd 1), blev anvendt til desensibilisering purinerge receptorer og atropin (bånd 2) blev anvendt til at blokere muscarinreceptorer. Strip 3 tjente som kontrol og blev behandlet med vehikel, vand. Pile angiver det tidspunkt, hvor hver forbindelse blev tilsat til hver bane. Bemærk, at EFS-fremkaldte sammentrækninger er stærkt reduceret med ABMA og atropin, mens der ikke er berørt af køretøjet. TTX blev tilsat ved slutningen af ​​forsøget, mens EFS blev afgivet ved 20 Hz. Bemærk, at de resterende sammentrækninger observeret i kontrolstrimmel 3 blev ophævet ved TTX, viser deres neurale karakter (dvs. initieret af senderen frigivelse fra murene nerver). # Indikerer glatte muskelceller reaktioner på ABMA i fravær af EFS. Skalapanelerne er 5 min for x-aksen og 2 g for y-aksen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Modulering af neuralt fremkaldte blærekontraktioner. A, B) Eksempler på forbedring af neuralt fremkaldte sammentrækninger af 5HT4-receptoragonist cisaprid i human blære (A) og ileum bånd (B). Cisaprid (sorte plader) eller DMSO (grå optegnelser) blev tilsat i en koncentrationsafhængig måde på de tidspunkter, der er angivet med pile. Sorte bjælker under posterne i hvert panelrepræsenterer EFS, som bestod af 10 sec tog leveret ved 20 Hz hver 120 sek. Vertikale skala barer er 1 g for alle eksempler. TTX-koncentration var 0,5 uM. CF) Resumé af arealet under kurven (AUC) for EFS-fremkaldte sammentrækninger som reaktion på cisaprid (sorte søjler) eller DMSO (grå søjler) i blære strimler (C, D) og ileum strimler (E , F). I CF, SB står for SB-203186, der repræsenterer en sammenfatning af data opnået efter tilsætning af 5HT4 receptorantagonist. Punkterede linier er sat til 100% og udgør kontrol. (Gengivet med tilladelse fra Kullmann FA, Kurihara R, Ye L, Wells GI, McKenna GD, Burgard EF Thor KB Auton Neurosci 2013 Juni, 176 (1-2):... 70-7) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7
Figur 7. virkesteder af narkotika og rolle forskellige komponenter i blæren. A) Skematisk af protokol til at identificere det sted, hvor virkningen af et lægemiddel. Strimler stimuleres med ESF og carbachol (CCh). I jeg lægemiddel X reducerer EFS respons, men ikke CCH respons, hvilket indikerer en pre-forbindelsesepitop virkested. I II, narkotika X ændrer begge reaktioner, hvilket indikerer en handling på post-synaptiske eller både før og efter den synaptiske receptorer. B) Indflydelse af slimhinden på glat muskelkontraktion. Effekter af karbachol er formindsket i strimler med slimhinden til stede (intakt) sammenlignet med strimler med den fjernede slimhinde (blottet). (B er gengivet med tilladelse fra Hawthorn MH, Chapple CR, Pik M, skak-Williams R. Br J Pharmacol 2000 Feb; 129 (3):. 416-9). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette papir, vi beskrev en simpel in vitro glat muskel kontraktilitet metode, der kan bruges til at løse en række vigtige videnskabelige spørgsmål i forbindelse med blære fysiologi og patologi, samt medvirken til opdagelsen af nye lægemidler til behandling af blære dysfunktioner. Vi har illustreret brugen af denne metode til vurdering af udviklingsmæssige, patologiske og farmakologiske egenskaber af glat muskulatur i blæren kontraktilitet (figur 2-4), neurotransmission modulation (figur 5-7A), artsforskelle (Figur 4), orgel forskelle (se figur 6) og relevansen af bestemte blære komponenter (f.eks slimhinder, figur 7B). Yderligere programmer ikke er illustreret her omfatter en evaluering af intracellulære signalveje anvender farmakologiske midler 3,10,11, struktur-aktivitet relationer forskellige lægemidler 22-24, eller evaluering / kvantificering af transmitter release efter neural stimulation 25.

