Summary
Эта рукопись представляет собой простой, но мощный, в методе экстракорпорального для оценки гладкую сократимость мышц в ответ на фармакологические препараты или стимуляции нерва. Основные области применения скрининг лекарств и понимание ткани физиология, фармакология, и патология.
Abstract
Мы описываем метод в пробирке для измерения пузыря гладкую сократимость мышц, и его использование для исследования физиологических и фармакологических свойств гладких мышц, а также изменения, вызванные патологией. Этот метод обеспечивает критически важную информацию для понимания функции мочевого пузыря, преодолевая основные методологические трудности, возникающие в в естественных условиях экспериментов, например, хирургических и фармакологических манипуляций, которые влияют на стабильность и выживание препаратов, использование человеческих тканей и / или использования дорогих химических веществ. Он также предоставляет возможность исследовать свойства каждого компонента мочевого пузыря (т.е. гладкой мускулатуры, слизистой оболочки, нервы) у здоровых и патологических состояний.
Мочевой пузырь удаляется из анестезированных животных, помещали в раствор Кребса и разрезали на полоски. Полоски помещают в камеру, заполненную теплой раствором Кребса. Один конец прикреплен к изометрической Tensioн датчика для измерения силы сжатия, а другой конец прикреплен к неподвижной штанги. Ткань стимулируют путем прямого добавления соединений в баню или путем электрической стимуляции электродов полевых, которые активируют нервы, похожие на срабатывание сокращения мочевого пузыря в естественных условиях. Мы демонстрируем использование этого метода для оценки спонтанной сократительной гладких мышц в процессе разработки и после экспериментального повреждения спинного мозга, природа синапсах (передатчиков и рецепторов, участвующих), факторы, влияющие на модуляции активности гладких мышц, роль отдельных компонентов мочевого пузыря, и виды и различия органов в ответ на фармакологические препараты. Кроме того, он может быть использован для исследования внутриклеточных путей, участвующих в сжатии и / или релаксации гладкой мышцы, наркотиков отношений структура-активность и оценки выпуска передатчика.
Гладкая метод мышцы сократимость в пробирке была широко FO используетсяг в течение 50 лет, и предоставил данные, которые внесли значительный вклад в наше понимание функции мочевого пузыря, а также фармацевтической разработке соединений в настоящее время используются клинически для управления мочевого пузыря.
Introduction
Мочевой пузырь гладкая мышца расслабляется, чтобы позволить хранение мочи, и контракты, чтобы выявить ликвидации мочи. Релаксация опосредуется внутренними гладкими свойствами мышечных и тоник выпуска норадреналина (NE) от симпатических нервов, который активирует бета адренорецепторов (β 3 AR в человека) в детрузора. Аннулирование достигается путем ингибирования симпатической вход и активации парасимпатических нервов, которые высвобождают АЧ / ATP заключить контракт гладких мышц мочевого пузыря 1. Многочисленные патологические состояния, в том числе головного мозга и / или спинного мозга, нейродегенеративных заболеваний, диабета, инфравезикальной обструкции или интерстициального цистита, может глубоко изменить функцию мочевого пузыря, с тяжелыми последствиями для качества пациента жизни 2. Эти условия изменяют сократительную способность гладкой мускулатуры путем воздействия одного или более компонентов мочевого пузыря: гладкие мышцы, афферентным или эфферентные нервы и / илиСлизистая оболочка.
Несколько в естественных условиях и в методах пробирке для изучения функции мочевого пузыря были разработаны. В естественных условиях, цистометрия является основным измерение функции мочевого пузыря. Хотя это нетронутыми подготовка, которая позволяет собирать информацию под близко к физиологическим условиям, существует ряд обстоятельств, при которых использование полос гладкой мускулатуры является предпочтительным. К ним относятся ситуации, когда хирургическое и / или фармакологические манипуляции повлияли бы выживание и стабильность препарата в естественных условиях, или когда исследования требуют использования ткани человека или дорогих химических веществ. Этот метод также облегчает экспертизу воздействия наркотиков, возраста и патологии на каждого компонента пузыря, т.е. гладкие мышцы, слизистую оболочку, афферентные и эфферентные нервы.
Мочевого пузыря полосы были использованы на протяжении многих лет многими группами, чтобы ответить на ряд научных вопросов. Они были использованы для выхода в открытый космосизменения luate в миогенной спонтанной активности индуцируется патологии. Эта деятельность, как полагают, в значительной степени актуализирует и частотных симптомов гиперактивного мочевого пузыря (OAB), и, следовательно, является мишенью для лекарств, которые разрабатываются для автономной адресной книги 3-9. Мочевого пузыря полосы были также использованы для расследования миогенные и нейронные факторы, которые модулируют тонус гладких мышц с целью обнаружения ионных каналов и / или рецепторы и / или внутриклеточные пути, которые могли бы быть нацелены, чтобы побудить либо расслабление или сокращение гладкой мускулатуры 3,10- 13. Другие исследования были сосредоточены на природе нервного, в том числе передатчиков и рецепторов, вовлеченных и изменений, вызванных патологией 14,15. Кроме того, этот метод был использован для сравнения между тканей из различных видов 16- 18, между органами 19-21, и оценки структуры-активности препарата отношений 22-24. Расширение этого метода был использован для измерения дэлектронной эффект препаратов на секрецию медиатора из эфферентных нервов 25. Кроме того, различные ткани (мочевой пузырь, мочеиспускательный канал, желудочно-кишечный тракт, ЖКТ) собирают из животных или человека (из операций или органа-донора ткани, одобренных для исследования) и из различных моделях животных, включая повреждением спинного мозга (SCI), инфравезикальной обструкции (BOO), или интерстициальный цистит (IC) могут быть исследованы с помощью этой техники.
В этой статье мы иллюстрируют использование этого метода наряду с необходимыми экспериментальных протоколов, для решения несколько научных вопросов, упомянутых выше.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, описанные здесь, одобрены комиссией IACUC в Университете Питтсбурга.
1. Решения
- Приготовьте раствор Кребса в соответствии с рецептом. Состав в мм: NaCl 118, KCl 4,7, CaCl 2 1,9, MgSO 4 1,2, NaHCO 3 24,9, KH 2 PO 4 1,2, декстроза 11,7.
- Аэрируйте Кребса с 95% О 2, 5% СО 2 и поместите его в 37 ° С водяной бане, чтобы использовать в течение всего эксперимента. Поместите сторону ~ 200 мл газированной раствором Кребса при комнатной температуре, чтобы быть использованы для рассечения тканей.
- Измерьте рН (~ 7,4) и осмолярность (~ 300 мОсм) из ячеистого Кребса.
2 Экспериментальная установка (Схема 1А)
- Заполните газобетон (95% O 2, 5% CO 2) камеры с 10 мл Кребс.
- Запустите циркуляционный водяной насос для нагрева камеры до 37 ° С; включите необходимым оборудованием: усилитель (ы), стимулятор (с) и записи программного обеспечения.
- Калибровка датчиков с 1 г веса.
3 Tissue (Рисунок 1В)
Снимите пузырь от взрослых наивно женской Спрэг Dawley крыс (200-250 г; ~ 10-12 недель), выполнив следующие действия:
- Подготовьте область рассечение и необходимые инструменты: электрические бритвы, щипцы с зубами, лезвие скальпеля, рассекает ножницы, microscissors, две острый пинцет (авторы предпочитают Дюмон щипцы # 3), тканевые зажимы (или шелковой нити), в Sylgard покрытием рассечение блюдо с Кребс и штифты рассечения тканей.
