Summary
Dette manuskriptet presenterer en enkel, men kraftig, in vitro metode for å evaluere glatt muskulatur kontraktilitet i respons til farmakologiske midler eller nervestimulering. Viktigste programmene er narkotika screening og forståelse vev fysiologi, farmakologi og patologi.
Abstract
Vi beskriver en in vitro-metode for å måle blære glattmuskel-kontraktilitet, og dens anvendelse for å undersøke fysiologiske og farmakologiske egenskaper av glatt muskulatur, så vel som endringer indusert av patologi. Denne metoden gir viktig informasjon for å forstå blærefunksjonen mens overvinne store metode vanskelighetene i in vivo forsøk, for eksempel kirurgiske og farmakologiske manipulasjoner som påvirker stabiliteten og overlevelse av preparater, anvendelse av humant vev, og / eller bruk av kostbare kjemikalier. Det gir også en metode for å undersøke egenskapene til hver blære komponent (dvs. glatt muskulatur, slimhinner, nerver) hos friske og patologiske tilstander.
Den urinblæren fjernes fra en anestesert dyr, plassert i Krebs-oppløsning og skåret i strimler. Strimler er plassert i et kammer fylt med varmt Krebs-løsning. Den ene enden er festet til en isometrisk tension transduktor for å måle kraft i, er den andre enden er festet til en fast stang. Tissue stimuleres av direkte tilsette forbindelsene til badet eller ved elektrisk feltstimulering elektroder som aktiverer nerver, tilsvarende utløser blærekontraksjoner in vivo. Vi demonstrerer bruken av denne metoden for å vurdere spontan glatt muskel kontraktilitet under utvikling og etter en eksperimentell ryggmargsskade, arten av neurotransmisjon (sendere og reseptorer som er involvert), faktorer som er involvert i modulering av glattmuskel-aktivitet, rollen til individuelle blære komponenter og arter og organ forskjeller i respons til farmakologiske midler. I tillegg kan det bli brukt for å undersøke intracellulære måter med sammentrekning og / eller relaksasjon av glatt muskulatur, legemiddel struktur-aktivitetsrelasjoner og evaluering av transmitterfrigjørelse.
Den in vitro glatt muskulatur kontraktilitet metoden har vært brukt i stor utstrekning for over 50 år, og har gitt data som i betydelig grad bidratt til vår forståelse av blærefunksjon samt farmasøytisk utvikling av forbindelser som brukes i dag klinisk for blære ledelse.
Introduction
Blæren glatt muskulatur slapper å tillate urin oppbevaring, og kontrakter for å lokke fram urin eliminasjon. Avslapping er mediert av iboende glatte muskelceller eiendommene og tonic frigjøring av noradrenalin (NE) fra sympatiske nerver, som aktiverer beta adrenerge reseptorer (β 3 AR i menneskelig) i detrusor. Ugyldig oppnås ved inhibering av sympatisk inngang og aktivering av de parasympatiske nerver som frigjør ACh / ATP for å trekke sammen glatt muskulatur i urinblæren 1. Mange patologiske tilstander, inkludert hjernen og / eller ryggmargsskade, nevrodegenerative sykdommer, diabetes, blære obstruksjon eller interstitiell cystitt, kan dypt endre blærefunksjon, med alvorlig innvirkning på pasientens livskvalitet to. Disse forholdene endrer kontraktilitet av glatt muskulatur ved å påvirke en eller flere komponenter i blæren: glatt muskulatur, de afferente og efferente nerver og / ellermucosa.
Flere in vivo-og in vitro metoder for å studere blærefunksjonen er blitt utviklet. In vivo har cystometry den primære måling av blærefunksjonen. Selv om dette er et intakt preparat som tillater samling av informasjon i henhold til nær fysiologiske betingelser, er det en rekke forhold der bruk av glatte muskelstrimler er foretrukket. Disse inkluderer situasjoner når kirurgisk og / eller farmakologiske manipulasjoner vil påvirke overlevelse og stabiliteten in vivo preparatet, eller når de studier som krever bruk av menneskelig vev eller dyre kjemikalier. Denne fremgangsmåte muliggjør også en undersøkelse av virkningen av narkotika, alder og patologi på hver komponent av blæren, dvs. glatt muskulatur, slimhinner, afferente og efferente nerver.
Blære strimler har vært ansatt gjennom årene av mange grupper for å svare på en rekke vitenskapelige spørsmål. De ble brukt til å evaluate endringer i myogenic spontan aktivitet indusert av patologi. Denne aktiviteten antas å bidra til at det haster og frekvens symptomer på overaktiv blære (OAB), og er derfor et mål for legemidler under utvikling for OAB 3-9. Blære strimler ble også brukt til å undersøke myogeniske og nevrale faktorer som modulerer glatt muskel tone med sikte på å avdekke ionekanaler og / eller reseptorer og / eller intracellulære trasé som kan være målrettet for å indusere enten avslapning eller sammentrekning av glatt muskulatur 3,10- 13. Andre studier har fokusert på natur nevrotransmisjon, inkludert sendere og reseptorer involvert og endringer indusert av patologi 14,15. I tillegg har fremgangsmåten vært brukt til sammenligninger mellom vev fra forskjellige arter 16- 18, mellom organene 19 til 21, og evaluering av medikament struktur-aktivitetsrelasjoner 22-24. En utvidelse av denne metoden har blitt brukt til og å målee det effekten av narkotika på senderen utgivelse fra efferente nerver 25. Videre er en rekke forskjellige vev (blære, urinrør, mage-tarmkanalen, GI) høstes fra dyr eller mennesker (fra operasjoner eller organ donorvev godkjent for forskning) og fra en rekke forskjellige dyremodeller, inkludert ryggmargsskade (SCI), blæreutløpsobstruksjon (BOO), eller interstitiell cystitt (IC) kan undersøkes ved hjelp av denne teknikk.
I dette dokumentet vil vi illustrere bruken av denne metoden sammen med nødvendige eksperimentelle protokoller, for å ta opp flere vitenskapelige spørsmål som er nevnt ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrene som er beskrevet her er godkjent av IACUC komiteen ved University of Pittsburgh.
1. Solutions
- Forbered Krebs-løsning i henhold til oppskriften. Sammensetning i mm: NaCl 118, KCl 4,7, CaCl 2 1.9, MgSO 4 1.2, NaHCO3 24.9, KH 2 PO 4 1.2, druesukker 11.7.
- Luft Krebs med 95% O 2, 5% CO 2 og legg den i en 37 º C vannbad som skal brukes gjennom hele forsøket. Sett bort ~ 200 ml oksygenert Krebs-oppløsning ved romtemperatur for å bli brukt for vev disseksjon.
- Måle pH (~ 7,4) og osmolaritet (~ 300 mOsm) Skum Krebs.
2. Eksperimentell Set-up (Skjematisk figur 1A)
- Fyll luftet (95% O 2, 5% CO 2) kamre med 10 ml Krebs.
- Start sirkulasjonsvannpumpen for å varme opp kamrene til 37 ° C; slå på nødvendig utstyr: forsterker (e), stimulator (s) og opptak programvare.
- Kalibrere transdusere med en 1 g vekt.
3. Tissue (figur 1B)
Fjern blæren fra en voksen naive kvinnelige Sprague Dawley rat (200-250 g; ~ 10-12 uker gammel) på følgende måte:
- Forbered disseksjon området og nødvendige instrumenter: barbermaskiner, tenger med tenner, skalpell blad, dissekere saks, microscissors, to dissekere tang (forfattere foretrekker Dumont tang # 3), vev klipp (eller silke sutur), en Sylgard belagt disseksjon parabolen med Krebs og vev disseksjon pins.