Mens blærefunktionen i sidste ende kan vurderes in vivo dette in vitro-metode overvinder mange situationer, der er problematiske in vivo. Disse omfatter situationer, hvor kirurgiske og farmakologiske manipulationer ville reducere levedygtighed og / eller overlevelse af organet eller dyret, brug af menneskeligt væv, at det er nødvendigt at identificere og karakterisere svar fra specifikke komponenter (f.eks glat muskel vs epitel vs nerver ), eller anvendelsen af ​​dyre kemikalier. Metoden giver mulighed for en systematisk undersøgelse af effekten af ​​forskellige farmakologiske midler samt patologi på kontraktile aktivitet af den glatte muskulatur og i en velkontrolleret mode og miljø.

Metoden indeholder et væld af information; Dog bør der udvises forsigtighed ved fortolkningen og ekstrapolere disse oplysninger. Dette er en in vitro-metode til en reduceret præparat, disforbundet fra dets normale miljø og neurale kontrol. De eksperimentelle betingelser ikke er fysiologisk, således data er måske ikke helt afspejler in vivo fysiologiske situationer. For eksempel kan fremgangsmåden ikke højde for ændringer i blodgennemstrømning, hormoner, humorale stoffer eksterne mekaniske kræfter eller extrinsiske neurale kontrol. Væv akut decentraliseret, således skade og iskæmi relaterede reaktioner skal evalueres og tages i betragtning. Patologiske forandringer i hjernen eller rygmarven ikke kan testes ved hjælp af denne metode, medmindre de allerede har ændret afferent, glat muskulatur, slimhinder eller intramuralt nerve funktion (dvs. cellulær plasticitet). Elektrisk felt-stimulering (EFS) muliggør vurdering af neuralt medierede responser. Men det exciterer uden forskel alle nerver i striben (f.eks sympatiske, parasympatiske, afferenter), i modsætning til situationen in vivo, hvor vandladningscyklussen refleks aktiverer kun særlig pathways. En måde at overvinde denne situation er at kombinere EFS med specifikke antagonister, som selektivt blokerer forskellige veje. For eksempel kunne guanethidin anvendes til at blokere noradrenalinfrigivelse når man studerer sammentrækning egenskaber eller atropin kan anvendes til at blokere muscarinreceptorer at forhindre blæresammentrækninger, når man studerer afslapning egenskaber. Endelig er levedygtighed af vævet begrænset til et bestemt antal timer. I almindelighed er de fleste dele af blærevæv er levedygtige og stabile (dvs. reagerer på EFS uden forværrede respons) over en periode på 6-8 timer eller længere. Dog kan andre væv være mere følsomme (f.eks ileum varer ~ 6 timer eller derunder forfatterens personlige erfaring).

Selv om metoden er teknisk muligt og med god reproducerbarhed, er der flere kritiske trin, der er nødvendige for at sikre dens succes. For det første bør forberedelse væv udføres omhyggeligt for at sikre rentabiliteten ved at foretage de nødvendige ændringertil dissektion procedure (undgå at strække vævet samtidig forbereder strimlerne) og / eller medier, hvis behov for forskellige vævstyper eller arter. Et andet afgørende skridt er etablering neuronale stimulation parametre, såsom at loftet virkninger undgås. Som beskrevet i metodeafsnittet, dette afhænger af den type af eksperiment og forventede virkningsmekanisme af testforbindelsen. For eksempel for at teste virkningerne af cisaprid, en 5HT4-receptor-agonist, på blære strimler (figur 6), vi indstille amplituden af EFS-fremkaldte kontraktion til ~ 50% af den maksimale. Dette var baseret på den kendte virkningsmekanisme af 5HT4-receptor-agonister, nemlig at øge ACh frigivelse fra de præ-forbindelsesepitop parasympatiske nerver 27, som til gengæld forventes at øge EFS-fremkaldte kontraktioner. Stimulering af muskel vs nerver skal testes ved hjælp af TTX, som hæmmer neurale transmission og derfor bør hæmme EFS-fremkaldte sammentrækninger. Passende kontrol for køretøjer og Time skal udføres i løbet af narkotika testning for at tage hensyn til forringelse af vævet med tiden, og for eventuelle effekter af køretøjet. For eksempel er mange lægemidler opløst i DMSO eller ethanol. Vore data (figur 6) viser, at DMSO (0,1% og højere) kan øge neuralt fremkaldte kontraktioner, en effekt, der skal trækkes fra virkningen af testlægemidlet. Ligeledes ethanol (op til 1%) reducerer de spontane glatte muskelsammentrækninger, men har ingen effekt på neuralt fremkaldte sammentrækninger 34,35. Hvis du bruger gensplejsede dyr eller kirurgiske modeller (f.eks rygmarvsskader eller ovariektomi), bør kontrollen omfatte væv fra den nødvendige baggrund musestammen eller skinopererede dyr. Desuden er nogle væv, såsom mennesker, mus og marsvin blærer indeholder intramuralt ganglier. Når man arbejder med disse væv, skal protokol udvælgelse og datafortolkning tage hensyn virkninger af lægemidler eller EFS på intramuralt neurons at yderligere stimulere den glatte muskulatur.