- Обезболить животное с изофлуран ингаляции (4% в O 2) в индукционной камере. Используйте ветеринарную мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом. Постоянно следить за уровнем анестезии при наблюдении частоту дыхания, реакцию на внешние раздражители, и потеря задней конечности выйти рефлекс.
- Когда животное находится под наркозом бритье нижней части животаРи. Expose тазовых органов через срединный разрез брюшной стенки. Определите мочевого пузыря и уретры. Снимите пузырь за счет сокращения шейки мочевого пузыря, близкой к проксимального мочеиспускательного канала. Поместите ткань непосредственно в чашке, покрытой Sylgard, заполненной раствором Кребса аэрированной.
- При необходимости удалить дополнительный ткань в это время: уретру, части желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и / или простаты и т.д.
- Жертвоприношение животного, используя IACUC утвержденных методов (например, цистит передозировки или CO 2 удушья с последующим вторичным методом).
- Вставьте ткани рассекает флажки через купольных мочевого пузыря, шеи, и мочеточников, для стабилизации ткани для дальнейшего вскрытия. Не растягивайте ткань. Удалить жир, соединительная ткань, ближний уретры и мочеточников при их наличии.
- Открытый мочевой пузырь от основания к куполу, чтобы создать плоский лист, серозной стороной вниз / просвета стороной вверх (Фигура 1В). Поместите рассекает флажки на каждом углу ткани. Удалить DOM мочевого пузыряе и ткани шеи.
- Если цель эксперимента состоит в определении вклада слизистой (уротелий и собственной пластинки - увидеть схему рис 1С) к сокращения гладких мышц, сравнение свойств детрузора полос с и без слизистой прилагается. Для этого, до резки ткани полосами, тщательно удалить слой слизистой оболочки с помощью диафрагмы весной ножницы и тонкий пинцет под микроскопом рассекает. В конце эксперимента, устранить полоски для H & E окрашивания, чтобы подтвердить полное удаление слизистой оболочки. Следует отметить, что эта процедура проще в мочевой пузырь мыши, чем в мочевой пузырь крыс.
- Отрежьте ткань по длине от основания до купола на полоски ~ 2 х 8 мм (Рисунок 1В). Tie или прикрепить клип тканей к обоим концам каждой полоски.
Примечание: по одной крысе мочевого пузыря, как правило, может быть разрезан на полоски 4, но количество полос может увеличиваться или уменьшаться в зависимости от размера животного / мочевого пузыря. - Перенесите полоски в EXPERментальные камеры. Подключите один конец каждой полоски к датчиком силы, который измеряет сокращение тканей, а другой с фиксированным стекло / металлический стержень.
Примечание: Ткань камеры различаются по размеру (0,2 мл до 20 мл и более). Типичные камеры для грызунов пузырей являются 5-20 мл, которые обеспечивают достаточную высоту для полосы, чтобы быть полностью погружен в раствор. Некоторые камеры поставляются со встроенными в стимуляции электродов, а не другие. Следует проявлять осторожность, чтобы гарантировать, что все соединения электродов находятся в хорошем состоянии, в противном случае электростимуляция поле не является надежным. - Применение определенное количество силы, чтобы каждой полосе, осторожно растягивая ткань до тех пор, базовый напряжение не достигнет 1 г (~ 10 млн). Изначально ткань имеет тенденцию расслабиться, который записывается в виде уменьшения базовой напряженности. Вымойте ткань примерно каждые 15 мин с помощью теплой газированной Кребса и настроить базовый натяжение 1 г после каждого мытья. Разрешить ткани для уравновешивания в течение ~ 1-2 ч или до базовой напряжение устойчиво (т.е. не далее релаксации ткани).
- Тест ткани жизнеспособность путем добавления KCl (80 мМ) непосредственно в бане в течение ~ 5 мин, или до тех пор ответа плато достигается. Ответы на высоких концентраций KCl также может быть повторена в ходе эксперимента или в конце эксперимента и использовали для нормализации ответов на другими лекарственными средствами или между полосами (см нормализации в соответствии с разделом анализа данных).
- Wash ткани несколько раз (3-5x) с теплой газированной Кребс, чтобы ткань, чтобы вернуться к предварительной обработки условия.
4 Стимуляция Протоколы
- Чтобы исследовать эффекты патологии на спонтанной миогенной деятельности или тонус гладких мышц, использовать гладкие полосы мышцы от различных животных моделях, таких как SCI, BOO, или новорожденных. Рисунок 2 иллюстрирует применение этого метода для исследования изменений в мочевого пузыря спонтанной активности в процессе разработки и после ТСМ. Кроме того, фармакологические агенты могут быть использованы для модуляции Spontaneous деятельность. Рисунок 3 иллюстрирует влияние канала модуляторов KCNQ, флупиртина и XE991, на спонтанной активности и тонуса гладких мышц.
- Для фармакологических стимуляция мышц построить кривые гладких реагирования концентрация путем добавления соединений из концентрированных растворов непосредственно в бане при определенных временных интервалах. Употребления наркотиков и автомобиль в параллельных полос для учета транспортных средств и временных эффектов.
- Сделать растворы желаемых испытуемых соединений на 1000x окончательный рабочий концентрации. Для карбахола (ЦХ), мускариновых агонистов рецепторов, подготовить следующие акции: 10 -5 М, 3 х 10 -5 М, 10 -4 М, 3 х 10 -4 М, 10 -3 М, 3 х 10 -3 М , 10 -2 М. Конечные концентрации в ванне 10 -8 М до 10 -5 М (Цифры 4C, D). Для нейромедин B (НМБ), в бомбезин рецепторов подтипа 1 агониста, подготовить следующие акции: 10 -8 М, 10 -7М, 10 -6 М, 10 -5 М, 10 -4 М, 10 -3 М и конечные концентрации в ванне, 10 -11 М до 10 -6 М. Оба CCh и НМБ ожидается увеличение тканей сократимость.
- Для ткани бане 10 мл, добавляют 10 мкл каждого раствора CCH, как только отклик достигает плато (фиг.4С, D). В параллельных полос добавить равное количество автомобиля (воды). Аналогичным образом добавьте 10 мкл каждого нейромедин B раствора каждый ~ 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте возбуждающее действие на НМБ и ЦХ на тонус гладких мышц полосами из разных видов на рисунке 4. - Исследовать релаксационные свойства гладких мышц в предварительно контракт ткани с возбуждающим агентом, обычно ЦХ или KCl.
- Чтобы заблокировать агониста, предварительной обработки ткани в течение 10-20 мин с антагонистом, чтобы позволить проникновения их в ткани, до агонистом стимуляции.
- Для нейронных стимавляет из гладкой мускулатуры, которая также называется электрическая стимуляция поле (EFS) выполните шаги с 1 до 3,13 и продолжают, как описано ниже. EFS предназначен для избирательного включения нервы против гладкой мускулатуры. Параметры для стимуляции должны быть тщательно подобраны, чтобы избежать прямой стимуляции гладких мышц.
- Установите параметры стимуляции: тип стимула (одиночные импульсы или поезда), продолжительность (длительность импульса и длительности поезд), частоты и интенсивности, как описано в шагах ниже и показанном на фиг.5А, B.
- Для одиночного раздражения импульсов, длительность импульса множеств, интервал между стимулом и числа стимулов желаемых. Обычные параметры продолжительность стимуляции одиночные импульсы 0,05-0,3 мсек, произнесенной в требуемые интервалы (Рисунок 5А). Следуйте шаг 4.3.1.4 для интенсивности стимула.