- Bedøve dyret med isofluran inhalasjon (4% i O 2) i induksjonskammeret. Bruk veterinær salve på øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi. Kontinuerlig overvåke nivået av anestesi ved å observere respirasjonsfrekvens, respons på ytre stimuli, og tap av bakre lem trekke refleks.
- Når dyret er bedøvet barbering nedre mage enrea. Expose bekken organer via en midtlinje abdominal snitt. Identifiser blæren og urinrøret. Fjern blæren ved å skjære på blærehalsen nær proksimale uretra. Plasser vevet umiddelbart i Sylgard belagt skål fylt med oksygenert Krebs-løsning.
- Hvis det er nødvendig, fjerner ytterligere vev på dette tidspunkt: urinrøret, stykker av gastrointestinal (GI)-tarmkanalen og / eller prostata, etc.
- Ofre dyret ved hjelp IACUC godkjente metoder (for eksempel anestesioverdose eller CO 2 kvelning etterfulgt av en sekundær metode).
- Sett vev dissekere pins gjennom blæren kuppel, nakke og urinledere, for å stabilisere vev for videre disseksjon. Ikke strekk vev. Fjerne fett, bindevev, proksimale urinrør, og urinledere dersom de finnes.
- Åpne blæren fra basen til dome å skape et flatt ark, serosa siden ned / luminal side opp (Figur 1B). Plasser dissekere pinner på hvert hjørne av vev. Fjern blæren dome og hals vev.
- Dersom hensikten med forsøket er å bestemme bidrag av slimhinnen (urothelium og lamina propria - se diagram figur 1C) til den glatte muskelsammentrekning, sammenligne egenskapene detrusor strimler med og uten slimhinnene knyttet. For dette, før kutte vev i strimler, forsiktig fjerne slimhinnen ved hjelp av irisfjær saks og fin pinsett under a disseksjonsmikroskop. Ved slutten av eksperimentet, fikse strimlene for H & E farging for å bekrefte fullstendig fjerning av slimhinnen. Legg merke til at denne fremgangsmåten er enklere i mus blæren enn i rotte blæren.
- Kutt vevet på langs fra base til dome i strimler av ~ 2 x 8 mm (figur 1B). Slips eller feste en vev klipp i begge ender av hver stripe.
MERK: En rotte blære kan vanligvis kuttes i 4 strimler men antall strips kan øke eller reduseres avhengig av dyret / blære størrelse. - Overfør strips til experimental kamre. Fest en ende av hver strimmel til en krafttransduktor som måler vev sammentrekning, og den andre til et fast glass / metallstang.
MERK: Tissue kamre variere i størrelse (0,2 ml til 20 ml eller større). Typiske kamre for gnagere blærer er 5-20 ml, noe som gir tilstrekkelig høyde for strimlene for å være fullstendig neddykket i oppløsningen. Noen kamre kommer med innebygd stimuleringselektroder, andre ikke. Forsiktighet bør utvises for å sikre at alle tilkoblinger av elektrodene er i god stand, ellers elektrisk felt stimulering er ikke pålitelig. - Påfør en definert mengde kraft til hver stripe ved å forsiktig strekke vevet før baseline spenning når en g (~ 10 mn). Utgangspunktet vevet har en tendens til å slappe av som er ført som en reduksjon i referanse spenning. Vask vev omtrent hvert 15 min ved hjelp av den varme oksygenert Krebs og justerer referansespenningen til 1 g etter hver vask. Tillat vev til stabilisering i ~ 1-2 timer eller til baseline spenning er stabil (dvs. ikke lenger vev avslapping).
- Test vevs-levedyktighet ved å tilsette KCl (80 mM) direkte til badet for ~ 5 minutter, eller inntil et platå respons er oppnådd. Responser til høye konsentrasjoner av KCl kan også bli gjentatt i løpet av forsøket, eller ved slutten av eksperimentet og brukt til å normalisere responser på andre medikamenter eller mellom strimlene (se normalisering i henhold til dataanalyse seksjon).
- Vask flere ganger vev (3-5x) med den varme oksygenert Krebs å tillate vev for å vende tilbake til forbehandling forhold.
4. Stimulering Protokoller
- For å undersøke effektene av patologien på spontan myogenisk aktivitet eller glatt muskeltonus, bruker glatte muskelstrimler fra forskjellige dyremodeller som SCI, BOO, eller nyfødte. Figur 2 illustrerer bruken av denne metoden for å undersøke forandringer i blæren spontan aktivitet i løpet av utvikling og etter SCI. I tillegg kan farmakologiske midler bli brukt til å modulere spontaneous aktivitet. Figur 3 illustrerer effekten av KCNQ-kanal-modulatorer, flupirtine og XE991, på spontan aktivitet og glattmuskeltone.
- For farmakologiske glatte muskelstimulering konstruere konsentrasjon respons kurver ved å legge forbindelser fra konsentrerte stamløsninger direkte til bad på definerte tidsintervaller. Bruk av narkotika og kjøretøy i parallelle striper å gjøre rede for kjøretøy og engangseffekter.
- Lag stamløsninger av ønskede testforbindelser ved 1000x den endelige arbeidskonsentrasjon. For karbakol (CCH), en muskarin reseptor agonist, forberede følgende aksjer: 10 -5 M, 3 x 10 -5 M, 10 -4 M, 3 x 10 -4 M, 10 -3 M, 3 x 10 -3 M , 10 -2 M. Endelige konsentrasjoner i badet er 10 -8 M til 10 M -5 (figurene 4C, D). For neuromedin B (NMB), en bombesinreseptoren subtype en agonist, forberede følgende aksjer: 10 -8 M, 10 -7M, 10 -6 M, 10 -5 M, 10 -4 M, 10 -3 M og sluttkonsentrasjoner i badekaret er 10 -11 M til 10 -6 M. Både CCH og NMB forventes å øke vev kontraktilitet.
- Til en 10 ml vevsbadet, tilsett 10 pl av hver CCH stamoppløsning så snart reaksjonen har nådd et platå (figur 4C, D). I parallelle strimler legger til like mengder av kjøretøyet (vann). Tilsvarende, tilsett 10 pl av hver neuromedin B stamløsning hver ~ 5 min.
MERK: Legg merke til eksitatoriske effekten av NMB og CCH på glatt muskel tone i strimler fra ulike arter i Figur 4. - Undersøke avslapping egenskapene til de glatte musklene i pre-kontrakt vev med en eksitatoriske agent, vanligvis CCH eller KCl.
- For å blokkere en agonist respons, forbehandle vevet i 10-20 min med antagonisten for å tillate vevspenetrasjon, før agonist stimulering.
- For nevrale Stimgler av glatt muskulatur, også kalt elektrisk felt stimulering (EFS) følger du trinn 1 til 3,13 og fortsetter som beskrevet nedenfor. EFS er beregnet til selektivt å aktivere nerver versus glatt muskulatur. Parametere for stimulering bør nøye utvalgt for å unngå direkte glatt muskelstimulering.
- Etablere stimulering parametere: type stimulus (single pulser eller tog), varighet (pulsvarighet og tog varighet), frekvens og intensitet, som beskrevet i trinnene nedenfor og illustrert i figur 5A, B.
- For enkelt puls stimulering, sett pulsvarighet, inter-stimulus intervall og antall stimuli ønsket. Vanlig varighet stimulering parametere er enkle pulser av 0,05 til 0,3 msek varighet levert på ønskede intervaller (figur 5a). Følg trinn 4.3.1.4 for stimulans intensitet.