Design af forsøgsprotokollen, vælge de rigtige parametre (for EFS, til lægemiddel-stimulation), og koncentrationer, der skal testes, er afgørende for at sikre meningsfulde data. Mens parametre bør korrigeres for individuelle væv og narkotika, generelle principper / retningslinjer, der er skitseret nedenfor, er gældende. Kumulative koncentration-respons-kurver er ønskelig, men dette er ikke muligt for alle forbindelser. Lægemidler rettet mod receptorer, desensitize, såsom purineric ionotrope receptorer (P2X), eller lægemidler, der metaboliseres hurtigt i vævet (f.eks ACh), ikke pålideligt kan testes ved hjælp af kumulative koncentration-respons-kurver i det samme væv. I disse tilfælde er enlige testede koncentrationer i forskellige grupper af væv. At evaluere desensibilisering, anbefales det at sammenligne størrelsen af ​​respons fremkaldt af en enkelt højeste koncentration, der opnås ved afslutningen af ​​en kumulativ koncentrationresponskurve.

For nøjagtig montering af oplysningerne fra koncentration-respons-kurver, er det ønskeligt at teste halv log koncentrationer (eksempel CCH i figur 6). Men log koncentrationer (eksempel NMB i figur 4A) er acceptable, når vævslevedygtighed kan begrænses eller andre problemer kan være på plads.

Sådan vælger du et koncentrationsområde for en hidtil ukendt forbindelse, i indledende eksperimenter, er det nyttigt at overveje bindende affinitet af forbindelsen og test to potens af 10 over og under denne koncentration. I efterfølgende eksperimenter, er protokollen raffineres for at bestemme et udgangspunkt, hvor ingen effekt af lægemidlet observeret, og et slutpunkt, hvor enten reaktion er maksimal eller den testede koncentration ikke længere er specifik for det tilsigtede mål.

Tidsintervallet for at anvende et lægemiddel skal vælges under hensyntagen til flere faktorer: a) Tid til enstof til at have en effekt. Generelt lægemidler rettet mod membranreceptorer har en forholdsvis hurtig respons (sekunder til minutter), mens medicin til intracellulære mål (fx forskolin og andre enzymhæmmere 36, botulinumtoksin 37) kræve yderligere inkubationstid (30 min - 3 timer). Derudover kan vævstykkelsen spille en rolle. b) Varighed og virkningsmekanisme af lægemidlet. I tilfælde hvor lægemidlet virkning når et plateau, der indtræder, såsom NMB i figur 4A og cisaprid i figur 6, tidsintervaller på 5-15 minutter mellem lægemiddelregistreringsansøgninger er tilstrækkelige til at indsamle tilstrækkelige data. Dette er ikke muligt med lægemidler, der har en meget kortere virkningsvarighed eller anden virkningsmekanisme (ATP, CCh). For eksempel effekten af CCh i figur 4C eller 4D, når et plateau hurtigt, men vævet spænding tendens til at vende tilbage til baseline. I dette tilfælde de tidsintervaller, der skal justeres i henholdly, normalt tilføje den næste koncentration, når den første reaktion når et maksimum.