- Для железнодорожного стимуляции, установить продолжительность поезд и среди интервал поезд. Типичные значения для ткани мочевого пузыря являются 3-10 сек доставлены по меньшей мере, 1 мв друг от друга (5В). Если ткань усталость происходит (т.е. EFS схватки уменьшится в период управления), увеличить среди интервал поезд.
- Установите частоту поездов раздражителей (количество импульсов в поезде - 5В). Запуск частотной характеристики в диапазоне от 0,5-50 Гц. Типичные частоты для мочевого пузыря являются 10-20 Гц, которые дают воспроизводимые и устойчивые сокращения, опосредованных АТФ и АХ. Соблюдайте зависимые от частоты ответов на EFS стимуляции в полос мыши пузыря на рисунке 5, демонстрирующие, как этот метод может быть использован для оценки вклада холинергических и пуринергическими механизмов в синапсах.
- Установите интенсивность стимула: систематически увеличивать интенсивность (напряжение) стимула, пока амплитуда сокращения не достигает плато (при использовании поезда поддержания постоянной частоты).
- Установите интенсивность стимула в зависимости отЦелью эксперимента. Если цель заключается в увеличении нервную-вызывали схватки, а затем использовать субмаксимальную интенсивность так, чтобы амплитуда сокращения является ~ 50% от максимального сокращения. Если целью является снизить нервную-вызывали схватки, затем установить интенсивность до ~ 80% максимальной амплитуды, чтобы избежать тканей усталость.
- После того, как параметры стимуляции (продолжительность, частота и интенсивность) устанавливаются, позволяют ~ 20-30 мин для EFS- вызывали схватки стабилизироваться до того, тестирование на наркотики.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки селективности EFS для нервной передачи, блок нейронной передачи с антагонистом Na +, тетродотоксин (ТТХ; 0,5-1 мкм). Выполните этот шаг в начале эксперимента, как ТТХ смывает относительно легко. Кроме того, выполнение этого в конце эксперимента (этап 4.3.5. Ниже). - Подготовьте растворы на 1,000x окончательные рабочие концентрации для: альфа, бета-метилен АТФ (ABMA; на пуринергической активатор рецептораи десенсибилизатора) 10 -2 М, атропин (антагонист мускариновых рецепторов,) 10 -3 М (5С). Соблюдайте другие примеры на рисунке 6. Агонист 5НТ4 рецепторов, цизаприд (3 х 10 -6 М, 10 -6 М, 3 х 10 -5 М, 10 -5 м, 3 х 10 -4 М, 10 -4 М, 3 х 10 -3 М, 10 -3 М), увеличивает тканей сократимость и SB-203186 (3 х 10 -3 м), антагонист рецептора 5НТ4, изменяет эффекты Cisapride в.
- Чтобы проверить эффекты ABMA и атропин на EFS (5С), выполняют две частотные характеристики управления. Добавить 10 мкл 10 М -2 ABMA в ванну для конечной концентрации 10 мкМ. Это будет сокращаться ткани за счет прямой стимуляции пуринергическими рецепторов в гладких мышцах. После возвращения реагирования на базовой линии, повторите частотные характеристики. Добавить 10 мкл 10 -3 М атропина для окончательного Концентратионная 1 мкм. После ~ 10 мин (необходимого для атропина блокировать мускариновые рецепторы), частотных характеристик повторных. В параллельных полос добавить 10 мкл транспортного средства, воды, на каждом шаге.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для других примеров в рисунке 6, добавить 10 мкл каждого цизаприд раствора через определенные промежутки времени (~ каждые 15 мин; см обсуждение), затем 10 мкл SB-203186 раствора непосредственно в ванну и контролировать их влияние на EFS-индуцированной сокращение. В параллельных полос добавить 10 мкл автомобиля, ДМСО. Соблюдайте эффекты цисаприда, агонист 5НТ4 рецепторов, на EFS, вызвали сокращений в мочевом пузыре человека и подвздошной кишки тканей в рисунке 6. Кроме того, наблюдать эффект ДМСО, автомобиль для цисаприда, на EFS-вызванные сокращениями в мочевом пузыре человека и подвздошной кишки тканей . - В конце протокола EFS проверить селективность EFS, блокируя передачу нервного с антагонистом Na +, тетродотоксин (ТТХ; 0,5-1 &# 181; М). Если ТТХ устойчивые сокращения по-прежнему присутствуют, рекомендуется настроить длительность и интенсивность стимула в последующих экспериментах.
- Установите параметры стимуляции: тип стимула (одиночные импульсы или поезда), продолжительность (длительность импульса и длительности поезд), частоты и интенсивности, как описано в шагах ниже и показанном на фиг.5А, B.
- Для определения эффектов препаратов на заранее или постсинаптических сайтов (7А) выполните шаги с 1 по 4.3.2. Создание воспроизводимых ответов на карбахол и EFS, затем добавить наркотиков X.
- В конце эксперимента, отсоедините или развязать полоски, промокните их аккуратно на листке папиросной бумаги, чтобы устранить лишнюю жидкость и измеряют вес каждой полосе, используя баланс. Также измеряют длину ткани с использованием измерителя определить площадь поперечного сечения. Эта информация используется для нормализации данных (см раздел 5.4).
Анализ 5. данных
Анализ данных с помощью адекватного программного обеспечения (например, Windaq, LabChart).
- Для спонтанной активности, выбрать окно, по меньшей мере 30 сек до и на пике ответа вызванного наркотиками и меняAsure амплитуда и частота миогенной деятельности (Рисунок 3).
- Используйте быстрый анализ преобразование Фурье для определения спектра частот, способствующих сократительной ответов и имеются ли различия между различными частями мочевого пузыря (например, купол против шее) или с развитием, патологии и наркотиков 8.
- Для воздействия на тонус гладких мышц выбрать окно, по крайней мере 10-30 сек до и на пике реакции наркотиков индуцированных и измерить амплитуду сокращений.