- For tog stimulering, satt på toget varighet og inter tog intervall. Typiske verdier for blærevevet er 3-10 sek leveres minst 1 mi hverandre (Figur 5B). Hvis vev tretthet oppstår (dvs. EFS sammentrekninger avta under kontrollperioden), øke inter toget intervall.
- Etablere hyppigheten av tog stimuli (antall pulser i et tog - Figur 5B). Kjør en frekvensresponskurve som strekker seg 0,5 til 50 Hz. Typiske frekvenser for blæren er 10-20 Hz, som gir reproduserbare og stabile sammentrekninger mediert av ATP og ACh. Observer de frekvensavhengige responser til EFS stimulering i muse blære strips i Figur 5 viser hvordan denne metoden kan brukes til å vurdere bidraget av kolinerge og purinergiske mekanismer til nevrotransmisjon.
- Etablere intensiteten av stimulus: systematisk øke intensiteten (spenning) av stimulus til amplituden av sammentrekning når et platå (hvis det ved hjelp av tog holde frekvensen konstant).
- Sett intensiteten av stimulus avhengigMålet med eksperimentet. Hvis målet er å øke nevralt-fremkalte kontraksjoner, og deretter bruke submaksimal intensitet slik at amplituden av sammentrekning er ~ 50% av maksimal sammentrekning. Hvis målet er å redusere nevralt-fremkalte kontraksjoner, deretter sette intensiteten til ~ 80% av maksimal amplitude å unngå vev tretthet.
- Når stimuleringsparametere (varighet, hyppighet og intensitet) er etablert, la ~ 20-30 min for EFS- fremkalte kontraksjoner å stabilisere før narkotika testing.
MERK: For å verifisere selektiviteten EFS for nevrale overføring, blokk nevrale girkasse med Na + kanal blocker, tetrodotoxin (TTX; 0,5-1 mm). Utfør dette trinnet i begynnelsen av forsøket, som TTX vasker relativt lett. I tillegg gjør dette ved slutten av forsøket (se trinn 4.3.5. Nedenfor). - Forbered stamløsninger på 1,000x de endelige arbeids konsentrasjoner for: alfa, beta-metylen ATP (Abma, en purinergiske receptor activatorog desensitizer) 10 -2 M, atropin (et muskarinreseptorantagonist) 10 -3 M (figur 5C). Observer andre eksempler i figur 6. For 5HT4-reseptor-agonist, cisaprid (3 x 10 -6 M, 10 -6 M, 3 x 10 -5 M, 10 -5 M, 3 x 10 -4 M, 10 -4 M 3 x 10 -3 M, 10 -3 M), øker vev kontraktilitet og SB-203186 (3 x 10 -3 M), en 5HT4-reseptor-antagonist reverserer cisaprid effekter.
- For å teste effekten av Abma og atropin på EFS (figur 5C), utføre to kontrollfrekvens responskurver. Tilsett 10 pl av 10 -2 M Abma til badet for en endelig konsentrasjon på 10 uM. Dette vil trekke seg sammen i vevet på grunn av direkte stimulering av purinergiske reseptorer i den glatte muskulatur. Etter svar tilbake til baseline, gjenta frekvensresponskurver. Tilsett 10 pl av 10 -3 M atropin for en endelig Konsentraterion av 1 uM. Etter ~ 10 minutter (nødvendig for atropin for å blokkere muskarine reseptorer), vendende frekvensresponskurver. I parallelle strimler tilsett 10 pl av kjøretøyet, vann, i hvert trinn.
NB: For andre eksempler i figur 6, tilsett 10 pl av hver cisaprid stamløsning ved definerte tidsintervaller (~ hver 15 min, se diskusjonen), fulgt av 10 ul av SB-203186 lageroppløsning direkte til badet og overvåke deres effekt på EFS-indusert sammentrekning. I parallelle strimler tilsett 10 pl av kjøretøyet, DMSO. Observere effekten av cisaprid, en 5HT4 reseptor agonist, på EFS-fremkalte kontraksjoner i menneske blære og ileum vev i Figur 6. Tillegg observere effekten av DMSO, bilen for cisaprid, på EFS-fremkalt sammentrekninger i menneskehetens blære og ileum vev . - Ved slutten av den EFS protokollen bekrefte selektiviteten av EFS blokkerer nerveoverføring med Na + kanalblokkere, tetrodotoxin (TTX; 0,5-1 &# 181; M). Hvis TTX resistente trekningene er fortsatt til stede, anbefales det å justere varighet og intensitet av stimulans i senere eksperimenter.
- Etablere stimulering parametere: type stimulus (single pulser eller tog), varighet (pulsvarighet og tog varighet), frekvens og intensitet, som beskrevet i trinnene nedenfor og illustrert i figur 5A, B.
- For å bestemme effekten av narkotika på pre eller post-synaptiske områder (figur 7A) følger du trinn 1 til 4.3.2. Etablere reproduserbare svar på carbachol og EFS, deretter legge stoffet X.
- Ved slutten av eksperimentet, løsne eller knyte opp strimlene, blot dem forsiktig på et stykke silkepapir for å eliminere ekstra fluid og måler hver strimmel vekt ved hjelp av en balanse. Også måle vev lengde ved hjelp av et skyvelære for å bestemme tverrsnittsarealet. Denne informasjonen brukes til normalisering av data (se avsnitt 5.4).
5. Data Analysis
Analysere data ved hjelp av tilstrekkelig programvare (f.eks Windaq, LabChart).
- For spontan aktivitet ved å velge et vindu på minst 30 sekunder før, og på toppen av legemiddel-induserte responsen og megasure amplitude og frekvens av myogenisk aktivitet (figur 3).
- Bruk rask Fourier-transformasjon-analyse for å bestemme spekteret av frekvenser som bidrar til kontraktile responser, og om det er forskjeller mellom de forskjellige deler av blæren (f.eks kuppel g halsen) eller med utvikling, patologi, og medikamenter 8.
- For virkninger på glatt muskeltonus velge et vindu på minst 10-30 sekunder før, og på toppen av legemiddel-induserte responsen og måle amplituden av kontraksjon.
- For effekter på nevralt-fremkalte kontraksjoner måle amplitude, varighet og arealet under kurven av kontraksjoner (minst tre) før, og på toppen av legemiddel-indusert respons.
NB: Det er nødvendig å måle både amplituden og arealet under kurven over EFS-induserte kontraksjoner på grunn purinergiske og kolinerge komponenter har forskjellig kinetikk. Den purinergiske komponenten er rask og forbigående (ATP aktiverer purinergic ionotrofiske kanaler som P2X1 som tillater raske tilstrømningen av kalsium, så de ufølsomme), og dermed bidra mer til peak amplitude respons og mindre til området under kurven. Den kolinerge komponenten er tregere og vedvarende (ACH aktiverer metabotrope muskarine reseptorer, som krever mer tid til å aktivere intracellulære trasé som til slutt aktiverer ionekanaler som Depolarize glatt muskulatur til å indusere en sammentrekning). Således er muskarin komponent fanges bedre ved å måle arealet under kurven. - Normalisere dataene for å kunne sammenligne resultatene på tvers av strimlene og farmakologiske behandlinger. Den parameter som er valgt for normalisering bør ikke være påvirket av testforbindelsene, patologisk tilstand studert eller eksperimentell utforming. Blant disse parametrene, bruk strimmel vekt, tverrsnittsareal, KCl responser (Figur 4B),% av maksimal respons (figur 7B) eller% av den maksimale kontraktile respons på et annet middel(F.eks, CCH) eller avslappende midler (f.eks, papaverin).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spontan myogenic aktivitet
Spontan myogenic aktivitet er en viktig glatt muskulatur kjennetegn som gjennomgår endringer med postnatal utvikling 6-9 og patologi (f.eks, SCI, BOO) 3-5. Fordi denne aktiviteten er antatt å bidra til de symptomer på overaktiv blære (OAB) 2, er en evaluering av intracellulære reseptorer, stier og farmakologiske midler som modulerer den, av stor interesse for å utvikle effektive behandlinger for OAB og andre glatte muskelceller dysfunksjoner. Fremgangsmåten presentert her kan enkelt undersøke disse spørsmålene Figur 2 illustrerer forskjellige mønstre av myogenisk spontan aktivitet under utvikling av nyfødte (i), juvenile (ii) voksen (iii) og ryggmargen skadet rotter. SCI (; iv). Strips fra neonatale rotter utviser stor amplitude, lavfrekvente rytmiske sammentrekninger (Figur 2Ai), mens strimler fra voksen rottes utviser liten amplitude, høyfrekvent aktivitet (Figur 2Aii iii,). Etter SCI nyfødt mønsteret gjenoppstår (figur 2Aiv). I tillegg til å bruke strips fra dyremodeller, kan ulike farmakologiske midler brukes til å fremkalle spontane sammentrekninger i strimler fra naive dyr, med sikte på å forstå mekanismene bak den spontane sammentrekninger. Eksempler på egnede farmakologiske midler inkluderer muskarine reseptoragonister (karbakol; CCH). Kan forbindelser som øker ACh-nivåer (for eksempel acetylcholin esterase-inhibitorer), lave konsentrasjoner av KCl (f.eks, 20 mM) eller andre eksperimentelle medikamenter figurene 3A-B, illustrerer modulasjon av spontan aktivitet av farmakologiske midler som virker på KCNQ-kanaler som ligger på den glatte muskulatur. Den KCNQ kanalåpner, flupirtine, avtar amplituden og frekvensen av spontane aktivitet i et konsentrasjonsavhengig måte (figur 3AI-iii), mens denKCNQ kanalblokker, XE991, avtar amplituden, men øker hyppigheten av spontane aktivitet (figur 3BI-iii).
Smooth Muscle Tone
Glatt muskel tone og kontraktilitet egenskaper er viktige faktorer for riktig funksjon av blæren under lagring og ugyldiggjøre. Denne fremgangsmåte kan lett screene virkningene av farmakologiske midler på glatt muskeltonus. Figurene 3Aiv og 3Biv viser at flupirtine avtar basal tone, i samsvar med avslapning av glatt muskulatur, mens XE991 øker glattmuskeltone. Figur 4 illustrerer konsentrasjonsavhengige økninger i glatt muskeltonus ved å aktivere bombesin-reseptorer med neuromedin B (NMB, figur 4A, B) eller muskarinreseptorer med carbachol (CCH; figurene 4C, D). Videre kan intracellulære baner som medierer disse glatte muskelceller responser granskes usynge spesifikke modulatorer (data ikke vist).
Nevralt-mediert Responses og modulering av nevrotransmisjonen
Blære sammentrekning oppnås ved utgivelsen av ACH / ATP fra det parasympatiske efferente nerver. Bidraget av muskarine og purinergiske systemer til blæren sammentrekning varierer mellom arter og patologiske tilstander, med overveiende økning av purinergiske bidrag i patologier som for eksempel interstitial cystitt, partiell obstruksjon, og overaktiv blære 26. Figur 5C viser bruken av denne metoden for å bestemme bidrag av muskarine og purinergiske komponenter til nevrotransmisjon i blæren strimler fra musen. Bidraget fra de kolinerge komponenten ble vurdert ved hjelp av muskarinreseptorantagonist, atropin. Bidraget av purinergiske systemet ble vurdert ved hjelp av purinergiske reseptor aktivator og desensitizer, alfa, beta-metylene ATP (Abma). I tillegg ble det frekvensavhengig bidraget av hver komponent vurderes ved å variere stimuleringsfrekvensen fra lave til høye frekvenser (2-50 Hz).
Styrken av blæren sammentrekning spiller en betydelig rolle i å annullere effektivt. Ved hjelp av denne metoden, kan reseptorer og trasé som modulerer nevrale overføring bli etterforsket som narkotika mål for ugyldig dysfunksjoner. De 5HT4-reseptorer er uttrykt pre-junctionally i parasympatiske nevroner og deres aktivering øker ACh-nivåer 27. Figur 6 viser effekten av eksitatoriske 5HT4 reseptoragonist, cisaprid, i humane blære og ileum strimler.
Forskjellige eksperimentelle protokoller kan anvendes for å bestemme området av virkningen av en testforbindelse. Diagram i figur 7A illustrerer en protokoll som brukes til å vurdere pre vs postjunksjonale nettsteder. Hvis stoffet X reduserer (eller øker) EFS respons, men har ingen effect på CCH respons, er den mest sannsynlige handlingsstedet prejunksjonale. Hvis stoffet X endrer både EFS og CCH respons, så kan det handle på reseptorer plassert post-junctionally eller både før og etter junctionally.
Rollen til hver komponent: glatt muskulatur, slimhinner, og Neuronal
Forskjellige patologiske tilstander kan påvirke forskjellige komponenter av blæren. For eksempel interstitiell cystitt (IC) påvirker primært urothelium, mens OAB kan resultere i forandrede glatt muskulatur kontraktilitet. Dessuten kan forskjellige reseptorer uttrykkes på hvert blæredelen, og således kan bli spesifikt rettet i en bestemt patologi. I motsetning til in vivo-metoder, som måler en nettoeffekten av alle blære komponenter, gjør det mulig for denne in vitro metode for undersøkelse av spesielle komponenter ved å bruke en kombinasjon av kirurgiske og farmakologiske prosedyrer. For å teste glatt muskelkontraksjon / avslapning i fravær av neuronaloverføring, TTX (0,5-1 mm) kan legges til badekaret. I figur 4, ble NMB og CCH testet i nærvær av TTX. For å teste bidraget av mucosa (urothelium og lamina propria) til den glatte muskel kontraktilitet, er strimler med og uten slimhinnen sammenlignet. Figur 7B viser at responser på CCH reduseres i nærvær av slimhinnen i svine 28. Lignende resultater ble rapportert i menneskelige blære strimler 29. For å teste rollen av nervefibre, kan flere tilnærminger tas. Det ene er å aktivere eller hemme spesifikke fibre ved hjelp av medikamenter. For eksempel, kapsaicin aktiverer en spesifikk populasjon av afferente nerver, og forårsaker artsavhengig glatt muskelkontraksjon eller avslapping 17,18. Guanetidin hemmer frigjøring av noradrenalin fra sympatiske fibre, og dermed eliminere bidraget av disse fibrene. En annen tilnærming er å ufølsomme / eliminere spesifikke fibre in vivofør eksperimentet. For eksempel, systemisk behandling av dyret med capsaicin desensitizes capsaicin sensitive afferente nerver. Andre blære komponenter som kan studeres i dette preparatet er interstitielle celler eller gap veikryss ved å aktivere eller blokkere dem med konkrete midler.
Artsforskjeller
Mens de fleste medikamentutvikling er beregnet for behandling av humane lidelser, er grunnleggende forskningen primært utført i animalsk vev. Art forskjeller eksisterer i en rekke reseptorer. For eksempel, 5HT4 reseptor agonister forbedre nevralt-fremkalte kontraksjoner i menneske blæren, men ikke i rotte blæren 19,30, EFS-indusert sammentrekninger er nesten utelukkende atropin-sensitive i menneskelige og gammeldags ape detrusor fra stabile blærer 31 men blir delvis atropin-resistente i menneskelig detrusor fra pasienter med ustabil blære forhold (f.eks nevrogen, obstructed blærer) 15,32,33, utløser capsaicin en eksitatoriske respons i rotte og menneskelig blære strimler, ingen respons i gris blære strimler og hemmende respons i marsvin blære strimler 17,18. Figur 4 viser at bombesinreseptoren agonister har eksitatoriske effekter på rotte blære og ingen effekt på mus og gris blære strimler 16. Denne informasjonen er kritisk for utvelgelse av den passende dyremodell for å studere en bestemt reseptor.
Sammenligning av følsomhet over Organs
Legemidler som er beregnet for behandling av blæreforstyrrelser kan også påvirke glattmuskel fra andre organer, slik som fordøyelseskanalen, urinrøret, galleblæren, etc. Denne metoden tillater beregning av organ selektivitet og følsomhet til et farmakologisk middel ved å sammenligne forskjellige vev ved siden av hverandre. Som illustrert i figur 6, på 5HT4-reseptoragonist, cisaprid, har forskjelligent effekt og potens i menneskelig blæren vs ileum vev.
Figur 1. Eksperimentell oppsett og blære stripe forberedelse. A) Skjematisk av den eksperimentelle oppsett. Blære strimler er nedsenket i vev kamre fylt med luftet Krebs løsning holdt ved 37 ° C via en sirkulasjonsvannpumpen. En ende av strimmelen er festet til en isometrisk kraft transduser for å måle vev kontraktilitet, den annen til en fast stang. Den kraft transduser er koblet til en forsterker og datamaskin for dataopptak. Elektrisk feltstimuleringselektroder som er koblet til en stimulator er plassert i kammeret og som brukes for fremkaller nevralt-medierte blæresammentrekninger. B) Fremstilling av vev strimler. Blæren er låst ned i en skål og følgende prosedyrer utføres: # 1 vertikale kutte though ventral halvparten av blæren fra urinrøret til dome å åpne blæren inn i et flatt ark. # 2 horisontale kutt fjerne kuppelen og bunnen av blære / proksimale urinrør. . # 3 vertikale kutt dele midten blæren i like strimler (4 strimler fra en rotte blære) C) Skjematisk av strippe komponenter: glatt muskulatur og slimhinner, som begge inneholder afferent (blå) og efferente (grønn) nerver. Slimhinnen består av urothelium og lamina propria. Lamina propria inneholder blodkar [1], interstitiell celler [2], og muskularis slimhinner [3]. Stiplede linjen merket # 2b viser fremgangsmåten for å fjerne slimhinnen lag. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. myogeniske spontan aktivitet under utvikling og etterpatologi. A) Eksempler på spontan aktivitet i neonatal (i), juvenile (ii), spinal intakt voksen (iii) og ryggmargen skadet (SCI) voksen (iv) rotte blærestrimler. Den SCI rotte ble brukt ved 4 uker etter kirurgi. B, C) Oppsummering av amplitude (B) og frekvens (C) av spontane sammentrekninger i de fire gruppene som er undersøkt. (Gjengitt med tillatelse fra Artim DE, Kullmann FA, Daugherty SL, Bupp E, Edwards CL, de Bokhvete WC Neurourol Urodyn 2011 november; 30 (8):.. 1666-1674.) Klikk her for å se en større versjon av dette figuren.
Figur 3. Modulering av myogenisk spontan aktivitet og glattmuskeltone. A) Virkningen av KCNQ kanalåpner, flupirtine, på spontan aktivitet og baseline tone hos voksne rotter blære strimler. (I) Flupirtine ble tilsatt i økende konsentrasjoner (kumulativ) ved de angitte tider ved piler. De forstørrelser under sporingen viser 4 min av stripe aktivitet under kontroll og etter påføring av 10 mm og 50 mikrometer flupirtine. (Ii-iv) Oppsummering av effektene av flupirtine (7 strimler fra 4 rotter) på amplituden (ii) og frekvens (iii) av spontan aktivitet og referansetone (iv), uttrykt som% endring fra kontrollverdier (pre-medikament) , som ble satt til 100%. B) Effekten av KCNQ kanalblokker, XE991, på spontan aktivitet og referansetone hos voksne rotteblærestrimler. (I) XE991 ble tilsatt i økende konsentrasjoner (kumulativ) ved de angitte tider ved piler. De forstørrelser under kurven viser 2 min av strimmelen aktivitet under kontroll og etter påføringen av 10 uM og 50 uM XE991. (Ii-iv) Oppsummering av effektene av XE991 (9 strimler fra 4 rotter) påamplitude (ii) og frekvens (iii) av spontan aktivitet og baseline tone (iv), uttrykt som% endring fra kontroll (pre-stoff) verdier, som ble satt til 100%. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren .
Figur 4. artsforskjeller. A) konsentrasjonsavhengig glatte muskelsammentrekninger i respons til bombesinreseptoren agonist, neuromedin B (NMB), i rotte blære strimler. B) Sammendrag av effekter av NMB på glatt muskel sammentrekning i rotte blære strimler. Dataene er normalisert til KCl (80 mM) respons. C, D) Fravær av responser overfor NMB i mus (C) og svin (D) blærestrimler. Carbachol (CCH) utløser sterke konsentrasjonsavhengig contractions i både mus og gris strimler, som indikerer at stripene kan svare på stimuli. TTX (0,5 uM) var til stede i badet i alle strimler. (Gjengitt med tillatelse fra Kullmann FA, McKenna D, Wells GI, Thor KB neuropeptides 2013 oktober, 47 (5):.. 305-13) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Elektrisk felt stimulering. A) Skjematisk av single puls stimuleringsparametere. Forkortelser: D = varighet av puls, i = intensitet av puls, IPI = inter puls intervall B) Skjematisk av tog stimuleringsparametere.. Forkortelser: td = tog varighet, i = intensitet av puls, iti = inter tog intervall. Inset viser antall pulser i et tog og intervallet between dem, som sammen med tog varighet bestemme frekvensen av toget stimulering. C) Bidrag av purinegic og kolinerge komponenter til nevralt-fremkalt blære sammentrekninger. EFS-FR representerer stimulering frekvenser, 2, 5, 10, 20, 50 Hz. Tre stimuli levert hver 90 sek ble testet for hver frekvens og hver frekvensserie ble gjentatt to ganger i kontroll og to ganger etter tilsetning av hver forbindelse. Alfa, beta-metylen ATP, forkortet Abma (stripe 1), ble anvendt for å ufølsomme purinergiske reseptorer og atropin (stripe 2) ble anvendt for å blokkere muskarinreseptorer. Strip-3 tjente som kontroll og ble behandlet med kjøretøyet, vann. Piler indikerer tidspunktet når hver forbindelse ble tilsatt til hver stripe. Merk at EFS-fremkalte kontraksjoner er sterkt redusert med Abma og atropin, mens ikke påvirket av kjøretøyet. TTX ble tilsatt ved slutten av forsøket, mens EFS ble levert ved 20 Hz. Legg merke til at resterende kontraksjoner observert i kontrollgruppenstripe tre ble avskaffet ved TTX, demonstrere sin nevrale natur (dvs. initiert av senderen utgivelse fra egenutført nerver). # Indikerer glatte muskelceller svar på Abma i fravær av EFS. Scale barer er 5 min for x-aksen og 2 g for y-aksen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Modulering av nevralt-fremkalt blæresammentrekninger. A, B) Eksempler på forbedring av nevralt-fremkalte kontraksjoner av 5HT4-reseptoragonist, cisaprid i human blære (A) og ileum strimler (B). Cisaprid (sorte plater) eller DMSO (grå plater) ble tilsatt i et konsentrasjonsavhengig måte i de angitte tider ved piler. Svarte striper under postene i hvert panelrepresenterer EFS, som besto av 10 sek togene levert ved 20 Hz hver 120 sek. Vertikale skala barer er en g for alle eksempler. TTX konsentrasjonen var 0,5 uM. CF) Oppsummering av arealet under kurven (AUC) på EFS-fremkalte kontraksjoner som respons på cisaprid (svarte søyler) eller DMSO (grå søyler) i blærestrimler (C, D) og ileum strimler (E , F). I CF, står for SB SB-203186, som viser en oppsummering av data oppnådd etter at tilsetningen av 5HT4-reseptorantagonist. Stiplede linjer er satt til 100%, og representerer kontroll. (Gjengitt med tillatelse fra Kullmann FA, Kurihara R, Ye L, Wells GI, McKenna DG, Burgard EC, Thor KB Auton Neurosci 2013 Jun; 176 (1-2):... 70-7) Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 7. nettsteder for handling av narkotika og rollen til ulike komponenter av blæren. A) Skjematisk av protokoll for å identifisere stedet for handling av et medikament. Strips blir stimulert med ESF og carbachol (CCH). In i medikament X reduserer EFS respons, men ikke CCH respons, noe som indikerer en prejunksjonale virkningssete. I ii, endrer stoffet X begge svar, noe som indikerer en handling på postjunksjonale eller både pre-og postjunksjonale reseptorer. B) Influence of slimhinne på glatt muskelkontraksjon. Effekter av karbakol er redusert i strimler med slimhinnene tilstede (intakt) i forhold til strimler med slimhinnen fjernet (ribbet). (B er gjengitt med tillatelse fra Hawthorn MH, Chapple CR, Cock M, Chess-Williams R. Br J Pharmacol 2000 februar, 129 (3):. 416-9). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen beskrives vi en enkel in vitro glatt muskulatur kontraktilitet metode som kan brukes til å adressere en rekke viktige vitenskapelige spørsmål relatert til blæren fysiologi og patologi, samt å behjelpe oppdagelsen av nye medikamenter for å behandle blære-dysfunksjoner. Vi har vist at bruken av denne metoden for å vurdere utviklings, patologiske og farmakologiske egenskaper av blæreglattmuskel-kontraktilitet (figurene 2-4), neurotransmisjon modulering (fig 5-7A), artsforskjeller (figur 4), organ-forskjeller (figur 6) og relevansen av spesifikke blære komponenter (for eksempel, slimhinner, figur 7B). Andre programmer som ikke illustrert her inkluderer evaluering av intracellulære trasé ved hjelp av farmakologiske midler 3,10,11, struktur-aktivitets sammenhenger av ulike medikamenter 22-24, eller evaluering / kvantifisering av sender releÅse etter nervestimulering 25.
Mens blærefunksjonen kan til slutt bli vurdert in vivo, overvinner denne in vitro metode mange situasjoner som er problematiske in vivo. Disse inkluderer situasjoner når kirurgiske og farmakologiske manipulasjoner vil redusere levedyktigheten og / eller overlevelse av organ eller dyret, bruk av menneskelig vev, behovet for å identifisere og karakterisere svar fra bestemte komponenter (for eksempel, glatt muskulatur sammenlignet med epitel g nerver ) eller bruk av kostbare kjemikalier. Fremgangsmåten gjør det mulig systematisk undersøkelse av effektene av forskjellige farmakologiske midler, så vel som patologi på kontraktil aktivitet av glatt muskulatur, og i en godt kontrollert måte og miljø.
Metoden gir en mengde informasjon; Imidlertid bør man være forsiktig når man tolker og ekstrapolere denne informasjonen. Dette er en in vitro-metode for et redusert preparat, diskoplet fra sitt normale miljø og neural kontroll. De eksperimentelle forhold er ikke fysiologisk, således at dataene ikke helt gjenspeiler in vivo fysiologiske situasjoner. For eksempel, kan metoden ikke gjøre rede for endringer i blodstrøm, hormoner, humorale stoffer, ytre mekaniske krefter, eller extrinsic nevrale kontroll. Tissue er akutt desentralisert, og dermed skade og iskemi relaterte responser må evalueres og tas hensyn til. Patologiske endringer som forekommer i hjernen eller ryggmargen kan ikke testes ved hjelp av denne metoden, dersom de ikke allerede er endret afferent, glatt muskulatur, slimhinne eller utført nervefunksjon (dvs. celle plastisitet). Elektrisk felt stimulering (EFS) gjør at evaluering av nevralt mediert svar. Imidlertid eksiterer det ukritisk alle nerver i stripen (f.eks sympatiske, parasympatiske, afferenter), i motsetning til in vivo-situasjonen hvor vannlatingsrefleksen aktiverer bare bestemt pathways. En måte å overvinne denne situasjon er å kombinere EFS med spesifikke antagonister som selektivt blokkerer forskjellige veier. For eksempel kan guanetidin bli brukt til å blokkere noradrenalin frigjøring når man studerer sammentrekning egenskaper, atropin eller kan bli brukt til å blokkere muskarinreseptorer å hindre blæresammentrekninger når studere avspenningsegenskaper. Endelig blir levedyktigheten av vevet begrenset til et visst antall timer. Generelt er de fleste komponenter av blærevevet levedyktig, og er stabile (dvs. reagerer på EFS uten å forringe responser) over en periode på 6-8h eller lengre. Imidlertid kan andre vev være mer følsom (f.eks, varer ileum ~ 6 timer eller mindre; forfatterens personlig erfaring).
Selv om metoden er teknisk mulig, og med god reproduserbarhet, er det flere viktige trinn som er nødvendige for å sikre dens suksess. Først bør vevspreparat utføres omhyggelig for å sikre levedyktighet ved å gjøre nødvendige endringertil disseksjon prosedyre (unngå strekk i vevet, mens fremstilling av strimler) og / eller media hvis nødvendig for forskjellige typer vev eller arter. Et annet kritisk punkt er å sette opp nevrale stimulering parametere, slik at tak effekter unngås. Som beskrevet i metoden delen, dette avhenger av typen av eksperimentet utført og forventet virkningsmekanismen av testforbindelsen. For eksempel, for å teste effektene av cisaprid, en 5HT4-reseptoragonist, på blærestrimler (figur 6), satte vi amplituden EFS-fremkalt kontraksjon til ~ 50% av den maksimale. Dette var basert på den kjente virkningsmekanismen til 5HT4 reseptor agonister, nemlig styrke ACH utgivelse fra prejunksjonale parasympatiske nerver 27, som igjen forventes å øke EFS-fremkalt sammentrekninger. Stimulering av muskel vs nerver bør testes ved hjelp TTX, som hemmer nevrale overføring og dermed bør hemme EFS-fremkalt sammentrekninger. Betryggende kontroll for kjøretøyet og time må utføres i løpet av dopingprøver å gjøre rede for forverring av vev med tid og for eventuelle effekter av kjøretøyet. For eksempel er mange legemidler løst i DMSO eller etanol. Våre data (figur 6) viser at DMSO (0,1% eller høyere) kan øke nevralt-fremkalte kontraksjoner, en effekt som må subtraheres fra effekten av testmedikament. Tilsvarende, etanol (inntil 1%) reduserer den spontane glatte muskelkontraksjoner, men har ingen effekt på nevralt-fremkalte kontraksjoner 34,35. Hvis du bruker genmanipulerte dyr eller kirurgiske modeller (f.eks, ryggmargsskade eller ovariektomi), bør kontroller omfatter vev fra den riktige bakgrunnen muse belastning eller simulert opererte dyr, henholdsvis. I tillegg er noen vev, som menneske, mus og marsvin blærer inneholde egenutført ganglier. Når du arbeider med disse vev, må protokollvalg og tolking ta hensyn til virkningene av narkotika eller EFS på egenutført neurons som ytterligere stimulere glatte muskler.
Designe den eksperimentelle protokollen, velge de riktige parameterne (for EFS, for narkotika stimulering) og konsentrasjoner som skal testes er avgjørende for å sikre meningsfulle data. Mens parametrene bør justeres for enkelte vev og narkotika, generelle prinsipper / retningslinjer skissert nedenfor er aktuelt. Kumulative konsentrasjons-responskurver er ønskelig, men dette er ikke mulig for alle forbindelser. Legemidler som målretter reseptorer som ufølsomme, slik som purineric ionotrofiske reseptorer (P2X), eller medikamenter som metaboliseres raskt i vev (f.eks ACh), ikke kan bli pålitelig testet ved hjelp av kumulative konsentrasjons-responskurver i samme vev. I disse tilfellene er enkelt konsentrasjoner testet i ulike grupper av vev. For å evaluere desensitivisering, er det anbefalt å sammenligne størrelsen av responsen fremkalt av en enkelt høy konsentrasjon til det som oppnås ved slutten av en kumulativ konsentrasjonresponskurve.
For nøyaktig tilpasning av data innhentet fra konsentrasjon-responskurvene, er det ønskelig å teste en halv log-konsentrasjoner (f.eks CCH i figur 6). Men log konsentrasjoner (f.eks NMB i figur 4A) er akseptabel når vevs-levedyktighet, kan være begrenset, eller andre begrensninger kan være på plass.
For å velge et konsentrasjonsområde for en ny forbindelse, i foreløpige eksperimenter, er det nyttig å vurdere bindingsaffiniteten av testforbindelsen, og to effekt 10 over og under denne konsentrasjonen. I etterfølgende eksperimenter, blir protokollen raffinert for å bestemme et startpunkt der ingen effekt av medikamentet blir observert, og et sluttpunkt hvor enten responsen er maksimal eller konsentrasjonen testet ikke lenger er spesifikk for den tilsiktede målet.
Tidsintervallet for påføring av et medikament bør velges tar hensyn til flere faktorer: a) Tiden for enstoffet til å ha en effekt. I generelle legemidler rettet mot membranreseptorer har en relativt rask respons (sekunder til minutter), mens narkotika for intracellulære mål (f.eks forskolin og andre hemmere 36, botulinum toxin 37) krever ekstra inkubasjonstid (30 min - 3 timer). I tillegg kan vevstykkelse spille en rolle. b) Varighet og virkningsmekanismen til stoffet. For tilfeller der medikamentet effekten når et platå som er påført, slik som NMB i figur 4A og cisaprid i figur 6, er tidsintervaller på 5-15 min mellom stoffet applikasjoner tilstrekkelig for å samle nok data. Dette er ikke mulig med legemidler som har en mye kortere virkningsvarighet eller annen virkningsmekanisme (ATP, CCH). For eksempel ble virkningen av CCH i figur 4C og 4D, når et platå hurtig, men vevet spenninger har en tendens til å vende tilbake til grunnlinjen. I dette tilfellet er tidsintervallene trenger å bli justert i henholdly, vanligvis tilsette neste konsentrasjon når den første reaksjon når et maksimum.
Dataanalyse, spesielt normalisering av data for sammenligning mellom strimler er et svært viktig skritt. Forskjellige studier bruke forskjellige parametere for normalisering, inkludert strimmel vekt på 38, stripe tverrsnittsareal 39, KCl-respons 12% av maksimal respons eller 28% av den maksimale kontraktile respons på et annet middel (f.eks, CCH 38). Normaliserings parameter bør velges avhengig av formålet av forsøket, slik at parameteren ikke er påvirket av testforbindelser, patologi eller eksperimentell utforming. For eksempel normalisering til KCl-respons eliminerer vekt og andre dimensjoner av strimlene, og dermed kan brukes til å sammenligne responser i vev hvor patologisk tilstand kan øke vekten av strimlene (f.eks øker diabetes blæren masse). I tillegg rerespons på KCl ikke påvirkes av fjerningen av slimhinnen / urothelium 29, kan således bli brukt i forsøk som evaluerer forskjellige komponenter av blæren (f.eks mucosa vs glatte muskler).
Oppsummert gir dette kontraktilitet metoden en rask, enkel og svært kraftig tilnærming for å vurdere blære (og andre organer) fysiologi og farmakologi. Når det brukes riktig, gir det muligheten til å manipulere vev i en redusert og godt kontrollert miljø. I studiet av urinblærefunksjon, denne metoden var instrumental i oppdagelsen og testing av forbindelser som i dag brukes for OAB styring, slik som antimuskariner og nyutviklet β 3 AR agonister.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av NIH R37 DK54824 og R01 DK57284 tilskudd til LB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Tissue Bath System with Reservoir | Radnoti, LLC | 159920 | isolated tissue baths |
| Warm water recirculator pump | Kent Scientific Corporation | TPZ-749 | to keep tissue baths to 37 °C |
| Computer | |||
| Data Acquisiton System | DataQ Instruments | DI-710-UH | To view, record and analyze data |
| Transbridge Transducer Amplifier | World Precision Instruments | SYS-TBM4M | Transducer amplifier |
| Grass stimulator | Grass Technologies | Model S88 | Stimulator |
| Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | ACV-1205S | To anesthetesize the animal |
| Anesthetizing Box | Harvard Apparatus | 500116 | To anesthetesize the animal |
| Anesthesia Masks | Kent Scientific Corporation | AC-09508 | To anesthetesize the animal |
| Materials and Surgical Instruments | |||
| Sylgard | Dow Corning Corp | 184 SIL ELAST KIT | To pin, dissect, & cut tissue |
| Petri Dish | Corning | 3160-152 | To dissect/cut tissue |
| Insect Pins | ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins | Size 5 | To pin tissue |
| Bench Pad | VWR International | 56617-014 | Absorbent bench underpads |
| Rat surgical Kit | Kent Scientific Corporation | INSRATKIT | To remove and dissect tissue |
| 2 Dumont #3 Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500064 | To remove and dissect tissue |
| Tissue Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500092 | To remove and dissect tissue |
| Scalpel | Kent Scientific Corporation | INS500236 | To remove and dissect tissue |
| Scalpel blade | Kent Scientific Corporation | INS500239 | To remove and dissect tissue |
| Professional Clipper | Braintree Scientific, Inc. | CLP-223 45 | To remove fur |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Tie tissue |
| Tissue Clips | Radnoti, LLC | 158802 | Attach tissue to rod/transducer |
| 1 g weight | Mettler Toledo | 11119525 | For transducer calibration |
| Chemicals | |||
| Krebs Solution: Sodium chloride Potassium chloride Monobasic potassium phosphate Magnesium sulfate Dextrose Sodium bicarbonate Calcium chloride Magnesium chloride |
Sigma Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma EMD Baker |
S7653 P217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444 |
To prepare Krebs solution |
| Isoflurane | Henry Schein | 029405 | To anesthetesize the animal |
| Oxygen tank | Matheson Tri Gas | ox251 | To use with anesthesia system |
| Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide) | Matheson Tri Gas | Moxn00hn36D | To aerate Krebs solutions |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Andersson, K. E. Detrusor myocyte activity and afferent signaling. Neurourol Urodyn. 29, 97-106 (2010).
- Artim, D. E., et al. Developmental and spinal cord injury-induced changes in nitric oxide-mediated inhibition in rat urinary bladder. Neurourology and urodynamics. 30, 1666-1674 (2011).
- Kita, M., et al. Effects of bladder outlet obstruction on properties of Ca2+-activated K+ channels in rat bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 298, 1310-1319 (2010).
- Barendrecht, M. M., et al. The effect of bladder outlet obstruction on alpha1- and beta-adrenoceptor expression and function. Neurourol Urodyn. 28, 349-355 (2009).
- Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. Postnatal development of myogenic contractile activity and excitatory innervation of rat urinary bladder. The American journal of physiology. 247, 972-978 (1984).
- Ng, Y. K., de Groat, W. C., Wu, H. Y. Smooth muscle and neural mechanisms contributing to the downregulation of neonatal rat spontaneous bladder contractions during postnatal development. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 292, 2100-2112 (2007).
- Szell, E. A., Somogyi, G. T., de Groat, W. C., Szigeti, G. P. Developmental changes in spontaneous smooth muscle activity in the neonatal rat urinary bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, 809-816 (2003).
- Szigeti, G. P., Somogyi, G. T., Csernoch, L., Szell, E. A. Age-dependence of the spontaneous activity of the rat urinary bladder. J Muscle Res Cell Motil. 26, 23-29 (2005).
- Frazier, E. P., Braverman, A. S., Peters, S. L., Michel, M. C., Ruggieri, M. R. Does phospholipase C mediate muscarinic receptor-induced rat urinary bladder contraction. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 322, 998-1002 (2007).
- Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Selective inhibition of phosphodiesterase 1 relaxes urinary bladder smooth muscle: role for ryanodine receptor-mediated BK channel activation. American journal of physiology. Cell physiology. 303, 1079-1089 (2012).
- Frazier, E. P., Peters, S. L., Braverman, A. S., Ruggieri, M. R., Michel, M. C. Signal transduction underlying the control of urinary bladder smooth muscle tone by muscarinic receptors and beta-adrenoceptors. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 377, 449-462 (2008).
- Svalo, J., et al. The novel beta3-adrenoceptor agonist mirabegron reduces carbachol-induced contractile activity in detrusor tissue from patients with bladder outflow obstruction with or without detrusor overactivity. European journal of pharmacology. 699, 101-105 (2013).
- Yokota, T., Yamaguchi, O. Changes in cholinergic and purinergic neurotransmission in pathologic bladder of chronic spinal rabbit. J Urol. 156, 1862-1866 (1996).
- Bayliss, M., Wu, C., Newgreen, D., Mundy, A. R., Fry, C. H. A quantitative study of atropine-resistant contractile responses in human detrusor smooth muscle, from stable, unstable and obstructed bladders. J Urol. 162, 1833-1839 (1999).
- Kullmann, F. A., McKenna, D., Wells, G. I., Thor, K. B. Functional bombesin receptors in urinary tract of rats and human but not of pigs and mice, an in vitro study. Neuropeptides. 47, 305-313 (2013).
- Sadananda, P., Kao, F. C., Liu, L., Mansfield, K. J., Burcher, E. Acid and stretch, but not capsaicin, are effective stimuli for ATP release in the porcine bladder mucosa: Are ASIC and TRPV1 receptors involved. European journal of pharmacology. 683, 252-259 (2012).
- Maggi, C. A., et al. Species-related variations in the effects of capsaicin on urinary bladder functions: relation to bladder content of substance P-like immunoreactivity. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 336, 546-555 (1987).
- Kullmann, F. A., et al. Effects of the 5-HT4 receptor agonist, cisapride, on neuronally evoked responses in human bladder, urethra, and ileum. Autonomic neuroscience : basic & clinical. 176, 70-77 (2013).
- Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Human tachykinin NK2 receptor: a comparative study of the colon and urinary bladder. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30, 632-639 (2003).
- Zoubek, J., Somogyi, G. T., De Groat, W. C. A comparison of inhibitory effects of neuropeptide Y on rat urinary bladder, urethra, and vas deferens. The American journal of physiology. 265, 537-543 (1993).
- Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationship of neurokinin A(4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the effect of amino acid substitutions on receptor affinity and function. Biochem Pharmacol. 63, 2181-2186 (2002).
- Warner, F. J., Mack, P., Comis, A., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationships of neurokinin A (4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the role of natural residues and their chirality. Biochem Pharmacol. 61, 55-60 (2001).
- Dion, S., et al. Structure-activity study of neurokinins: antagonists for the neurokinin-2 receptor. Pharmacology. 41, 184-194 (1990).
- Somogyi, G. T., Zernova, G. V., Yoshiyama, M., Yamamoto, T., de Groat, W. C. Frequency dependence of muscarinic facilitation of transmitter release in urinary bladder strips from neurally intact or chronic spinal cord transected rats. British journal of pharmacology. 125, 241-246 (1998).
- Andersson, K. E., Wein, A. J. Pharmacology of the lower urinary tract: basis for current and future treatments of urinary incontinence. Pharmacological reviews. 56, 581-631 (2004).
- D’Agostino, G., Condino, A. M., Gallinari, P., Franceschetti, G. P., Tonini, M. Characterization of prejunctional serotonin receptors modulating [3H]acetylcholine release in the human detrusor. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 316, 129-135 (2006).
- Hawthorn, M. H., Chapple, C. R., Cock, M., Chess-Williams, R. Urothelium-derived inhibitory factor(s) influences on detrusor muscle contractility in vitro. British journal of pharmacology. 129, 416-419 (2000).
- Chaiyaprasithi, B., Mang, C. F., Kilbinger, H., Hohenfellner, M. Inhibition of human detrusor contraction by a urothelium derived factor. J Urol. 170, 1897-1900 (2003).
- Testa, R., et al. Effect of different 5-hydroxytryptamine receptor subtype antagonists on the micturition reflex in rats. BJU international. 87, 256-264 (2001).
- Craggs, M. D., Rushton, D. N., Stephenson, J. D. A putative non-cholinergic mechanism in urinary bladders of New but not Old World primates. J Urol. 136, 1348-1350 (1986).
- Fry, C. H., Bayliss, M., Young, J. S., Hussain, M. Influence of age and bladder dysfunction on the contractile properties of isolated human detrusor smooth muscle. BJU international. 108, 91-96 (2011).
- Kennedy, C., Tasker, P. N., Gallacher, G., Westfall, T. D. Identification of atropine- and P2X1 receptor antagonist-resistant, neurogenic contractions of the urinary bladder. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 845-851 (2007).
- Levin, R. M., Danek, M., Whitbeck, C., Haugaard, N. Effect of ethanol on the response of the rat urinary bladder to in vitro ischemia: protective effect of alpha-lipoic acid. Molecular and cellular biochemistry. 271, 133-138 (2005).
- Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: Involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American journal of physiology. Cell physiology. 306, 45-58 (2013).
- Longhurst, P. A., Briscoe, J. A., Rosenberg, D. J., Leggett, R. E. The role of cyclic nucleotides in guinea-pig bladder contractility. British journal of pharmacology. 121, 1665-1672 (1997).
- Takahashi, R., Yunoki, T., Naito, S., Yoshimura, N. Differential effects of botulinum neurotoxin A on bladder contractile responses to activation of efferent nerves, smooth muscles and afferent nerves in rats. J Urol. 188, 1993-1999 (2012).
- Sadananda, P., Chess-Williams, R., Burcher, E. Contractile properties of the pig bladder mucosa in response to neurokinin A: a role for myofibroblasts. British journal of pharmacology. 153, 1465-1473 (2008).
- Liu, G., Daneshgari, F. Alterations in neurogenically mediated contractile responses of urinary bladder in rats with diabetes. American journal of physiology. Renal physiology. 288, 1220-1226 (2005).