Dataanalyse, især normalisering af data, således at sammenligninger mellem strips er et meget vigtigt skridt. Forskellige undersøgelser anvender forskellige parametre for normalisering, herunder bånd vægt 38, strimler tværsnitsareal 39 KCl reaktion 12% af maksimal reaktion 28 eller% af det maksimale respons til en anden kontraktilt middel (f.eks CCh 38). Normaliseringen parameter vælges afhængigt af formålet med eksperimentet, således at parameteren ikke er påvirket af testforbindelserne patologi eller eksperimentelle design. For eksempel normalisering til KCI respons eliminerer vægt og andre dimensioner af strimlerne, og derfor kan bruges til at sammenligne reaktioner i væv, hvor patologisk tilstand kan øge vægten af strimlerne (fx diabetes øger blære masse). Desuden rereaktion på KCl påvirkes ikke ved fjernelse af slimhinden / urothelium 29, kan således anvendes til forsøg evaluerer forskellige komponenter i blæren (f.eks slimhinde vs glatte muskler).

Sammenfattende er dette kontraktiliteten metode giver en hurtig, nem og meget kraftfuld metode til vurdering blære (og andre orgel) fysiologi og farmakologi. Når de anvendes korrekt, giver evnen til at manipulere væv i en reduceret og godt kontrolleret miljø. I undersøgelsen af urinblæren funktion, denne metode var medvirkende til opdagelsen og afprøvning af stoffer, der i øjeblikket anvendes til OAB management, såsom antimuskariner og nyudviklet β 3 AR agonister.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af NIH R37 DK54824 og R01 DK57284 tilskud til LB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Tissue Bath System with Reservoir Radnoti, LLC 159920 isolated tissue baths
Warm water recirculator pump Kent Scientific Corporation  TPZ-749 to keep tissue baths to 37 °C
Computer
Data Acquisiton System DataQ Instruments DI-710-UH To view, record and analyze data
Transbridge Transducer Amplifier World Precision Instruments SYS-TBM4M Transducer amplifier
Grass stimulator Grass Technologies Model S88 Stimulator
Anesthesia System Kent Scientific Corporation  ACV-1205S To anesthetesize the animal
Anesthetizing Box Harvard Apparatus 500116 To anesthetesize the animal
Anesthesia Masks Kent Scientific Corporation  AC-09508 To anesthetesize the animal
Materials and Surgical Instruments
Sylgard Dow Corning Corp 184 SIL ELAST KIT To pin, dissect, & cut tissue
Petri Dish Corning 3160-152 To dissect/cut tissue
Insect Pins ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins Size 5 To pin tissue
Bench Pad VWR International 56617-014 Absorbent bench underpads
Rat surgical Kit Kent Scientific Corporation  INSRATKIT To remove and dissect tissue
2 Dumont #3 Forceps Kent Scientific Corporation  INS500064 To remove and dissect tissue
Tissue Forceps Kent Scientific Corporation  INS500092 To remove and dissect tissue
Scalpel Kent Scientific Corporation  INS500236 To remove and dissect tissue
Scalpel blade Kent Scientific Corporation  INS500239 To remove and dissect tissue
Professional Clipper  Braintree Scientific, Inc. CLP-223 45 To remove fur
Suture Thread Fine Science Tools 18020-50 Tie tissue
Tissue Clips Radnoti, LLC 158802 Attach tissue to rod/transducer
1 g weight  Mettler Toledo 11119525 For transducer calibration
Chemicals
Krebs Solution:
Sodium chloride
Potassium chloride
Monobasic potassium phosphate
Magnesium sulfate
Dextrose
Sodium bicarbonate
Calcium chloride
Magnesium chloride		  
Sigma
Fisher
Fisher
Fisher
Fisher
Sigma
EMD
Baker		  
S7653
P217-500
P285-3
M65-500
D16-500
S5761
CX0130-2
2444		 To prepare Krebs solution
Isoflurane Henry Schein 029405 To anesthetesize the animal
 Oxygen tank Matheson Tri Gas ox251 To use with anesthesia system
Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide)  Matheson Tri Gas Moxn00hn36D To aerate Krebs solutions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nat Rev Neurosci. 9, 453-466 (2008).
  2. Andersson, K. E. Detrusor myocyte activity and afferent signaling. Neurourol Urodyn. 29, 97-106 (2010).
  3. Artim, D. E., et al. Developmental and spinal cord injury-induced changes in nitric oxide-mediated inhibition in rat urinary bladder. Neurourology and urodynamics. 30, 1666-1674 (2011).