- Для воздействия на нервную, вызвали сокращений измерить амплитуду, продолжительность и площадь под кривой сокращений (по крайней мере, 3) до и на пике реакции наркотиков индуцированных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо измерить и амплитуды и площади под кривой EFS-индуцированных сокращений потому пуринергической и холинергические компоненты имеют различные кинетики. Пуринергической компонент быстро и переходных (АТФ активирует purinergiС ионотропные каналы, такие как P2X1, которые позволяют быстрый приток кальция, то они уменьшают чувствительность), что способствует более в ответ пик амплитуды и менее к площади под кривой. Холинергическая компонент медленнее и устойчивый (АЧ активизирует метаботропные мускариновые рецепторы, которые требуют больше времени, чтобы активировать внутриклеточные пути, что в конечном счете активируют ионные каналы, которые деполяризовать гладкие мышцы, чтобы вызвать сокращение). Таким образом, компонент мускариновых захватывается лучше, путем измерения площади под кривой. - Нормализовать данные, чтобы иметь возможность сравнить результаты по полосками и фармакологических методов лечения. Параметр выбран для нормализации не должна зависеть от испытываемых соединений, патологическое состояние изучали или опытно-конструкторских. Среди этих параметров, использование полосы веса, площади поперечного сечения, ответов KCl (фиг.4В),% от максимального ответа (фиг.7В) или% от максимального ответа на другой сократительной агента(Например, CCh) или расслабляющие средства (например, папаверин).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Спонтанное Миогенный активности
Спонтанное миогенной деятельность является важным гладкая характеристика мышца, которая претерпевает изменения с постнатального развития 6-9 и патологии (например, SCI, BOO) 3-5. Потому что эта деятельность, как полагают, способствуют симптомов гиперактивного мочевого пузыря (OAB) 2, оценка рецепторов, внутриклеточных путей и фармакологических агентов, которые модулируют его, представляет большой интерес для разработки эффективных методов лечения автономной адресной книги и других нарушений гладкой мускулатуры. Метод, представленный здесь может легко исследовать эти вопросы Рисунок 2 иллюстрирует различные образцы миогенной спонтанной активности в процессе разработки в неонатальном (I), несовершеннолетних (II) для взрослых (III) и повреждением спинного мозга крысы. (SCI; IV). Полосы из новорожденных крыс демонстрируют большую амплитуду, низкочастотные ритмические сокращения (Рисунок 2AI), в то время как полосы из взрослых крысс выставлять малую амплитуду, высокую частоту деятельность (Рисунок 2aii, III). После ТСМ новорожденных картина вновь возникает (Рисунок 2Aiv). В дополнение к использованию полосы из животных моделей, различные фармакологические агенты могут быть использованы, чтобы вызвать спонтанные сокращения в виде полос из наивных животных, с целью понимание механизмов, лежащих в основе спонтанных сокращений. Примеры подходящих фармакологических агентов включают агонисты мускариновых рецепторов (Carbachol; ЦХ)., Соединения, которые увеличивают уровень ACh (например, ингибиторы ацетилхолинэстеразы), низкие концентрации KCl (например, 20 мм) или других экспериментальных препаратов Фигуры 3A-B, иллюстрируют модуляции спонтанной активности с помощью фармакологических агентов, которые действуют на KCNQ каналов, расположенных на гладкие мышцы. Канал нож KCNQ, флупиртин, уменьшает амплитуду и частоту спонтанной активности в зависимости от концентрации (Рисунок 3AI-III), в то время какKCNQ канала блокатор, XE991, уменьшает амплитуду, но увеличивает частоту спонтанной активности (Рисунок 3Bi-III).
Гладкая мышечный тонус
Свойства Гладкая мышечного тонуса и сократительной являются важными факторами для правильного функционирования мочевого пузыря во время хранения и мочеиспускания. Этот метод может легко экранировать действие фармакологических агентов на тонус гладких мышц. Рисунки 3Aiv и 3Biv показывают, что флупиртин уменьшается базальный тонус, в соответствии с релаксации гладкой мускулатуры, в то время как XE991 увеличивается гладкой мышечного тонуса. Рисунок 4 иллюстрирует зависимости от концентрации увеличение тонуса гладких мышц путем активации рецепторов бомбезина с нейромедин B (NMB; фиг.4А, В) или мускариновые рецепторы с карбахола (CCH; Фигуры 4C, D). Кроме того, внутриклеточные пути посреднические эти гладкие ответов мышц могут быть исследованы Uпеть конкретные модуляторов (данные не показаны).
ЦНС-опосредованные Ответы и модуляция нейротрансмиссию
Сокращение мочевого пузыря достигается выпуском АХ / АТФ из парасимпатических эфферентных нервов. Вклад мускариновых и пуринергическими систем для сокращения мочевого пузыря колеблется у разных видов и патологических состояний, с преимущественным увеличением пуринергической вклад в патологий, таких как интерстициальный цистит, частичной обструкции, и гиперактивного мочевого пузыря 26. 5С демонстрирует использование этого метода для определения Вклад мускариновых и пуринергическими компонентов нейропередачи мочевого пузыря полос от мыши. Вклад холинергической компонента оценивали с помощью антагонист мускариновых рецепторов,, атропин. Вклад пуринергической системы оценивали с помощью пуринергической активатор рецептора и десенсибилизатора, альфа, бета-метилен АТП (ABMA). Кроме того, зависит от частоты вклад каждого компонента оценивалась путем изменения частоты стимуляции от низкой к высоким частотам (2-50 Гц).
Сила сжатия мочевого пузыря играет важную роль в мочеиспускания эффективно. Используя этот метод, рецепторы и пути, которые модулируют нейронной передачи могут быть исследованы как лекарственных препаратов для мочеиспускания дисфункции. В рецепторы 5НТ4 выражены предварительно junctionally в парасимпатических нейронов и их активация повышает уровень ACh 27. Рисунок 6 иллюстрирует возбуждающее действие агониста рецептора 5НТ4, цизаприд, в мочевом пузыре и подвздошной кишки человека полос.
Различные экспериментальные протоколы могут быть использованы для определения места действия испытуемого соединения. Диаграмма на рисунке 7А иллюстрирует протокол, используемый для оценки PRE- против пост-функциональные участки. Если препарат X уменьшает (или увеличивается) ответ EFS, но не имеет эффект на ответ ККЗ, скорее всего, местом действия является пресинаптические. Если препарат X изменяет как EFS и CCh ответа, то он может действовать на рецепторы, расположенные после junctionally или как до, так и после junctionally.
Роль каждого компонента: гладких мышц, слизистой оболочки, и нейронов
Различные патологические состояния могут влиять на различные компоненты в мочевой пузырь. Например интерстициальный цистит (IC) влияет, прежде всего, уротелий, в то время как автономной адресной книги может привести к измененной сократимости гладких мышц. Кроме того, различные рецепторы могут быть выражены в каждом компоненте мочевого пузыря и, таким образом, могут быть специально направлена в определенном патологии. В отличие от естественных условиях методов в, которые измеряют чистую влияние всех компонентов мочевого пузыря, этот метод в пробирке позволяет исследовать отдельных компонентов с помощью комбинации хирургических и фармакологических. Чтобы проверить гладких мышц сжатия / релаксации в отсутствие нейроновпередачи, ТТХ (0,5-1 мкМ) может быть добавлен в ванну. На рисунке 4, и NMB ЦХ были испытаны в присутствии ТТХ. Чтобы проверить вклад в слизистой оболочке (уротелии и собственной пластинки) в сократимости гладких мышц, полосы с и без слоя слизистой оболочки сравниваются. 7В показывает, что в ответ на ЦХ уменьшается в присутствии слизистой оболочки свиньи в 28. Аналогичные результаты были получены в человека полос пузыря 29. Чтобы проверить роль нервных волокон, несколько подходов могут быть приняты. Одним из них является, чтобы активировать или ингибировать определенные волокна с помощью фармакологических агентов. Например, капсаицин активирует особый население афферентных нервов и вызывает видов, зависящих сокращение гладких мышц или релаксации 17,18. Гуанетидин ингибирует высвобождение норадреналина из симпатических волокон, тем самым устраняя вклад этих волокон. Другой подход заключается в десенсибилизировать / исключить конкретные волокна в естественных условияхдо эксперимента. Например, системное лечение животного с капсаицин уменьшает чувствительность капсаицин чувствительных афферентных нервов. Другие компоненты пузыря, которые могут быть изучены в данном препарате являются интерстициальные клетки или щелевые контакты по активации или блокирования их с конкретными агентами.
Видовые различия
Хотя большинство разработка Препарат предназначен для лечения заболеваний у человека и фундаментальных исследований, прежде всего, выполняется в ткани животного. Существуют Видовые различия в ряде рецепторов. Например, агонисты 5НТ4 рецепторов повышения нервную, вызвали сокращение в мочевом пузыре человека, но не в мочевой пузырь крыс 19,30, EFS-индуцированной схватки почти исключительно атропин чувствительных в человеческой и старого мира обезьяны детрузора от стабильных пузырей 31, но стать частично атропин устойчивостью в человеческой детрузора у пациентов с нестабильными условиями мочевого пузыря (например, нейрогенного, obstructeд пузыри) 15,32,33, капсаицин вызывает возбуждающий ответ в крысиных и мочевого пузыря человека полос, ни ответ в свинью мочевого пузыря полос и ингибиторной ответ в морской свинки мочевого пузыря полос 17,18. 4 видно, что бомбезин агонисты имеют возбуждающие эффекты на крыса мочевого пузыря и не воздействие на мышей и свиней мочевого пузыря полос 16. Эта информация имеет решающее значение для выбора соответствующего животную модель для изучения специфический рецептор.