  4. Kita, M., et al. Effects of bladder outlet obstruction on properties of Ca2+-activated K+ channels in rat bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 298, 1310-1319 (2010).
  5. Barendrecht, M. M., et al. The effect of bladder outlet obstruction on alpha1- and beta-adrenoceptor expression and function. Neurourol Urodyn. 28, 349-355 (2009).
  6. Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. Postnatal development of myogenic contractile activity and excitatory innervation of rat urinary bladder. The American journal of physiology. 247, 972-978 (1984).
  7. Ng, Y. K., de Groat, W. C., Wu, H. Y. Smooth muscle and neural mechanisms contributing to the downregulation of neonatal rat spontaneous bladder contractions during postnatal development. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 292, 2100-2112 (2007).
  8. Szell, E. A., Somogyi, G. T., de Groat, W. C., Szigeti, G. P. Developmental changes in spontaneous smooth muscle activity in the neonatal rat urinary bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, 809-816 (2003).
  9. Szigeti, G. P., Somogyi, G. T., Csernoch, L., Szell, E. A. Age-dependence of the spontaneous activity of the rat urinary bladder. J Muscle Res Cell Motil. 26, 23-29 (2005).
  10. Frazier, E. P., Braverman, A. S., Peters, S. L., Michel, M. C., Ruggieri, M. R. Does phospholipase C mediate muscarinic receptor-induced rat urinary bladder contraction. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 322, 998-1002 (2007).
  11. Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Selective inhibition of phosphodiesterase 1 relaxes urinary bladder smooth muscle: role for ryanodine receptor-mediated BK channel activation. American journal of physiology. Cell physiology. 303, 1079-1089 (2012).
  12. Frazier, E. P., Peters, S. L., Braverman, A. S., Ruggieri, M. R., Michel, M. C. Signal transduction underlying the control of urinary bladder smooth muscle tone by muscarinic receptors and beta-adrenoceptors. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 377, 449-462 (2008).
  13. Svalo, J., et al. The novel beta3-adrenoceptor agonist mirabegron reduces carbachol-induced contractile activity in detrusor tissue from patients with bladder outflow obstruction with or without detrusor overactivity. European journal of pharmacology. 699, 101-105 (2013).
  14. Yokota, T., Yamaguchi, O. Changes in cholinergic and purinergic neurotransmission in pathologic bladder of chronic spinal rabbit. J Urol. 156, 1862-1866 (1996).
  15. Bayliss, M., Wu, C., Newgreen, D., Mundy, A. R., Fry, C. H. A quantitative study of atropine-resistant contractile responses in human detrusor smooth muscle, from stable, unstable and obstructed bladders. J Urol. 162, 1833-1839 (1999).
  16. Kullmann, F. A., McKenna, D., Wells, G. I., Thor, K. B. Functional bombesin receptors in urinary tract of rats and human but not of pigs and mice, an in vitro study. Neuropeptides. 47, 305-313 (2013).
  17. Sadananda, P., Kao, F. C., Liu, L., Mansfield, K. J., Burcher, E. Acid and stretch, but not capsaicin, are effective stimuli for ATP release in the porcine bladder mucosa: Are ASIC and TRPV1 receptors involved. European journal of pharmacology. 683, 252-259 (2012).
  18. Maggi, C. A., et al. Species-related variations in the effects of capsaicin on urinary bladder functions: relation to bladder content of substance P-like immunoreactivity. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 336, 546-555 (1987).
  19. Kullmann, F. A., et al. Effects of the 5-HT4 receptor agonist, cisapride, on neuronally evoked responses in human bladder, urethra, and ileum. Autonomic neuroscience : basic & clinical. 176, 70-77 (2013).
  20. Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Human tachykinin NK2 receptor: a comparative study of the colon and urinary bladder. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30, 632-639 (2003).
  21. Zoubek, J., Somogyi, G. T., De Groat, W. C. A comparison of inhibitory effects of neuropeptide Y on rat urinary bladder, urethra, and vas deferens. The American journal of physiology. 265, 537-543 (1993).
  22. Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationship of neurokinin A(4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the effect of amino acid substitutions on receptor affinity and function. Biochem Pharmacol. 63, 2181-2186 (2002).