Сравнение чувствительности через органов
Препараты, предназначенные для лечения нарушений мочевого пузыря может также влиять на гладкие мышцы от других органов, таких как желудочно-кишечного тракта, мочеиспускательного канала, желчного пузыря и т.д. Этот метод позволяет оценить органов селективностью и чувствительностью к фармакологическим агентом путем сравнения различных тканей бок о бок. Как показано на рисунке 6, агониста 5НТ4, цизаприда, уже отличаютсяЛОР эффективность и потенции в мочевом пузыре человека против подвздошной ткани.
Рис.1 Экспериментальная установка и полосы мочевого пузыря подготовка.) Схема экспериментальной установки. Мочевого пузыря полоски погружают в ткани камер, заполненных ячеистого раствором Кребса выдерживали при 37 ° C с помощью водяного насоса, циркулирующего. Один конец полосы прикреплена к датчику изометрического силы для измерения тканей сократимость, а другой с фиксированным стержнем. Преобразователь силы соединен с усилителем и компьютер для записи данных. Стимуляции электроды электрического поля, подключенные к стимулятора помещают в камеру и используется для вызывая ЦНС-опосредованные сокращений мочевого пузыря. Б) Получение тканей полос. Мочевой пузырь придавленный в блюдо и следующие процедуры выполняются: # 1 вертикальный разрез гоух вентральной половины мочевого пузыря из уретры на купол, чтобы открыть мочевой пузырь в плоский лист. # 2 горизонтальные разрезы удаление купол и основание мочевого пузыря / проксимального мочеиспускательного канала. . # 3 вертикальные разрезы, делящие середине пузырь на равные полоски (4 полосы от крыс мочевого пузыря) C) Схема компонентов полосы: гладкие мышцы и слизистая оболочка, оба содержат афферентные (синий) и эфферентные (зеленый) нервы. Слизистая оболочка состоит из уротелием и собственной пластинки. Собственная пластинка содержит кровеносные сосуды [1], интерстициальные клетки [2], и мышечной слизистой [3]. Пунктирная линия, помеченная # 2b показывает процедуру для удаления слизистой слой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. миогенных спонтанной активности в процессе разработки и послепатология.) Примеры спонтанной активности в неонатальном (I), в отношении несовершеннолетних (II), спинного нетронутыми взрослых (III) и повреждением спинного мозга (SCI) для взрослых (IV) полоски крыс мочевого пузыря. SCI крысу использовали в течение 4 недель после операции. B, C) Резюме амплитуды (В) и частот (С) спонтанных сокращений в четырех группах исследуемых. (Воспроизводится с разрешения Artim DE, Кульман FA, Догерти SL, Bupp Е, Эдвардс CL, де Крупы туалетом Neurourol Urodyn 2011 Ноя; 30 (8):.. 1666-74.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого фигура.
Рисунок 3 Модуляция миогенной спонтанной активности и тонуса гладких мышц.) Эффект канала нож KCNQ, flupirtine, на спонтанной активности и базового тона у взрослых полос крыса мочевого пузыря. (Я) Флюпиртин был добавлен в возрастающих концентрациях (нарастающим итогом) во времена, обозначенных стрелками. Расширения под трассировки шоу 4 мин полосы деятельности в течение контроля и после применения 10 мкм и 50 мкм флупиртина. (II-IV) Краткое описание эффектов флюпиртина (7 полоски из 4 крыс) от амплитуды (II) и частоту (III) спонтанной активности и базового тона (IV), выраженное в% от изменения управления (предварительно наркотиков) значений , которые были установлены на 100%. B) Эффект от канала блокатор KCNQ, XE991, на спонтанной активности и базового тона у взрослых полос крыса мочевого пузыря. (Я) XE991 был добавлен в возрастающих концентрациях (нарастающим итогом) во времена, обозначенных стрелками. Расширения под следа показать 2 мин от полосы деятельности при контроле и после применения 10 мкм и 50 мкм XE991. (II-IV) Резюме последствий XE991 (9 полосы из 4 крыс) наАмплитуда (II) и частота (III) спонтанной активности и базового тона (IV), выраженные в% изменения от управления (предварительно наркотиков) значений, которые были установлены до 100%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры .
Рисунок 4 Виды различия.) Зависимым от концентрации сокращений гладкой мускулатуры в ответ на агонист рецептора бомбезина, нейромедина B (NMB), в лентах крыс мочевого пузыря. B) Основная эффектов NMB на гладких мышц в полосах крыс мочевого пузыря. Данные нормированы на KCl (80 мМ) ответ. C, D) Отсутствие ответов на НМБ в мыши (C) и свиньи (D) полос пузыря. Carbachol (ССН) вызывает сильное зависимое от концентрации конТяги в обоих мыши и свиньи полос, что указывает, что полосы может реагировать на раздражители. ТТХ (0,5 мкМ) присутствовал в ванне во всех полос. (Воспроизводится с разрешения Kullmann FA, McKenna D, Wells Г.И., Тор Кб нейропептидов 2013 Октябрь; 47 (5):.. 305-13) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5 Электростимуляция поле.) Схема отдельных параметров импульса стимуляции. Сокращения: D = длительность импульса, я = интенсивность импульса, IPI = между импульса интервал B) Схема параметров поезд стимуляции.. Сокращения: продолжительность тд = поезд, я = интенсивность импульса, ити = среди интервал поезд. На врезке показано количество импульсов в поезде и интервал Между каналEEN их, которые вместе с длительностью железнодорожного определить частоту железнодорожного стимуляции. C) Вклад purinegic и холинергических компонентов ЦНС-вызывал сокращения мочевого пузыря. EFS-FR представляют стимуляции частоты, 2, 5, 10, 20, 50 Гц. Три раздражители, поставляемые каждые 90 секунд были испытаны на каждой частоте, и каждая серия частоты повторяют дважды в контроле и в два раза после добавления каждого соединения. Альфа-, бета-метилен АТФ, сокращенно ABMA (полоса 1), был использован, чтобы уменьшить чувствительность рецепторов пуринергической и атропин (полоса 2) был использован для блокирования мускариновых рецепторов. Газа 3 служили контролем и обрабатывали транспортного средства, воды. Стрелки указывают время, когда каждое соединение добавляли к каждой полосы. Следует отметить, что EFS-вызванных сокращений сильно снижена на ABMA и атропин, а не зависит от транспортного средства. ТТХ был добавлен в конце эксперимента в то время как EFS была доставлена при частоте 20 Гц. Следует отметить, что остальные сокращений, наблюдаемые в контролеполоса 3 были отменены ТТХ, демонстрируя свою нервную природу (то есть по инициативе высвобождения трансмиттера от очной нервов). # Указывает ответов гладких мышц ABMA в отсутствие EFS. Шкала баров являются 5 мин для оси х и 2 г для оси у. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6 Модуляция нервную, вызвали сокращений мочевого пузыря. A, B) Примеры повышения на нервную, вызвали сокращений по агониста 5НТ4 рецепторов, цизаприд в мочевом пузыре человека (A) и подвздошной кишки полос (B). Цизаприд (черные записи) или ДМСО (серые записи) добавляли в зависимости от концентрации в моменты времени, указанные стрелками. Черные полосы ниже записей в каждой панелипредставляют EFS, которая состояла из 10 сек поездов, поставляемых при 20 Гц каждый 120 сек. Вертикальная шкала бары 1 г для всех примеров. Концентрация ТТХ было 0,5 мкМ. CF) Резюме площади под кривой (AUC) из EFS-вызванных сокращений в ответ на цисаприда (черные полосы) или ДМСО (серые столбцы) в мочевом пузыре полос (C, D) и подвздошной кишки полос (E , F). В CF, СО обозначает СО-203 186, что представляет собой краткое изложение данных, полученных после добавления антагониста рецептора 5НТ4. Пунктирные линии устанавливаются на 100% и представляют контроль. (Воспроизводится с разрешения Kullmann FA, Kurihara R, Е. L, Wells Г.И., McKenna Д.Г., Бургард ЕС, Тор KB Auton Neurosci 2013 Jun; 176 (1-2):... 70-7) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное рисунке.
Fiфигура 7. Сайты действием наркотиков и роли различных компонентов мочевого пузыря.) Схема протокола для идентификации места действия препарата. Полосы стимулируют ESF и карбахола (ККЗ). В I наркотиков X уменьшает реакцию EFS, но не ответ CCh, что указывает на пресинаптические месте действия. Во II, препарат X изменяет оба ответов, указывая действие на постсинаптических или оба до и после соединительных рецепторов. B) Влияние слизистой на сокращения гладких мышц. Эффекты карбахола уменьшаются в полосах со слизистой настоящее время (неповрежденную) по сравнению с полосками с слизистой удалены (оголенные). (B воспроизводится с разрешения Боярышник MH, Chapple CR, Cock M, шахматы-Williams R. Br J Pharmacol 2000 Фев; 129 (3):. 416-9). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы описали простой в пробирке гладких мышц методом сократимости, которые могут быть использованы для решения ряда важных научных вопросов, связанных с физиологией мочевого пузыря и патологии, а также пособничество открытие новых препаратов для лечения дисфункций мочевого пузыря. Мы проиллюстрировали использование этого метода для оценки развития, патологические и фармакологические свойства гладких мышц мочевого пузыря сократительной (Рисунки 2-4), нейротрансмиссия модуляции (Цифры 5-7A), видовые различия (Рисунок 4), различия органов (Рисунок 6) и актуальность конкретных компонентов мочевого пузыря (например, слизистая оболочка, 7В). Дополнительные приложения не показаны здесь, включают оценку внутриклеточных путей с использованием фармакологических агентов 3,10,11, структура-активность отношения различных наркотиков 22-24, или оценки / количественного передатчика RELEазы после нервного возбуждения 25.
В то время как функция мочевого пузыря в конечном итоге может быть оценена в естественных условиях, этот метод в пробирке позволяет преодолеть многие ситуации, которые проблематично в естественных условиях. К ним относятся ситуации, когда хирургические и фармакологические манипуляции позволили бы сократить жизнеспособность и / или выживание органа или животного, использование тканей человека, необходимость выявить и охарактеризовать ответы от конкретных компонентов (например, гладких мышц против эпителия против нервов ), или использование дорогих химикатов. Метод позволяет систематическое исследование влияния различных фармакологических средств, а также патологии на сократительную активность гладкой мускулатуры и в хорошо управляемом режиме и окружающей среды.
Способ обеспечивает множество информации; Однако следует соблюдать осторожность при интерпретации и экстраполяции эту информацию. Это метод в пробирке сниженной подготовки, диссоединен с его нормальной окружающей среды и нервной контролем. Экспериментальные условия не физиологическое, таким образом, данные не могут полностью отражать в естественных физиологических условиях. Например, метод не может учитывать изменения в кровотоке, гормонов, гуморального веществ, внешних механических сил, или внешней нервной контроля. Ткань остро децентрализована, таким образом, травмы и ишемия, связанные ответы должны быть оценены и приняты во внимание. Патологические изменения, происходящие в головном мозге или спинном мозге не могут быть проверены с помощью этого метода, если они не уже изменены афферентные, гладкие мышцы, слизистую оболочку или функцию очный нерва (т.е. сотовой пластичности). Электростимуляция поле (EFS) позволяет оценить нервную опосредованных реакций. Тем не менее, это возбуждает разбора все нервы в полосе (например, симпатичная, парасимпатические, афферентов), в отличие от ситуации в естественных условиях, где рефлекс мочеиспускания активирует только особое pathwн я. Одним из способов преодоления этой ситуации является объединение EFS с конкретными противниками, которые избирательно блокируют различные пути. Например, Гуанетидин могут быть использованы, чтобы блокировать высвобождение норадреналина при изучении свойств сжатия, или атропина могут быть использованы, чтобы блокировать мускариновые рецепторы, чтобы предотвратить сокращения мочевого пузыря при изучении свойств релаксации. Наконец, жизнеспособность ткани ограничен определенным количеством часов. В общем, большинство компонентов мочевого пузыря ткани жизнеспособны и стабильными (т.е. отвечает на EFS без ухудшения ответов) в течение 6-8 часов или дольше. Тем не менее, другие ткани могут быть более чувствительны (например, подвздошной кишки длится ~ 6 ч или менее, личный опыт автора).
Хотя метод технически осуществимо и с хорошей воспроизводимостью, есть несколько важных шагов, необходимых для обеспечения его успеха. Во-первых, подготовка ткань должна быть выполнена тщательно, чтобы гарантировать жизнеспособность, сделав необходимые измененияс процедурой вскрытия (во избежание растяжения ткани при подготовке полосы) и / или средств массовой информации, если это необходимо для различных типов тканей и видов. Другим важным шагом является наладка нейронные параметры стимуляции, например, что потолочные эффекты избежать. Как описано в методическом разделе, это зависит от типа эксперимента, выполненного, и ожидается, механизм действия испытуемого соединения. Например, для проверки эффектов цизаприда, агониста 5НТ4 рецепторов, на полосах мочевого пузыря (рисунок 6), мы устанавливаем амплитуду EFS, вызвали сокращение до ~ 50% от максимального. Это было основано на известном механизме действия агонистов 5НТ4 рецепторов, а именно, повышающих его высвобождения от пресинаптические парасимпатических нервов 27, которые, в свою очередь, как ожидается, увеличится EFS-навеянные сокращений. Стимуляция мышц против нервов должны быть проверены с помощью ТТХ, который ингибирует нервную передачу и, таким образом, должно препятствовать EFS-навеянные сокращений. Адекватные управления для автомобиля и Тиме должны быть выполнены в течение тестирования на наркотики для учета ухудшения ткани со временем и для любого возможного воздействия транспортного средства. Например, многие лекарства, растворенного в ДМСО или этаноле. Наши данные (Рисунок 6) показывают, что ДМСО (0,1% и выше) может увеличить нервную, вызвали сокращение, эффект, который нужно вычесть из эффекта испытуемого препарата. Точно так же, этанол (до 1%) уменьшает спонтанные сокращения гладких мышц, но не имеет никакого эффекта на нервную-вызвали сокращений 34,35. При использовании генно-инженерных животных и хирургические модели (например, повреждение спинного мозга или овариэктомии), контроль должен включать ткань от соответствующего штамма фон мыши или ложнооперированных животных, соответственно. Кроме того, некоторые ткани, такие как человека, мыши и морские свинки пузырей содержать очный ганглиев. При работе с этими тканями, выбор протокола и интерпретации данных необходимо учитывать воздействия наркотиков или EFS на очной пеurons что дальнейшее стимулируют гладкую мускулатуру.
Проектирование экспериментальный протокол, выбор правильных параметров (для EFS, для стимуляции наркотиков) и концентрации для тестирования имеют решающее значение для обеспечения значимые данные. В то время как параметры должны быть приспособлены для отдельных тканей и лекарственных средств, общие принципы / руководящие принципы, описанные ниже, применимы. Кривые отклика полезных концентрация желательно, однако это не возможно для всех соединений. Препараты, направленные на рецепторы, которые уменьшают чувствительность, такие как purineric рецепторов ионотропных (Р2Х), или препараты, которые быстро метаболизируются в ткани (например, АХ), не может быть надежно проверена с помощью кривых отклика кумулятивные концентрации в той же ткани. В этих случаях, разовые концентрации испытаны в разных группах ткани. Для оценки десенсибилизации, рекомендуется, чтобы сравнить величину ответ, вызываемый одной самой высокой концентрации, который достигается в конце совокупной концентрациикривая отклика.
Для точного подгонки полученных от кривых реагирования концентрация данных, желательно проверить половиной концентрации журнала (пример ККЗ на рисунке 6). Однако концентрации LOG (пример NMB на фиг.4А) являются приемлемыми, если жизнеспособность ткани может быть ограничена или другие ограничения могут быть на месте.
Для выбора диапазона концентраций для нового соединения, в предварительных экспериментах, полезно рассмотреть сродство связывания соединения и испытания двух сила 10 выше и ниже этой концентрации. В последующих экспериментах, протокол уточняется определить отправную точку, где не наблюдается эффект препарата и конечную точки, где либо ответ не максимальна или концентрация испытания больше не специфичны для намеченной цели.
Временной интервал для нанесения препарата должна быть выбрана с учетом нескольких факторов: а) времени, в течениеПрепарат, чтобы иметь эффект. В общих препаратов, направленных на мембранные рецепторы имеют относительно быструю реакцию (от секунд до минут), в то время как препараты для внутриклеточных мишеней (например, форсколином и других ингибиторов ферментов 36, ботулинический токсин 37) потребуется дополнительное время инкубации (30 мин - 3 ч). Кроме того, толщина ткани могут играть определенную роль. б) Продолжительность и механизм действия препарата. В тех случаях, когда эффект препарата достигает плато, что поддерживается, например, в NMB фиг.4А и цизаприд на фиг.6, временные интервалы 5-15 мин между приложениями наркотиков являются достаточными для сбора достаточного количества данных. Это невозможно с лекарствами, обладающими гораздо меньшую продолжительность действия или другим механизмом действия (АТФ, CCh). Например, эффект ЦХ на фиг.4С или 4D, достигает плато быстро, но ткани натяжения стремится вернуться к исходному уровню. В этом случае временные интервалы должны быть скорректированы в соответствиилы, как правило, добавлением следующего концентрации, когда первый ответ достигает максимума.
Анализ данных, особенно нормализация данных, чтобы позволить сравнение между полосами является очень важным шагом. Различные исследования используют различные параметры для нормализации веса, в том числе полосы 38, полосы площади поперечного сечения 39, 12 KCl ответ,% от максимального ответа 28 или% от максимального ответа на другой сократительной агента (например, CCH 38). Параметр нормализации должен быть выбран в зависимости от целей эксперимента, таким образом, что параметр не зависит от испытываемых соединений, патологии или эксперимента. Например, нормализации, чтобы KCl ответ исключает вес и другие размеры полосок, и, следовательно, может быть использована для сравнения ответов в тканях, где патологическое состояние может увеличить вес полосок (например, сахарный диабет увеличивает массу мочевого пузыря). Кроме того, повторноеответного сообщения, чтобы KCl не зависит от удаления слизистой оболочки / уротелии 29, таким образом, могут быть использованы в экспериментах, оценивающих различные компоненты (например, мочевого пузыря, слизистой оболочки против гладкой мускулатуры).
Таким образом, этот метод сократимость обеспечивает быстрый, легкий и очень мощный подход к оценке мочевой пузырь (или другой орган) физиологии и фармакологии. При правильном использовании, она обеспечивает возможность манипулировать ткани в ограниченной и хорошо контролируемой среде. При изучении функции мочевого пузыря, этот метод способствовал открытию и тестирования соединений, используемых в настоящее время для управления OAB, таких как антимускариновыми и вновь разработанных β 3 АР агонистов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано NIH R37 DK54824 и R01 DK57284 грантов LB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Tissue Bath System with Reservoir | Radnoti, LLC | 159920 | isolated tissue baths |
| Warm water recirculator pump | Kent Scientific Corporation | TPZ-749 | to keep tissue baths to 37 °C |
| Computer | |||
| Data Acquisiton System | DataQ Instruments | DI-710-UH | To view, record and analyze data |
| Transbridge Transducer Amplifier | World Precision Instruments | SYS-TBM4M | Transducer amplifier |
| Grass stimulator | Grass Technologies | Model S88 | Stimulator |
| Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | ACV-1205S | To anesthetesize the animal |
| Anesthetizing Box | Harvard Apparatus | 500116 | To anesthetesize the animal |
| Anesthesia Masks | Kent Scientific Corporation | AC-09508 | To anesthetesize the animal |
| Materials and Surgical Instruments | |||
| Sylgard | Dow Corning Corp | 184 SIL ELAST KIT | To pin, dissect, & cut tissue |
| Petri Dish | Corning | 3160-152 | To dissect/cut tissue |
| Insect Pins | ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins | Size 5 | To pin tissue |
| Bench Pad | VWR International | 56617-014 | Absorbent bench underpads |
| Rat surgical Kit | Kent Scientific Corporation | INSRATKIT | To remove and dissect tissue |
| 2 Dumont #3 Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500064 | To remove and dissect tissue |
| Tissue Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500092 | To remove and dissect tissue |
| Scalpel | Kent Scientific Corporation | INS500236 | To remove and dissect tissue |
| Scalpel blade | Kent Scientific Corporation | INS500239 | To remove and dissect tissue |
| Professional Clipper | Braintree Scientific, Inc. | CLP-223 45 | To remove fur |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Tie tissue |
| Tissue Clips | Radnoti, LLC | 158802 | Attach tissue to rod/transducer |
| 1 g weight | Mettler Toledo | 11119525 | For transducer calibration |
| Chemicals | |||
| Krebs Solution: Sodium chloride Potassium chloride Monobasic potassium phosphate Magnesium sulfate Dextrose Sodium bicarbonate Calcium chloride Magnesium chloride |
Sigma Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma EMD Baker |
S7653 P217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444 |
To prepare Krebs solution |
| Isoflurane | Henry Schein | 029405 | To anesthetesize the animal |
| Oxygen tank | Matheson Tri Gas | ox251 | To use with anesthesia system |
| Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide) | Matheson Tri Gas | Moxn00hn36D | To aerate Krebs solutions |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Andersson, K. E. Detrusor myocyte activity and afferent signaling. Neurourol Urodyn. 29, 97-106 (2010).
- Artim, D. E., et al. Developmental and spinal cord injury-induced changes in nitric oxide-mediated inhibition in rat urinary bladder. Neurourology and urodynamics. 30, 1666-1674 (2011).
- Kita, M., et al. Effects of bladder outlet obstruction on properties of Ca2+-activated K+ channels in rat bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 298, 1310-1319 (2010).
- Barendrecht, M. M., et al. The effect of bladder outlet obstruction on alpha1- and beta-adrenoceptor expression and function. Neurourol Urodyn. 28, 349-355 (2009).
- Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. Postnatal development of myogenic contractile activity and excitatory innervation of rat urinary bladder. The American journal of physiology. 247, 972-978 (1984).
- Ng, Y. K., de Groat, W. C., Wu, H. Y. Smooth muscle and neural mechanisms contributing to the downregulation of neonatal rat spontaneous bladder contractions during postnatal development. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 292, 2100-2112 (2007).
- Szell, E. A., Somogyi, G. T., de Groat, W. C., Szigeti, G. P. Developmental changes in spontaneous smooth muscle activity in the neonatal rat urinary bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, 809-816 (2003).
- Szigeti, G. P., Somogyi, G. T., Csernoch, L., Szell, E. A. Age-dependence of the spontaneous activity of the rat urinary bladder. J Muscle Res Cell Motil. 26, 23-29 (2005).
- Frazier, E. P., Braverman, A. S., Peters, S. L., Michel, M. C., Ruggieri, M. R. Does phospholipase C mediate muscarinic receptor-induced rat urinary bladder contraction. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 322, 998-1002 (2007).
- Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Selective inhibition of phosphodiesterase 1 relaxes urinary bladder smooth muscle: role for ryanodine receptor-mediated BK channel activation. American journal of physiology. Cell physiology. 303, 1079-1089 (2012).
- Frazier, E. P., Peters, S. L., Braverman, A. S., Ruggieri, M. R., Michel, M. C. Signal transduction underlying the control of urinary bladder smooth muscle tone by muscarinic receptors and beta-adrenoceptors. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 377, 449-462 (2008).
- Svalo, J., et al. The novel beta3-adrenoceptor agonist mirabegron reduces carbachol-induced contractile activity in detrusor tissue from patients with bladder outflow obstruction with or without detrusor overactivity. European journal of pharmacology. 699, 101-105 (2013).
- Yokota, T., Yamaguchi, O. Changes in cholinergic and purinergic neurotransmission in pathologic bladder of chronic spinal rabbit. J Urol. 156, 1862-1866 (1996).
- Bayliss, M., Wu, C., Newgreen, D., Mundy, A. R., Fry, C. H. A quantitative study of atropine-resistant contractile responses in human detrusor smooth muscle, from stable, unstable and obstructed bladders. J Urol. 162, 1833-1839 (1999).
- Kullmann, F. A., McKenna, D., Wells, G. I., Thor, K. B. Functional bombesin receptors in urinary tract of rats and human but not of pigs and mice, an in vitro study. Neuropeptides. 47, 305-313 (2013).
- Sadananda, P., Kao, F. C., Liu, L., Mansfield, K. J., Burcher, E. Acid and stretch, but not capsaicin, are effective stimuli for ATP release in the porcine bladder mucosa: Are ASIC and TRPV1 receptors involved. European journal of pharmacology. 683, 252-259 (2012).
- Maggi, C. A., et al. Species-related variations in the effects of capsaicin on urinary bladder functions: relation to bladder content of substance P-like immunoreactivity. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 336, 546-555 (1987).
- Kullmann, F. A., et al. Effects of the 5-HT4 receptor agonist, cisapride, on neuronally evoked responses in human bladder, urethra, and ileum. Autonomic neuroscience : basic & clinical. 176, 70-77 (2013).
- Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Human tachykinin NK2 receptor: a comparative study of the colon and urinary bladder. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30, 632-639 (2003).
- Zoubek, J., Somogyi, G. T., De Groat, W. C. A comparison of inhibitory effects of neuropeptide Y on rat urinary bladder, urethra, and vas deferens. The American journal of physiology. 265, 537-543 (1993).
- Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationship of neurokinin A(4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the effect of amino acid substitutions on receptor affinity and function. Biochem Pharmacol. 63, 2181-2186 (2002).
- Warner, F. J., Mack, P., Comis, A., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationships of neurokinin A (4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the role of natural residues and their chirality. Biochem Pharmacol. 61, 55-60 (2001).
- Dion, S., et al. Structure-activity study of neurokinins: antagonists for the neurokinin-2 receptor. Pharmacology. 41, 184-194 (1990).
- Somogyi, G. T., Zernova, G. V., Yoshiyama, M., Yamamoto, T., de Groat, W. C. Frequency dependence of muscarinic facilitation of transmitter release in urinary bladder strips from neurally intact or chronic spinal cord transected rats. British journal of pharmacology. 125, 241-246 (1998).
- Andersson, K. E., Wein, A. J. Pharmacology of the lower urinary tract: basis for current and future treatments of urinary incontinence. Pharmacological reviews. 56, 581-631 (2004).
- D’Agostino, G., Condino, A. M., Gallinari, P., Franceschetti, G. P., Tonini, M. Characterization of prejunctional serotonin receptors modulating [3H]acetylcholine release in the human detrusor. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 316, 129-135 (2006).
- Hawthorn, M. H., Chapple, C. R., Cock, M., Chess-Williams, R. Urothelium-derived inhibitory factor(s) influences on detrusor muscle contractility in vitro. British journal of pharmacology. 129, 416-419 (2000).
- Chaiyaprasithi, B., Mang, C. F., Kilbinger, H., Hohenfellner, M. Inhibition of human detrusor contraction by a urothelium derived factor. J Urol. 170, 1897-1900 (2003).
- Testa, R., et al. Effect of different 5-hydroxytryptamine receptor subtype antagonists on the micturition reflex in rats. BJU international. 87, 256-264 (2001).
- Craggs, M. D., Rushton, D. N., Stephenson, J. D. A putative non-cholinergic mechanism in urinary bladders of New but not Old World primates. J Urol. 136, 1348-1350 (1986).
- Fry, C. H., Bayliss, M., Young, J. S., Hussain, M. Influence of age and bladder dysfunction on the contractile properties of isolated human detrusor smooth muscle. BJU international. 108, 91-96 (2011).
- Kennedy, C., Tasker, P. N., Gallacher, G., Westfall, T. D. Identification of atropine- and P2X1 receptor antagonist-resistant, neurogenic contractions of the urinary bladder. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 845-851 (2007).
- Levin, R. M., Danek, M., Whitbeck, C., Haugaard, N. Effect of ethanol on the response of the rat urinary bladder to in vitro ischemia: protective effect of alpha-lipoic acid. Molecular and cellular biochemistry. 271, 133-138 (2005).
- Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: Involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American journal of physiology. Cell physiology. 306, 45-58 (2013).
- Longhurst, P. A., Briscoe, J. A., Rosenberg, D. J., Leggett, R. E. The role of cyclic nucleotides in guinea-pig bladder contractility. British journal of pharmacology. 121, 1665-1672 (1997).
- Takahashi, R., Yunoki, T., Naito, S., Yoshimura, N. Differential effects of botulinum neurotoxin A on bladder contractile responses to activation of efferent nerves, smooth muscles and afferent nerves in rats. J Urol. 188, 1993-1999 (2012).
- Sadananda, P., Chess-Williams, R., Burcher, E. Contractile properties of the pig bladder mucosa in response to neurokinin A: a role for myofibroblasts. British journal of pharmacology. 153, 1465-1473 (2008).
- Liu, G., Daneshgari, F. Alterations in neurogenically mediated contractile responses of urinary bladder in rats with diabetes. American journal of physiology. Renal physiology. 288, 1220-1226 (2005).