  23. Warner, F. J., Mack, P., Comis, A., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationships of neurokinin A (4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the role of natural residues and their chirality. Biochem Pharmacol. 61, 55-60 (2001).
  24. Dion, S., et al. Structure-activity study of neurokinins: antagonists for the neurokinin-2 receptor. Pharmacology. 41, 184-194 (1990).
  25. Somogyi, G. T., Zernova, G. V., Yoshiyama, M., Yamamoto, T., de Groat, W. C. Frequency dependence of muscarinic facilitation of transmitter release in urinary bladder strips from neurally intact or chronic spinal cord transected rats. British journal of pharmacology. 125, 241-246 (1998).
  26. Andersson, K. E., Wein, A. J. Pharmacology of the lower urinary tract: basis for current and future treatments of urinary incontinence. Pharmacological reviews. 56, 581-631 (2004).
  27. D’Agostino, G., Condino, A. M., Gallinari, P., Franceschetti, G. P., Tonini, M. Characterization of prejunctional serotonin receptors modulating [3H]acetylcholine release in the human detrusor. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 316, 129-135 (2006).
  28. Hawthorn, M. H., Chapple, C. R., Cock, M., Chess-Williams, R. Urothelium-derived inhibitory factor(s) influences on detrusor muscle contractility in vitro. British journal of pharmacology. 129, 416-419 (2000).
  29. Chaiyaprasithi, B., Mang, C. F., Kilbinger, H., Hohenfellner, M. Inhibition of human detrusor contraction by a urothelium derived factor. J Urol. 170, 1897-1900 (2003).
  30. Testa, R., et al. Effect of different 5-hydroxytryptamine receptor subtype antagonists on the micturition reflex in rats. BJU international. 87, 256-264 (2001).
  31. Craggs, M. D., Rushton, D. N., Stephenson, J. D. A putative non-cholinergic mechanism in urinary bladders of New but not Old World primates. J Urol. 136, 1348-1350 (1986).
  32. Fry, C. H., Bayliss, M., Young, J. S., Hussain, M. Influence of age and bladder dysfunction on the contractile properties of isolated human detrusor smooth muscle. BJU international. 108, 91-96 (2011).
  33. Kennedy, C., Tasker, P. N., Gallacher, G., Westfall, T. D. Identification of atropine- and P2X1 receptor antagonist-resistant, neurogenic contractions of the urinary bladder. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 845-851 (2007).
  34. Levin, R. M., Danek, M., Whitbeck, C., Haugaard, N. Effect of ethanol on the response of the rat urinary bladder to in vitro ischemia: protective effect of alpha-lipoic acid. Molecular and cellular biochemistry. 271, 133-138 (2005).
  35. Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: Involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American journal of physiology. Cell physiology. 306, 45-58 (2013).
  36. Longhurst, P. A., Briscoe, J. A., Rosenberg, D. J., Leggett, R. E. The role of cyclic nucleotides in guinea-pig bladder contractility. British journal of pharmacology. 121, 1665-1672 (1997).
  37. Takahashi, R., Yunoki, T., Naito, S., Yoshimura, N. Differential effects of botulinum neurotoxin A on bladder contractile responses to activation of efferent nerves, smooth muscles and afferent nerves in rats. J Urol. 188, 1993-1999 (2012).
  38. Sadananda, P., Chess-Williams, R., Burcher, E. Contractile properties of the pig bladder mucosa in response to neurokinin A: a role for myofibroblasts. British journal of pharmacology. 153, 1465-1473 (2008).
  39. Liu, G., Daneshgari, F. Alterations in neurogenically mediated contractile responses of urinary bladder in rats with diabetes. American journal of physiology. Renal physiology. 288, 1220-1226 (2005).

Tags

Medicin Krebs artsforskelle, Glat muskel kontraktilitet neurale stimulering
Glat muskulatur i blæren Strip Kontraktilitet som en metode til at evaluere nedre urinveje Farmakologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kullmann, F. A., Daugherty, S. L.,… More

Kullmann, F. A., Daugherty, S. L., de Groat, W. C., Birder, L. A. Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology. J. Vis. Exp. (90), e51807, doi:10.3791/51807 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter