Summary
Dieses Manuskript stellt eine einfache, aber leistungsstarke, In-vitro-Verfahren zur Auswertung der glatten Muskulatur Kontraktilität in Reaktion auf pharmakologische Wirkstoffe oder Nervenstimulation. Hauptanwendungen sind Drogen-Screening und Verständnis Gewebe Physiologie, Pharmakologie und Pathologie.
Abstract
Wir beschreiben ein in vitro Verfahren zur glatten Blasenmuskel-Kontraktions zu messen, und ihre Verwendung zur Untersuchung der physiologischen und pharmakologischen Eigenschaften der glatten Muskulatur sowie Änderungen von Pathologie induziert. Dieses Verfahren liefert wichtige Informationen für das Verständnis der Funktion der Blase unter Überwindung großen methodischen Schwierigkeiten bei in vivo-Versuchen festgestellt, wie chirurgischen und pharmakologischen Manipulationen, die Stabilität und das Überleben der Zubereitungen betreffen, die Verwendung von menschlichem Gewebe und / oder den Einsatz von teuren Chemikalien. Es bietet auch einen Weg, um die Eigenschaften der einzelnen Blasenkomponente (dh der glatten Muskulatur, Schleimhaut, Nerven) bei gesunden und pathologischen Bedingungen zu untersuchen.
Die Harnblase wird von einem narkotisierten Tier, in Krebs-Lösung gelegt und in Streifen schneiden entfernt. Streifen werden in einer Kammer mit warmem Krebs-Lösung gefüllt war. Ein Ende ist mit einem isometrischen tensio befestigtn Wandlers an Kontraktionskraft zu messen, wird das andere Ende an einem feststehenden Stab angebracht ist. Gewebe wird durch direkte Zugabe Verbindungen dem Bad oder durch die elektrischen Feldstimulationselektroden, die Nerven, ähnlich wie bei Auslösung Blasenkontraktionen in vivo aktivieren stimuliert. Wir zeigen die Anwendung dieses Verfahrens auf die spontane Kontraktilität der glatten Muskulatur während der Entwicklung und nach einer Versuchsrückenmarksverletzung zu bewerten, die Art der Neurotransmission (Sender und Rezeptoren beteiligt sind), Faktoren der Modulation der glatten Muskelzellen-Aktivität beteiligt ist, die Rolle der einzelnen Komponenten Blase, und Arten und Organ Unterschiede in Reaktion auf pharmakologische Mittel. Zusätzlich ist es für die Untersuchung der intrazellulären Signalwege in der Kontraktion und / oder Relaxation der glatten Muskulatur, Drogen Struktur-Aktivitäts-Beziehungen und Auswertung der Transmitterausschüttung beteiligt sind, verwendet werden könnte.
Die in-vitro-Verfahren Kontraktilität der glatten Muskulatur wurde ausgiebig genutzt for mehr als 50 Jahren und hat Daten, die wesentlich zu unserem Verständnis der Blasenfunktion sowie der pharmazeutischen Entwicklung von derzeit klinisch zur Blasenmanagement verwendeten Verbindungen beigetragen vorgesehen.
Introduction
Die glatte Muskulatur der Blase entspannt, Urin Reinrichtungen und Verträge Harnausscheidung zu entlocken. Entspannung wird durch intrinsische Eigenschaften der glatten Muskulatur und Tonic Freisetzung von Noradrenalin (NE) von den sympathischen Nerven, die adrenergen Beta-Rezeptoren (β 3 AR in Menschen) in der Detrusor aktiviert vermittelt. Entleerung wird durch die Hemmung der sympathischen Eingabe und Aktivierung der parasympathischen Nerven, die ACh / ATP, um die glatte Muskulatur der Blase 1 Vertrag Veröffentlichung erreicht. Zahlreiche pathologischen Bedingungen, einschließlich Gehirn und / oder Rückenmarksverletzungen, neurodegenerative Erkrankungen, Diabetes, Blasenauslassobstruktion oder interstitielle Zystitis, kann zutiefst verändern Blasenfunktion, mit gravierenden Auswirkungen auf die Lebensqualität des Patienten 2. Diese Bedingungen ändern, die Kontraktilität der glatten Muskulatur durch Beeinflussung einer oder mehrerer Komponenten der Blase: die glatte Muskulatur, den afferenten und efferenten Nerven und / oderSchleimhaut.
Mehrere in vivo und in vitro-Verfahren zur Blasenfunktion zu untersuchen wurden entwickelt. In vivo ist Zystometrie die primäre Messung der Blasenfunktion. Obwohl dies ein intaktes Präparat, das Sammeln von Informationen unter beinahe physiologischen Bedingungen ermöglicht, gibt es eine Reihe von Umständen, unter denen die Verwendung von glatten Muskelstreifen bevorzugt. Diese umfassen Situationen, in denen chirurgische und / oder pharmakologischen Manipulationen das Überleben und die Stabilität der Zubereitung in vivo oder beeinflussen, wenn die Untersuchungen erfordern die Verwendung des menschlichen Gewebes oder teure Chemikalien. Dieses Verfahren ermöglicht auch eine Überprüfung der Wirkungen von Drogen, Alter und Pathologie von jeder Komponente der Blase, dh der glatten Muskulatur, Schleimhaut-und abführenden Nerven.
Blasenstreifen wurden über die Jahre von vielen Gruppen verwendet worden, um eine Reihe von wissenschaftlichen Fragen zu beantworten. Sie wurden eva verwendetluate Veränderungen in myogene Spontanaktivität von Pathologie induziert. Diese Tätigkeit wird angenommen, dass auf die Dringlichkeit und Häufigkeit Symptome der überaktiven Blase (OAB) beitragen, und ist daher ein Ziel für Drogen, die für OAB 3-9 entwickelt. Blasenstreifen wurden auch verwendet, um myogene und neuronale Faktoren, die Tonus der glatten Muskulatur mit dem Ziel der Entdeckung von Ionenkanälen und / oder Rezeptoren und / oder die intrazelluläre Signalwege, die gezielte könnte entweder Relaxation oder Kontraktion der glatten Muskulatur induziert werden modulieren untersuchen 3,10- 13. Andere Studien haben sich auf die Art der Neurotransmission, einschließlich Sendern und Rezeptoren beteiligt und Änderungen Pathologie 14,15 induzierte konzentriert. Darüber hinaus ist die Methode für den Vergleich zwischen verschiedenen Arten von Gewebe 16 zwischen den Organen 18 19-21, und die Bewertung der Arzneimittel Struktur-Aktivitäts-Beziehungen 22-24 verwendet wurde. Eine Erweiterung dieser Methode wurde verwendet, um measure die Wirkung von Drogen auf die Transmitterfreisetzung aus efferenten Nerven 25. Weiterhin ist eine Vielzahl von Geweben (Blase, Harnröhre, Gastrointestinaltrakt, GI) von Tieren oder Menschen (von Operationen bzw. Organspendergewebe für Forschung anerkannt) geerntet und aus einer Vielzahl von Tiermodellen, einschließlich Verletzungen des Rückenmarks (SCI), Blasenausgangsobstruktion (BOO) oder interstitielle Zystitis (IC) können mit dieser Technik untersucht werden.
In dieser Arbeit veranschaulichen wir die Anwendung dieses Verfahrens zusammen mit notwendigen experimentellen Protokollen mehreren vorstehend erwähnten wissenschaftlichen Fragen anzugehen.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Verfahren werden von der IACUC Ausschuss an der Universität von Pittsburgh genehmigt.
1. Lösungen
- Vorbereitung Krebs-Lösung nach der Rezeptur. Zusammensetzung in mM: NaCl 118, KCl 4,7, CaCl 2 1,9, MgSO 4 1,2, NaHCO 3 24,9, KH 2 PO 4 1,2, Glucose 11,7.
- Belüften Krebs mit 95% O 2, 5% CO 2 und legen Sie sie in einem 37 ° C Wasserbad auf während des Experiments verwendet werden. Beiseite stellen ~ 200 ml belüftete Krebs-Lösung bei Raumtemperatur bis zur Gewebe Präparation verwendet werden.
- Messen pH-Wert (~ 7,4) und Osmolarität (~ 300 mOsm) von belüfteten Krebs.
2. Versuchsaufbau (Schematische Abbildung 1A)
- Füllen belüfteten (95% O 2, 5% CO 2) Kammer mit 10 ml Krebs.
- Starten Sie die Umwälzpumpe, um die Kammern auf 37 ° C erwärmen; schalten Sie die notwendige Ausrüstung: Verstärker (n), Stimulator (s) und Aufnahme-Software.
- Kalibrieren Wandler mit einer 1-g-Gewicht.
3. Gewebe (1B)
Entfernen Sie die Blase von einem erwachsenen weiblichen Sprague Dawley naiven Ratte (200-250 g; ~ 10-12 Wochen alt) die folgenden Schritte:
- Bereiten Dissektion Bereich und notwendigen Instrumente: Rasierer, Pinzette mit Zähnen, Skalpell, Schere seziert, Mikroschere, zwei Pinzette (Autoren bevorzugen Dumont Pinzette # 3), Gewebe-Clips (oder Seidennaht), eine Sylgard beschichtet Dissektion Gericht mit Krebs und Gewebedissektion Pins.
- Betäuben das Tier mit Isofluran Inhalation (4% in O 2) in der Ansaugkammer. Verwenden Tier Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Das Niveau der Narkose kontinuierlich zu überwachen durch die Beobachtung der Atemfrequenz, Reaktion auf äußere Reize, und der Verlust der hinteren Extremität Reflex zurücktreten.
- Wenn das Tier betäubt Rasur der unteren Bauch einrea. Setzen die Beckenorgane über eine Mittellinie Bauchschnitt. Identifizieren Sie die Blase und Harnröhre. Entfernen Sie die Blase durch Schneiden an der Blasenhals in der Nähe von proximalen Harnröhre. Zeigen Gewebe sofort in der Sylgard beschichtet Gericht mit belüfteten Krebs-Lösung gefüllt.
- Falls nötig, entfernen Sie zusätzliche Gewebe zu dieser Zeit: Harnröhre, Stücke von Magen-Darm-Trakt (GI) und / oder der Prostata, usw.
- Zu opfern, das Tier mit IACUC zugelassenen Methoden (zB Narkosedosierung oder CO 2 Ersticken, gefolgt von einem sekundären Methode).
- Präparieren von Gewebe Stifte einfügen durch die Blasenkuppel, Hals, und der Harnleiter, um das Gewebe für die weitere Präparation zu stabilisieren. Sie das Gewebe nicht zu dehnen. Entfernen Sie Fett, Bindegewebe, proximalen Harnröhre, Harnleiter und, falls vorhanden.
- Öffnen Sie die Blase von der Basis bis zur Kuppel ein Flachblatt zu erstellen, Serosaseite down / up luminalen Seite (Abbildung 1B). Platzieren Sezieren Stifte an jeder Ecke des Gewebes. Blase entfernen dome und Halsgewebe.
- Wenn der Zweck des Experiments ist es, den Beitrag der Schleimhaut (Urothel und Lamina propria - siehe Diagramm 1C) zu bestimmen, um die Kontraktion der glatten Muskulatur, vergleichen Sie die Eigenschaften der Detrusorstreifen mit und ohne die Schleimhaut befestigt. Dazu vor dem Schneiden des Gewebes in Streifen, entfernen Sie vorsichtig die Schleimhautschicht mit Iris Frühling Schere und feinen Pinzette unter einem Binokular. Am Ende des Experiments, fixieren die Streifen für H & E-Färbung, um die vollständige Entfernung der Schleimhaut zu bestätigen. Beachten Sie, dass diese Prozedur in der Maus Blase einfacher als im Rattenblase.
- Schneiden Sie das Gewebe längs von der Basis bis Kuppel in Streifen von ca. 2 x 8 mm (Abbildung 1B). Krawatte oder fügen Sie eine Gewebeclip an beiden Enden jedes Streifens.
ANMERKUNG: Eine Rattenblase können in der Regel in 4 Streifen geschnitten werden, aber die Anzahl der Streifen kann zunehmen oder abnehmen, je nach dem Tier / Blasengröße. - Übertragen Sie die Streifen an der expermentellen Kammern. Befestigen Sie ein Ende jedes Streifens an einem Kraftaufnehmer, der die Gewebekontraktion misst, und die andere auf eine feste Glas / Metallstange.
HINWEIS: Gewebekammern variieren in der Größe (0,2 ml bis 20 ml oder größer). Typische Kammern für Nager Blasen sind 5-20 ml, die eine ausreichende Höhe für die Streifen vollständig in Lösung eingetaucht werden kann. Einige Kammern sind mit eingebauten Stimulationselektroden, andere nicht. Es sollte darauf geachtet werden, um sicherzustellen, dass alle Anschlüsse der Elektroden sind in gutem Zustand, sonst elektrische Feldstimulation ist nicht zuverlässig. - Tragen Sie eine definierte Menge an Kraft, um jeden Streifen durch vorsichtiges Dehnen der Gewebe, bis Ausgangsspannung erreicht 1 g (~ 10 mN). Zunächst wird das Gewebe dazu neigt, sich zu entspannen, die als Abnahme der Ausgangsspannung aufgezeichnet wird. Wasch Gewebe etwa alle 15 min mit dem warmen belüfteten Krebs und stellen Sie die Ausgangsspannung bis 1 g nach jeder Wäsche. Lassen Sie Gewebe für ~ 1-2 Stunden oder bis ins Gleichgewicht Basisspannung stabil ist (dh keine weiteren Gewebe Entspannung).
- Test der Lebensfähigkeit von Gewebe durch Zugabe von KCl (80 mM), die direkt in das Bad für ~ 5 min oder bis zu einem Plateau Reaktion erreicht ist. Antworten auf hohe Konzentrationen von KCl kann auch während des Experiments oder am Ende des Experiments wiederholt und zum Normalisieren Reaktionen auf andere Medikamente oder zwischen den Streifen (siehe Normalisierung unter Datenanalyseabschnitt) werden.
- Wasch Gewebe mehrfach (3-5x) mit dem warmen belüfteten Krebs, damit das Gewebe vor, eine Behandlungsbedingungen zurückzukehren.
4. Stimulationsprotokolle
- Um die Auswirkungen der Pathologie auf die spontane myogene Aktivität oder Tonus der glatten Muskulatur zu untersuchen, verwenden glatten Muskelstreifen aus verschiedenen Tiermodellen wie SCI, boo, oder Neugeborenen. Abbildung 2 veranschaulicht die Anwendung dieser Methode, um Änderungen in der Blase spontane Aktivität während der Entwicklung zu untersuchen und nach der SCI. Zusätzlich können pharmakologische Wirkstoffe zur sp modulierenontaneous Aktivität. Abbildung 3 veranschaulicht die Wirkung der KCNQ Kanalmodulatoren, Flupirtin und XE991, auf die spontane Aktivität und Tonus der glatten Muskulatur.
- Pharmakologische Stimulation der glatten Muskulatur Konstrukt Konzentrations-Wirkungskurven durch Zugabe von Verbindungen aus konzentrierten Stammlösungen direkt zu dem Bad in definierten Zeitintervallen. Verwenden Drogen-und Fahrzeug in parallelen Streifen für Fahrzeug und Einmaleffekte zu berücksichtigen.
- Machen Stammlösungen der gewünschten Testverbindungen bei 1000x das endgültige Arbeitskonzentration. Für Carbachol (CCH), einer Muscarin-Rezeptor-Agonist, bereiten folgende Bestände: 10 -5 M, 3 x 10 -5 M, 10 -4 M, 3 x 10 -4 M, 10 -3 M, 3 x 10 -3 M , 10 -2 M. Endkonzentrationen im Bad beträgt 10 -8 M bis 10 -5 M (4C, D). Für Medin B (NMB), ein Bombesin-Rezeptor-Subtyp 1-Agonisten, bereiten folgende Bestände: 10 -8 M, 10 -7M, 10 -6 M, 10 -5 M, 10 -4 M, 10 -3 M und Endkonzentrationen in dem Bad gibt 10 -11 M bis 10 -6 M. Sowohl KM und NMB werden erwartet, um Gewebe Kontraktilität erhöhen.
- Für eine 10 ml Gewebe Bad, fügen Sie 10 ul jeder CCh Stammlösung, sobald die Reaktion ein Plateau (4C, D) erreicht. In parallelen Streifen hinzufügen gleiche Mengen des Fahrzeugs (Wasser). Ebenso werden 10 ul jeder Medin B Stammlösung jedes ~ 5 min.
HINWEIS: Beachten Sie die erregende Wirkung von NMB und vom CCH auf der glatten Muskulatur in Streifen von verschiedenen Spezies in Abbildung 4. - Untersuchen die Eigenschaften Entspannung der glatten Muskulatur in der Vor-kontrahierten Gewebe mit einer erregenden Mittel, in der Regel CCh oder KCl.
- Um eine Antwort Agonisten blockieren, Vorbehandlung des Gewebes für 10-20 min mit dem Antagonisten zu Gewebepenetration, vor der Stimulation Agonisten zu ermöglichen.
- Für neuronale stimlation der glatten Muskulatur, die auch als elektrische Feldstimulation (EFS) befolgen Sie die Schritte 1 bis 3,13 und weiter wie unten beschrieben. EFS soll selektiv Nerven gegenüber der glatten Muskulatur zu aktivieren. Parameter für die Stimulation sollte sorgfältig ausgewählt werden, um direkte Stimulation der glatten Muskulatur zu vermeiden.
- Etablieren Stimulationsparameter: Art des Reizes (Einzelimpulse oder Züge), Dauer (Impulsdauer und Bahn Dauer), Frequenz und Intensität, wie in den Schritten unten beschrieben und in den Figuren 5A, B dargestellt.
- Für Einzelpuls-Stimulation, eingestellte Impulsdauer, Inter-Stimulus-Intervall und die Anzahl der gewünschten Reize. Übliche Parameter Stimulationsdauer Einzelimpulse 0,05-0,3 ms Dauer in gewünschten Intervallen (5A) geliefert. Folgen Sie Schritt für 4.3.1.4 Reizstärke.
- Für Zug-Stimulation, setzen Sie den Zug Dauer und unter Zug-Intervall. Typische Werte für Blasengewebe sind 3-10 sec geliefert mindestens 1 min auseinander (5B). Wenn Gewebe Müdigkeit auftritt (dh EFS Kontraktionen während Kontrollzeitraum zu verringern), erhöhen Sie den Abstand zwischen den Zug.
- Stellen Sie die Frequenz der Zug Reize (Anzahl der Impulse in einem Zug - Figur 5B). Führen Sie einen Frequenzgang reicht von 0,5 bis 50 Hz. Typische Frequenzen für Blasen sind 10-20 Hz, die reproduzierbare und stabile Kontraktionen von ATP und ACh vermittelte geben. Beachten Sie die frequenzabhängige Reaktionen auf Stimulation EFS Maus Blasenstreifen in Figur 5 zeigt, wie dieses Verfahren verwendet werden, um den Beitrag der cholinergen und purinergen Mechanismen der Neurotransmission zu bewerten.
- Etablieren Intensität des Reizes: systematisch erhöhen Sie die Intensität (Spannung) des Reizes, bis die Amplitude der Kontraktion ein Plateau erreicht (wenn Züge mit halten die Frequenz konstant).
- Stellen die Intensität des Reizes in Abhängigkeit von derZiel des Experiments. Wenn das Ziel ist, die neural hervorgerufenen Kontraktionen zu erhöhen, dann verwenden Sie submaximalen Intensität, dass die Amplitude der Kontraktion ist ~ 50% der maximalen Kontraktion. Wenn das Ziel ist, die neural hervorgerufenen Kontraktionen zu verringern, dann die Intensität eingestellt auf ~ 80% der maximalen Amplitude, um Gewebe Ermüdung zu vermeiden.
- Sobald Stimulationsparameter (Dauer, Häufigkeit und Intensität) eingerichtet sind, erlauben ~ 20-30 min für EFS- hervorgerufenen Kontraktionen zu stabilisieren vor Drogentests.
HINWEIS: (; 0,5-1 um TTX) Um die Selektivität von EFS für neuronale Übertragung, Block neuronale Übertragung mit der Na +-Kanal-Blocker, Tetrodotoxin überprüfen. Dieser Schritt zu Beginn des Experiments als TTX wäscht relativ einfach. Darüber hinaus führen diese am Ende des Versuchs (siehe Schritt 4.3.5. Unten). - Die Stammlösungen bei 1,000x die letzten Arbeitskonzentrationen für: Alpha-, Beta-Methylen ATP (ABMA; eine purinergen Rezeptor-Aktivatorund Desensibilisierer) 10 -2 M, Atropin (ein Muskarin-Rezeptor-Antagonist) 10 -3 M (5C). Beachten anderen Beispielen in 6. Die 5HT4-Rezeptoragonisten, Cisaprid (3 x 10 -6 M, 10 -6 M, 3 x 10 -5 M, 10 -5 M, 3 x 10 -4 M, 10 -4 M, 3 x 10 -3 M, 10 -3 M), erhöht die Gewebekontraktionsfähigkeit und SB-203186 (3 x 10 -3 M), einem 5HT4-Rezeptor-Antagonisten, kehrt Cisaprid-Effekten.
- Um die Auswirkungen der ABMA und Atropin auf EFS (5C) zu testen, führen zwei Steuerfrequenzkurven. Werden 10 ul von 10 -2 M ABMA dem Bad für eine Endkonzentration von 10 uM. Dies wird das Gewebe durch eine direkte Stimulation der Rezeptoren im purinergen die glatte Muskulatur kontrahieren. Nach der Antwort auf die Grundlinie zurück, wiederholen Frequenzkurven. Werden 10 ul 10 -3 M Atropin für eine endgültige KonzentratIonen von 1 uM. Nach ~ 10 min (für die Atropin benötigt, um Muscarinrezeptoren blockieren), wiederholen Frequenzkurven. In parallelen Streifen werden 10 ul des Fahrzeugs, Wasser, in jedem Schritt.
HINWEIS: Für andere Beispiele in Abbildung 6, mit 10 ul jeder Cisaprid Stammlösung in definierten Zeitabständen (~ 15 min, siehe Diskussion), gefolgt von 10 ul SB-203186-Stammlösung direkt in die Badewanne und ihre Wirkung auf die Überwachung EFS-induzierten Kontraktion. In parallelen Streifen werden 10 ul des Fahrzeugs, DMSO. Beachten Sie die Auswirkungen von Cisaprid, ein 5HT4-Rezeptor-Agonist, auf EFS hervorgerufenen Kontraktionen in der menschlichen Blase und Ileum Gewebe in Abbildung 6. Zusätzlich beobachten die Wirkung von DMSO, das Fahrzeug für Cisaprid, auf EFS hervorgerufenen Kontraktionen in der menschlichen Blase und Ileum Gewebe . - Am Ende des EFS-Protokoll überprüfen die Selektivität des EFS durch die Blockierung neuronale Übertragung mit der Na +-Kanal-Blocker, Tetrodotoxin (TTX; 0,5-1 &# 181; M). Wenn TTX-resistenter Kontraktionen noch vorhanden sind, ist es empfehlenswert, die Dauer und die Intensität des Reizes in nachfolgenden Experimenten einzustellen.
- Etablieren Stimulationsparameter: Art des Reizes (Einzelimpulse oder Züge), Dauer (Impulsdauer und Bahn Dauer), Frequenz und Intensität, wie in den Schritten unten beschrieben und in den Figuren 5A, B dargestellt.
- Für die Ermittlung der Auswirkungen von Drogen auf Pre-oder Post-synaptische Stellen (7A) befolgen Sie die Schritte 1 bis 4.3.2. Etablieren reproduzierbare Antworten auf Carbachol und EFS, dann fügen Medikament X.
- Am Ende des Experiments, unclip oder lösen die Streifen, tupfen Sie sie vorsichtig auf ein Stück Seidenpapier, um zusätzliche Flüssigkeit zu beseitigen und messen das Gewicht jeder Streifen mit einer Waage. Auch messen die Länge Gewebe mit einer Schieblehre, um die Querschnittsfläche zu bestimmen. Diese Informationen werden für die Normalisierung von Daten verwendet (siehe Abschnitt 5.4).
5. Datenanalyse
Analyse von Daten mittels geeigneter Software (zB WinDaq, LabChart).
- Für spontane Aktivität, wählen Sie ein Fenster von mindestens 30 sec vor und auf dem Höhepunkt der Droge induzierten Antwort und mirasure Amplitude und Frequenz der myogene Aktivität (3).
- Verwenden schnelle Fourier-Transformation-Analyse, um das Spektrum von Frequenzen beitragen, Antworten kontraktil und bestimmen, ob es Unterschiede zwischen den verschiedenen Teilen der Blase (zB Kuppel gegen den Hals) oder mit der Entwicklung, Pathologie und Drogen 8.
- Für Wirkungen auf glatte Muskulatur Wählen Sie ein Fenster von mindestens 10-30 Sekunden vor und auf dem Höhepunkt der Droge induzierten Reaktion und messen Amplitude der Kontraktion.
- Effekte auf neural hervorgerufenen Kontraktionen zu messen Amplitude, Dauer und die Fläche unter der Kurve der Kontraktionen (mindestens 3) vor und an der Spitze des medikamenteninduzierten Reaktion.
HINWEIS: Es ist notwendig, sowohl die Amplitude und die Fläche unter der Kurve der EFS-induzierten Kontraktionen zu messen, da purinerger und cholinerge Komponenten unterschiedliche Kinetik. Die purinergen Komponente ist schnell und vorübergehend (ATP aktiviert purinergic ionotropen Kanäle wie P2X1, die schnell Einstrom von Calcium zu ermöglichen, dann werden sie zu desensibilisieren) und trägt so mehr zu der Peak-Amplitudengang und kleiner in der Fläche unter der Kurve. Die cholinergen Komponente ist langsamer und anhaltender (ACh aktiviert metabo Muskarinrezeptoren, die mehr Zeit benötigen, um die intrazelluläre Signalwege, die letztlich zu aktivieren Ionenkanäle, die die glatte Muskulatur depolarisieren eine Kontraktion induzieren zu aktivieren). Somit wird die muskarinischen Komponente besser durch Messen der Fläche unter der Kurve erfasst. - Normalisieren die Daten, um Ergebnisse in Streifen und pharmakologische Behandlungen zu vergleichen. Der Parameter für die Normierung gewählt sollte nicht durch die Testverbindungen beeinflusst werden, pathologischen Zustand studiert oder experimentelles Design. Unter diesen Parametern Verwendung Leiste Gewicht, Querschnittsfläche, KCl Reaktionen (4B),% der maximalen Reaktion (7B) oder% der maximalen Reaktion auf einen anderen Kontraktionsmittel(ZB CCH) oder Entspannen Mittel (zB Papaverin).
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Representative Results
Spontane Aktivität Myogenic
Spontane myogene Aktivität ist ein wichtiger glatten Muskulatur Merkmal, das ändert sich mit der postnatalen Entwicklung 6-9 und Pathologie (zB, SCI, BOO) 3-5 unterzogen. Da diese Aktivität wird angenommen, daß die Symptome der überaktiven Blase (OAB) 2 tragen, ist von großem Interesse für die Entwicklung von wirksamen Behandlungen für OAB und andere Störungen der glatten Muskulatur eine Auswertung von Rezeptoren, intrazelluläre Signalwege und pharmakologische Mittel, die es zu modulieren. Das hier vorgestellte Verfahren kann leicht untersuchen diese Fragen Abbildung 2 veranschaulicht verschiedene Muster von myogenen spontane Aktivität während der Entwicklung in der neonatalen (i), juvenile (ii) für Erwachsene (iii) und das Rückenmark verletzt Ratten. (SCI, iv). Streifen von neugeborenen Ratten zeigen große Amplitude und niedriger Frequenz rhythmische Kontraktionen (Abbildung 2ai), während Streifen von erwachsenen Rattes kleine Amplitude aufweisen, Hochfrequenz-Aktivität (2Aii, iii). Nach SCI die Neugeborenen-Muster wieder auftaucht (Abbildung 2Aiv). Neben der Verwendung von Streifen aus Tiermodellen können verschiedene pharmakologische Mittel verwendet werden, um die spontane Kontraktionen in Streifen von naiven Tieren zu induzieren, mit dem Ziel, das Verständnis der Mechanismen der Spontankontraktionen. Beispiele für geeignete pharmakologische Mittel sind Muscarin-Rezeptor-Agonisten (Carbachol, CCH). Verbindungen, die ACh-Ebenen (wie Acetylcholin-Esterase-Hemmer) zu erhöhen, niedrige Konzentrationen von KCl (beispielsweise 20 mm) oder anderen experimentellen Medikamenten 3A-B veranschaulichen Modulations der Spontanaktivität durch pharmakologische Wirkstoffe, die auf KCNQ Kanäle auf die glatte Muskulatur befindet handeln. Die KCNQ-Kanal-Öffners Flupirtin, verringert sich die Amplitude und Frequenz der Spontanaktivität in einer konzentrationsabhängigen Weise (3AI-iii), dieKCNQ Kanalblocker, XE991, verringert sich die Amplitude, sondern erhöht die Frequenz der Spontanaktivität (Abbildung 3Bi-III).
Tonus der glatten Muskulatur
Tonus der glatten Muskulatur und die Kontraktilität Eigenschaften sind wichtige Faktoren für die ordnungsgemäße Funktion der Blase während der Lagerung und Entleerung. Dieses Verfahren kann leicht zu screenen, die Auswirkungen von pharmakologischen Mitteln auf glatten Muskeltonus. Figuren 3Aiv und 3Biv zeigen, dass Flupirtin verringert basalen Ton, im Einklang mit Entspannung der glatten Muskulatur, während der XE991 erhöht Tonus der glatten Muskulatur. Abbildung 4 zeigt konzentrationsabhängigen Anstieg der glatten Muskulatur durch Aktivieren Bombesin-Rezeptoren mit Neuromedin B (NMB, Figur 4a, b) oder Muskarinrezeptoren mit Carbachol (CCh, 4C, D). Darüber hinaus kann die intrazelluläre Signalwege vermitteln, diese Antworten glatten Muskelzellen untersucht werden usingen spezifische Modulatoren (Daten nicht gezeigt).
Neural-vermittelte Antworten und Modulation der Neurotransmission
Blasenkontraktion wird durch die Freisetzung von ACh / ATP aus den parasympathischen efferenten Nerven erreicht. Der Beitrag der Muscarin und purinergen Systeme Blasenkontraktion variiert zwischen den Arten und pathologischen Bedingungen, mit überwiegender Erhöhung purinergen Beitrag bei Pathologien wie interstitielle Zystitis, Teil Obstruktion und der überaktiven Blase 26. 5C zeigt die Verwendung dieser Methode zu bestimmen, die Beitrag von Muscarin und purinergen Komponenten, die in Blasenstreifen von der Maus Neurotransmission. Der Beitrag des cholinergen Komponente wurde mit der Muskarin-Rezeptor-Antagonisten Atropin bewertet. Der Beitrag der purinergen System wurde mit der purinergen Rezeptor-Aktivator und Desensibilisator, alpha beurteilt, beta-MethylEn-ATP (ABMA). Zusätzlich wurde die frequenzabhängige Beitrag jeder Komponente durch Variieren der Stimulationsfrequenz von niedrigen zu hohen Frequenzen (2-50 Hz) beurteilt.
Die Stärke der Blasenkontraktion spielt eine bedeutende Rolle bei der effizienten Miktion. Mit dieser Methode können Rezeptoren und Signalwege, die neuronale Übertragung modulieren als Arzneimittelziele Entleerungsstörungen untersucht werden. Die 5HT4-Rezeptoren sind bereits junktional der parasympathischen Neuronen und ihre Aktivierung erhöht ACh Ebenen 27. 6 zeigt die exzitatorische Wirkung der 5HT4-Rezeptoragonisten, Cisaprid, in menschlichen Blase und Ileum-Streifen.
Verschiedene experimentelle Protokolle können verwendet werden, um den Ort der Wirkung einer Testverbindung zu bestimmen. Diagramm in Abbildung 7A zeigt ein Protokoll, mit dem vorge gegen Post-Verbindungsstellen zu bewerten. Wenn die medikamentöse X reduziert (oder erhöht) die EFS Antwort, hat aber keine wirkt auf das CCH Antwort, ist der wahrscheinlichste Ort des Geschehens vor-Junction. Wenn die medikamentöse X ändert sowohl EFS und vom CCH Antwort, dann kann es auf Rezeptoren befinden Post-junktional oder beides vor und nach junktional handeln.
Rolle der einzelnen Bestandteile: Glatte Muskel, Schleimhaut und Neuronale
Verschiedenen pathologischen Zuständen kann verschiedene Komponenten der Blase beeinflusst. Zum Beispiel interstitielle Zystitis (IC) betrifft vor allem das Urothel, während OAB kann in veränderter Kontraktilität der glatten Muskulatur führen. Auch können verschiedene Rezeptoren in jeder Blase Komponente exprimiert werden und könnte somit spezifisch in einer bestimmten Pathologie richtet sein. Die in vivo-Methoden, die eine Nettoeffekt aller Blasenkomponenten messen Gegensatz erlaubt diese in vitro-Verfahren für die Untersuchung von bestimmten Komponenten durch Verwendung einer Kombination von chirurgischen und pharmakologischen Verfahren. In Abwesenheit von neuronalen testen Kontraktion der glatten Muskulatur / EntspannungsGetriebe, TTX (0,5-1 uM) zu dem Bad zugegeben werden. In 4 wurden NMB und CCh in Gegenwart von TTX getestet. Um den Beitrag der Schleimhaut (Urothel und Lamina propria) an der glatten Muskulatur Kontraktilität zu testen, werden Streifen mit und ohne die Schleimhautschicht verglichen. 7B zeigt, dass die Antworten auf CCh in Gegenwart der Schleimhaut in der Schweine 28 reduziert. Ähnliche Ergebnisse wurden in humanen Blasenstreifen 29 erfasst. Um die Rolle von Nervenfasern zu testen, können mehrere Ansätze genommen werden. Die eine ist, aktivieren oder hemmen bestimmte Fasern mit pharmakologischen Mitteln. Zum Beispiel aktiviert Capsaicin einen bestimmten Population von afferenten Nerven und verursacht Arten abhängig Kontraktion der glatten Muskulatur und Entspannung 17,18. Guanethidin hemmt die Freisetzung von Noradrenalin aus sympathischen Fasern, wodurch der Beitrag dieser Fasern. Ein weiterer Ansatz ist die Desensibilisierung / eliminieren spezifischen Fasern in vivovor dem Experiment. Beispielsweise systemische Behandlung des Tieres mit Capsaicin desensibilisiert Capsaicin empfindlich afferenten Nerven. Andere Komponenten, die Blase in dieser Zubereitung untersucht werden können, sind interstitiellen Zellen oder Gap Junctions durch Aktivierung oder blockiert sie mit spezifischen Mitteln.
Speziesunterschiede
Während die meisten Arzneimittelentwicklung zur Behandlung von menschlichen Erkrankungen bestimmt ist, ist in erster Linie der Grundlagenforschung in tierischem Gewebe durchgeführt. Speziesunterschiede existieren in einer Reihe von Rezeptoren. Zum Beispiel 5HT4-Rezeptoragonisten verbessern neural hervorgerufenen Kontraktionen in der menschlichen Blase, aber nicht in der Ratte Blase 19,30 EFS-induzierte Kontraktionen werden fast ausschließlich Atropin empfindlichen bei Menschen und Affen der alten Welt Detrusor von stabilen Blasen 31, aber teilweise zu Atropin-resistente im menschlichen Detrusor von Patienten mit instabiler Blase Bedingungen (beispielsweise neurogene, obstructed Blasen) 15,32,33, Capsaicin löst eine erregende Antwort an Ratten und menschlichen Blase Streifen, keine Antwort in der Schweineblase Streifen und hemmende Reaktion bei Meerschweinchen Blasenstreifen 17,18. 4 zeigt, dass Bombesin-Rezeptor-Agonisten haben erregende Auswirkungen auf Ratte Blase und keine Auswirkungen auf die Maus und Schweinsblase Streifen 16. Diese Informationen sind wichtig für die Auswahl der geeigneten Tiermodell für die Untersuchung eines spezifischen Rezeptors.
Vergleich der Empfindlichkeit über Orgeln
Medikamente zur Behandlung von Blasenstörungen bestimmt sind, können auch auf glatten Muskelzellen von anderen Organen, wie Magen-Darm-Trakt, der Harnröhre, der Gallenblase etc. Dieses Verfahren ermöglicht Schätzung Organ Selektivität und Empfindlichkeit, ein pharmakologisches Agens durch Vergleichen verschiedener Gewebe nebeneinander. Wie in Figur 6, der 5HT4-Rezeptoragonisten, Cisaprid dargestellt ist unterschiedlichent Wirksamkeit und Potenz in der menschlichen Blase gegen Ileumgewebe.
Abbildung 1. Versuchsaufbau und Blasenbandvorbereitung. A) Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus. Blasenstreifen werden in Gewebekammern mit belüfteten Krebs-Lösung gefüllt bei 37 eingetaucht gehalten ° C über eine Umwälzpumpe. Ein Ende des Streifens wird mit einem isometrischen Kraftwandler angebracht ist, um Gewebekontraktionsfähigkeit zu messen, die andere an einer festen Stange. Der Kraftwandler ist mit einem Verstärker und Rechner zur Datenaufzeichnung angeschlossen. Elektrofeldstimulation Elektroden an einem Stimulator verbunden sind, in der Kammer angeordnet und zum Hervorrufen neuronal vermittelte Kontraktionen der Blase verwendet. B) Herstellung von Gewebestreifen. 1 vertikalen Schnitt th #: Die Blase ist in einem Gericht festgesteckt und die folgenden Verfahren durchgeführtough ventralen Hälfte der Blase aus der Harnröhre zu Kuppel, um die Blase zu einem flachen Blatt zu öffnen. # 2 horizontale Schnitte Entfernen der Kuppel und Basis der Blase / proximalen Harnröhre. . # 3 vertikale Schnitte Division der Mitte der Blase in gleiche Streifen (4 Streifen von einer Ratte Blase) C) Schematische Darstellung der Band Komponenten: der glatten Muskulatur und Schleimhaut, die beide die afferenten (blau) und ableitenden (grün) Nerven. Schleimhaut besteht aus dem Urothel und Lamina propria. Lamina propria enthält Blutgefäße [1], interstitiellen Zellen [2], und muscularis mucosae [3]. Gestrichelten Linie markiert # 2b wird das Verfahren zum Entfernen von Schleimhaut-Schicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Myogenic spontane Aktivität während der Entwicklung und nachPathologie. A) Beispiele für spontane Aktivität in neonatalen (i), juvenile (ii), Rücken intakt Erwachsenen (iii) und das Rückenmark verletzt (SCI) Erwachsene (iv) Ratte Blasenstreifen. Die SCI-Ratte wurde 4 Wochen nach der Operation. B, C) Zusammenfassung der Amplitude (B) und die Frequenz (C) der spontanen Kontraktionen in den vier untersuchten Gruppen verwendet. (Mit Genehmigung von Artim DE, Kullmann FA, SL Daugherty, Bupp E, CL Edwards, de Groat WC reproduziert Neurourol Urodyn 2011 November; 30 (8):.. 1666-1674.) Bitte hier klicken, um eine größere Version davon zu sehen Figur.
Abbildung 3. Die Modulation der myogenen spontane Aktivität und Tonus der glatten Muskulatur. A) Die Wirkung der KCNQ Kanal Öffner, flupirtine, auf spontane Aktivität und Baseline-Ton in erwachsenen Ratte Blasenstreifen. (I) Flupirtin wurde bei der Erhöhung in den durch Pfeile angegebenen Zeiten Konzentrationen (kumulativ) zugesetzt. Die Erweiterungen im Rahmen der Spuren Show 4 min von Streifentätigkeit während der Regelung und nach der Anwendung von 10 um und 50 um Flupirtin. (II-iv) Zusammenfassung der Wirkung von Flupirtin (7 Streifen von 4 Ratten) auf die Amplitude (ii) und Frequenz (iii) der Spontanaktivität und Grundlinientonus (IV), ausgedrückt als% Änderung von Werten Steuerung (pre-drug) , die zu 100%. B gesetzt wurden) Die Wirkung der KCNQ Kanalblocker, XE991, auf spontane Aktivität und Baseline-Ton in erwachsenen Ratte Blasenstreifen. (I) XE991 wurden steigende an den durch Pfeile angegebenen Zeiten Konzentrationen (kumulativ) zugesetzt. Die Erweiterungen im Rahmen der Spuren zeigen 2 min von Streifentätigkeit während der Regelung und nach der Anwendung von 10 um und 50 um XE991. (II-iv) Zusammenfassung der Wirkung von XE991 (9 Streifen von 4 Ratten) auf derAmplitude (ii) und Frequenz (iii) der spontanen Aktivität und Baseline-Ton (iv), ausgedrückt als Veränderung in% Werte Regelung (Pre-Medikament), die auf 100% gesetzt wurden. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen .
Abbildung 4. Speziesunterschiede. A) Konzentrationsabhängige Kontraktionen glatter Muskeln in Reaktion auf den Bombesin-Rezeptor-Agonisten, Neuromedin B (NMB), in Ratten-Blasenstreifen. B) Zusammenfassung der Effekte von NMB an Kontraktion der glatten Muskulatur in den Rattenblasenstreifen. Daten werden auf das KCl (80 mM) Antwort. C, D) Fehlen von Reaktionen auf NMB in der Maus (C) und Schwein (D) Blasenstreifen. Carbachol (CCH) löst starke Konzentration abhängig conTraktionen in Maus und Schwein Streifen, die anzeigt, dass die Streifen auf Reize reagieren. TTX (0,5 uM) wurde in das Bad in allen Leisten vorhanden. (Nachdruck mit Genehmigung von Kullmann FA, McKenna D, Wells GI, Thor KB Neuropeptide 2013 Oktober; 47 (5):.. 305-13) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Elektrische Feldstimulation. A) Schematische Darstellung der Einzelpulsstimulationsparameter. Abkürzungen: D = Dauer des Impulses, i = Intensität der Puls, ipi = Zwischenpulsintervalls B) Schematische Darstellung der Zug Stimulationsparameter.. Abkürzungen: td = Zug Dauer, i = Intensität der Puls, = iti unter Zug-Intervall. Einschub zeigt die Anzahl der Impulse in einem Zug und das Intervall zwischen ihnen, die zusammen mit dem Zug Dauer bestimmen die Frequenz der Zug-Stimulation. C) Beitrag der purinegic und cholinerge Komponenten neural-evozierte Blasenkontraktionen. EFS-FR repräsentieren Stimulationsfrequenzen, 2, 5, 10, 20, 50 Hz beträgt. Drei Impulse geliefert alle 90 sec wurden für jede Frequenz getestet und jede Frequenz Serie wurde zweimal in Kontrolle und zweimal nach Zugabe jeder Verbindung wiederholt. Alpha, beta-Methylen ATP, abgekürzt ABMA (Band 1), wurde verwendet, um purinerger und Atropin (Band 2) wurde verwendet, um muskarinischen Rezeptoren blockieren desensibilisieren. Streifen 3 diente als Kontrolle und wurde mit dem Fahrzeug, Wasser behandelt. Die Pfeile zeigen die Zeit, in der jede Verbindung zu jedem Streifen aufgenommen. Beachten Sie, dass EFS hervorgerufenen Kontraktionen sind stark von ABMA und Atropin reduziert, während nicht von dem Fahrzeug betroffen. TTX wurde am Ende des Experiments zugegeben, während die EFS wurde bei 20 Hz geliefert werden. Beachten Sie, dass in der verbleibenden Steuer beobachtet KontraktionenBand 3 wurden von TTX abgeschafft, demonstrieren ihre neuronalen Natur (dh von Transmitterfreisetzung aus den intramuralen Nerven eingeleitet). # Zeigt glatten Muskulatur Reaktionen auf ABMA in Abwesenheit von EFS. Maßstabsbalken sind 5 min für x-Achse und 2 g für y-Achse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Modulation der neural-evozierte Blasenkontraktionen. A, B) Beispiele für die Verstärkung der neural hervorgerufenen Kontraktionen der 5HT4-Rezeptoragonisten, Cisaprid in menschlichen Blase (A) und Ileum-Streifen (B). Cisaprid (schwarz Sätzen) oder DMSO (grau Aufzeichnungen) in einer konzentrationsabhängigen Weise an den durch Pfeile angegebenen Zeiten zugegeben. Schwarze Balken unterhalb der Datensätze in jeder TafelEFS darstellen, die von 10 s bei 20 Hz Züge alle 120 sec geliefert bestand. Vertikale Skala Bars sind 1 g für alle Beispiele. TTX-Konzentration betrug 0,5 um. CF) Zusammenfassung der Fläche unter der Kurve (AUC) des EFS hervorgerufenen Kontraktionen in Abhängigkeit von Cisaprid (schwarze Balken) oder DMSO (graue Balken) in Blasenstreifen (C, D) und Ileum-Streifen (E , F). CF steht für SB SB-203186, die eine Zusammenfassung der Daten nach der Zugabe des 5HT4-Rezeptor-Antagonisten erhalten. Gestrichelten Linien sind auf 100% eingestellt und stellen Kontrolle. (Mit Genehmigung von Kullmann FA, Kurihara R, L Ye, Wells GI, McKenna DG, Burgard EG, Thor KB reproduziert Auton Neurosci 2013 Juni; 176 (1-2):... 70-7) Bitte klicken Sie hier, um eine Ansicht Größere Version der Figur.
Figurieren 7. Seiten der Wirkung von Drogen und die Rolle der verschiedenen Komponenten der Blase. A) Schematische Darstellung des Protokoll zur Identifizierung der Wirkort eines Arzneimittels. Streifen werden mit ESF und Carbachol (CCH) stimuliert. In I Medikament X reduziert die EFS Antwort, aber nicht das CCH Reaktion, was auf eine vor-junktionale Wirkort. In II, Drogen X ändert beide Reaktionen, was eine Wirkung auf postjunktionale oder sowohl vor und nach dem Knoten-Rezeptoren. B) Einfluss der Schleimhaut Kontraktion der glatten Muskulatur. Effekte von Carbachol in Streifen mit der Schleimhaut vorhanden ist (intakt) im Vergleich zu Streifen mit der Schleimhaut entfernt (entblößte) vermindert. (. B wird mit Genehmigung von Hawthorn MH, Chapple CR, Schwanz M, Schach-Williams R. Br J Pharmacol 2000 Februar wiedergegeben; 129 (3): 416-9). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In dieser Arbeit haben wir beschrieben, in vitro die Kontraktilität der glatten Muskulatur Verfahren, das verwendet werden kann, um eine Anzahl von wichtigen wissenschaftlichen Fragen Blase Physiologie und Pathologie sowie der Unterstützung der Entdeckung neuer Medikamente zur Blase Dysfunktion im Zusammenhang beziehen sich auf eine einfache. Wir haben die Verwendung dieses Verfahrens zur Bewertung der Entwicklungs, pathologischen und pharmakologischen Eigenschaften der glatten Blasenmuskulatur Kontraktilität (Figuren 2-4), Neuromodulation (Figuren 5-7A) Spezies Unterschiede (Abbildung 4), Organ Unterschiede dargestellt (Figur 6) und Relevanz bestimmter Blasen Komponenten (zB Schleimhaut, 7B). Weitere Anwendungen sind hier nicht dargestellt Auswertung der intrazellulären Signalwege mit pharmakologischen Mitteln 3,10,11, Struktur-Aktivitäts-Beziehungen der verschiedenen Drogen 22-24, oder Bewertung / Quantifizierung der Sender relenach neuronale Stimulation 25 ase.
Während die Blasenfunktion kann letztlich in vivo beurteilt werden, überwindet dieses in vitro-Verfahren in vielen Fällen problematisch in vivo sind. Diese umfassen Situationen, in denen chirurgische und pharmakologischen Manipulationen die Lebensfähigkeit und / oder das Überleben des Organs oder des Tieres, die Verwendung von menschlichem Gewebe zu verringern, die Notwendigkeit, zu identifizieren und zu charakterisieren Antworten von bestimmten Komponenten (zB der glatten Muskulatur gegenüber Epithel gegen Nerven ) oder die Verwendung von teuren Chemikalien. Das Verfahren ermöglicht die systematische Untersuchung der Wirkungen verschiedener pharmakologischer Mittel sowie Pathologie auf kontraktile Aktivität der glatten Muskulatur und in einer gut kontrollierten Art und Weise und Umwelt.
Das Verfahren liefert eine Fülle von Informationen; Jedoch ist Vorsicht bei der Interpretation und Extrapolation dieser Informationen getroffen werden. Dies ist ein in vitro-Verfahren zur Herstellung eines reduzierten, disaus ihrer normalen Umgebung und neuronale Steuerung verbunden. Die Versuchsbedingungen sind nicht physiologisch, damit die Daten nicht vollständig in vivo physiologischen Gegebenheiten anzupassen. Zum Beispiel kann das Verfahren nicht für Veränderungen im Blutfluss, Hormone, humorale Substanzen, externen mechanischen Kräften, oder extrinsischen neuronalen Steuerung zu berücksichtigen. Gewebe akut dezentral, wodurch Verletzungen und Ischämie bezogenen Reaktionen müssen bewertet und berücksichtigt werden. Pathologischen Veränderungen im Gehirn oder Rückenmark auftreten, können mit dieser Methode nicht getestet werden, es sei denn, sie haben bereits verändert afferenten, glatte Muskelzellen, Schleimhaut oder intramuralen Nervenfunktion (dh zelluläre Plastizität). Elektrische Feldstimulation (EFS) ermöglicht die Auswertung von neural vermittelte Reaktionen. Allerdings reizt es wahllos alle Nerven in der Leiste (zB Sympathikus, Parasympathikus, Afferenzen), im Gegensatz zu in-vivo-Situation, in der Miktionsreflexes aktiviert nur bestimmte pathways. Eine Möglichkeit, diese Situation zu überwinden, ist EFS mit spezifischen Antagonisten, die selektiv blockieren verschiedene Wege zu kombinieren. Zum Beispiel könnte Guanethidin verwendet werden, um Noradrenalinfreisetzung bei der Untersuchung Kontraktion Eigenschaften blockieren oder Atropin verwendet werden, um Muscarinrezeptoren blockieren, um zu verhindern, wenn Blasenkontraktionen Studium Relaxationseigenschaften werden. Schließlich wird die Lebensfähigkeit des Gewebes auf eine bestimmte Anzahl von Stunden begrenzt. Im Allgemeinen sind die meisten Komponenten der Blasengewebe lebensfähig und stabil ist (dh die Antwort auf EFS ohne Verschlechterung Reaktionen) über einen Zeitraum von 6-8h oder länger. Jedoch können auch andere Gewebe empfindlicher sein (zB dauert Ileum ~ 6 h oder weniger; persönlichen Erfahrung des Autors).
Obwohl das Verfahren ist technisch machbar und mit guter Reproduzierbarkeit, gibt es mehrere kritische Schritte erforderlich sind, um den Erfolg zu gewährleisten. Zunächst sollten Gewebepräparation sorgfältig durchgeführt, um die Lebensfähigkeit, indem sie notwendige Veränderungen zu gewährleistenauf die Dissektion Verfahren (vermeiden Strecken des Gewebes während der Vorbereitung der Streifen) und / oder Medien, wenn für verschiedene Gewebetypen oder Arten erforderlich. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Einstellung-up neuronalen Stimulationsparameter, so dass Deckeneffekte vermieden werden. Wie im Methodenteil beschrieben, dies hängt von der Art des Experiments durchgeführt, und die erwarteten Mechanismus der Wirkung der Testverbindung. Zum Beispiel für die Prüfung der Auswirkungen Cisaprid, einem 5HT4-Rezeptor-Agonist, auf die Blasenstreifen (Abbildung 6), setzen wir die Amplitude der EFS-evozierte Kontraktion zu ~ 50% der maximal. Dies wurde auf dem bekannten Wirkmechanismus der 5HT4-Rezeptor-Agonisten, nämlich Verbesserung der ACh-Freisetzung aus den pre-Junction-Parasympathikus 27, die wiederum erwartet EFS hervorgerufenen Kontraktionen erhöhen basiert. Stimulation von Muskel gegen Nerven sollten mit TTX, die neuronale Übertragung hemmt und somit sollte EFS hervorgerufenen Kontraktionen hemmen, getestet werden. Angemessene Kontrollen für Fahrzeug und time muss während der Drogentests, um die Verschlechterung des Gewebes mit der Zeit zu berücksichtigen und für mögliche Auswirkungen des Fahrzeugs durchgeführt werden. Beispielsweise werden viele Arzneimittel in DMSO oder Ethanol gelöst. Unsere Daten (6) zeigen, dass DMSO (0,1% und höher) neural hervorgerufenen Kontraktionen erhöhen, ein Effekt, der aus der Wirkung des Testarzneimittels subtrahiert werden muss. Ebenso Ethanol (bis 1%) reduziert die spontane Kontraktionen der glatten Muskulatur, aber hat keinen Einfluss auf neural hervorgerufenen Kontraktionen 34,35. Bei der Verwendung von gentechnisch veränderten Tieren oder chirurgische Modelle (zB Rückenmarksverletzung oder Eierstockentfernung), sollten Kontrollen gehören Gewebe aus dem entsprechenden Hintergrund-Mausstamm oder Schein-operierten Tieren auf. Darüber hinaus sind einige Gewebe, wie Mensch, Maus und Meerschweinchen Blasen enthalten intramuralen Ganglien. Bei der Arbeit mit diesen Geweben, müssen Protokollauswahl und Interpretation der Daten berücksichtigt Wirkungen von Medikamenten oder EFS auf intra-ne nehmenUrone, die weitere Anreize für die glatte Muskulatur.
Gestaltung des experimentellen Protokolls, die Wahl der richtigen Parameter (EFS für Arzneimittelstimulation) und Konzentrationen getestet werden sollen kritische aussagekräftige Daten zu gewährleisten. Während Parameter sollten für die einzelnen Gewebe und Drogen, die allgemeinen Grundsätze angepasst werden / unten aufgeführten Richtlinien gelten. Kumulative Konzentrations-Reaktions-Kurven sind wünschenswert, jedoch ist dies nicht für alle Verbindungen. Medikamente gegen Rezeptoren, die zu desensibilisieren, wie die purineric ionotropen Rezeptoren (P2X), oder Medikamente, die schnell in das Gewebe (Beispiel ACh) metabolisiert werden, nicht zuverlässig unter Verwendung kumulative Konzentrations-Antwort-Kurven im gleichen Gewebe getestet werden. In diesen Fällen werden die einzelnen Konzentrationen in verschiedenen Gruppen von Gewebe getestet. Desensibilisierung zu bewerten, ist es empfehlenswert, die Größe der Reaktion durch eine einzige höchste Konzentration an, dass am Ende einer kumulativen Konzentration erreicht wird ausgelöst vergleichenAntwort-Kurve.
Für eine genaue Anpassung der aus Konzentrations-Wirkungskurven gewonnenen Daten ist es wünschenswert, halblogarithmischen Konzentrationen (Beispiel CCh in 6) zu testen. Allerdings sind log-Konzentrationen (zB NMB in Abbildung 4A) akzeptabel, wenn die Lebensfähigkeit des Gewebes kann begrenzt werden oder andere Einschränkungen können vorhanden sein.
Um einen Konzentrationsbereich für eine neue Verbindung auszuwählen, in Vorversuchen, ist es sinnvoll, die Bindungsaffinität der Verbindung und Test zwei Leistung von 10 oberhalb und unterhalb dieser Konzentration zu berücksichtigen. In nachfolgenden Experimenten wird das Protokoll verfeinert, um einen Startpunkt in dem keine Wirkung des Medikaments beobachtet wird, und einen Endpunkt, wenn entweder die Antwort maximalen oder der getesteten Konzentration ist nicht mehr die für das vorgesehene Ziel zu bestimmen.
A) Zeit für eine: Das Zeitintervall für die Anwendung eines Arzneimittels sollte unter Berücksichtigung mehrerer Faktoren gewählt werdenMedikament zu wirken. In der Regel Medikamente gegen Membranrezeptoren haben eine relativ schnelle Reaktion (Sekunden bis Minuten), während Medikamente für die intrazelluläre Ziele (zB Forskolin und andere Enzyminhibitoren 36, Botulinumtoxin 37) erfordern zusätzliche Inkubationszeit (30 min - 3 h). Zusätzlich können Gewebedicke eine Rolle spielen. b) Dauer und Wirkungsmechanismus der Droge. Für die Fälle, wenn die Arzneimittelwirkung eine Hochebene, die nachhaltig ist, wie NMB in 4A und Cisaprid in 6 erreicht, sind die Zeitintervalle von 5-15 min zwischen Drogen Anwendungen ausreichend für das Sammeln von ausreichend Daten. Dies ist nicht mit Medikamenten, die eine viel kürzere Wirkdauer oder anderen Wirkmechanismus (ATP, CCH) möglich. Zum Beispiel die Wirkung von CCH 4C oder 4D, ein Plateau erreicht schnell, aber die Gewebespannung neigt dazu, zu den Ausgangswerten zurück. In diesem Fall müssen die Zeitintervalle entsprechend angepasst werdenly, gewöhnlich, indem sie das nächste Konzentration, wenn die erste Reaktion ein Maximum erreicht.
Datenanalyse, insbesondere die Normalisierung der Daten, um Vergleiche zwischen den Streifen zu ermöglichen ist ein sehr wichtiger Schritt. Verschiedene Studien verwenden unterschiedliche Parameter für die Normalisierung, einschließlich Bandgewicht 38, Bandquerschnittsfläche 39, KCl Reaktion 12% der maximalen Antwort oder 28% der maximalen Reaktion gegenüber anderen Kontraktionsmittel (zB CCh 38). Normalisierung der Parameter sollte in Abhängigkeit vom Zweck des Experiments ausgewählt werden, so daß der Parameter nicht durch die Testverbindungen, Pathologie oder Versuchsentwurf beeinflussen. ZB Normalisierung KCl Reaktion beseitigt das Gewicht und andere Abmessungen der Streifen und somit verwendet werden, um Reaktionen in Geweben zu vergleichen, wo pathologische Zustand kann das Gewicht der Streifen (beispielsweise erhöht Diabetes Blasenmasse) zu erhöhen. Darüber hinaus ist die WiederReaktion auf KCl nicht durch die Entfernung der Schleimhaut / Urothel 29 beeinflusst wird, könnte daher in Versuchen Bewertung verschiedener Bauteile der Blase (zB Schleimhaut gegen glatte Muskulatur) verwendet werden.
Zusammenfassend stellt diese Methode eine Kontraktilität schnell, einfach und sehr leistungsfähigen Ansatz zur Blase (und andere Orgel) Physiologie und Pharmakologie zu bewerten. Wenn sie richtig eingesetzt wird, bietet es die Möglichkeit, Gewebe in einer reduzierten und gut kontrollierten Umgebung zu manipulieren. In der Studie der Harnblase Funktion wurde diese Methode dazu bei der Entdeckung und Prüfung von Verbindungen, die derzeit für OAB Management, wie beispielsweise die Antimuskarinika und neu β 3 AR-Agonisten entwickelt.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von NIH R37 R01 DK57284 DK54824 und Zuschüsse an LB unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Tissue Bath System with Reservoir | Radnoti, LLC | 159920 | isolated tissue baths |
| Warm water recirculator pump | Kent Scientific Corporation | TPZ-749 | to keep tissue baths to 37 °C |
| Computer | |||
| Data Acquisiton System | DataQ Instruments | DI-710-UH | To view, record and analyze data |
| Transbridge Transducer Amplifier | World Precision Instruments | SYS-TBM4M | Transducer amplifier |
| Grass stimulator | Grass Technologies | Model S88 | Stimulator |
| Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | ACV-1205S | To anesthetesize the animal |
| Anesthetizing Box | Harvard Apparatus | 500116 | To anesthetesize the animal |
| Anesthesia Masks | Kent Scientific Corporation | AC-09508 | To anesthetesize the animal |
| Materials and Surgical Instruments | |||
| Sylgard | Dow Corning Corp | 184 SIL ELAST KIT | To pin, dissect, & cut tissue |
| Petri Dish | Corning | 3160-152 | To dissect/cut tissue |
| Insect Pins | ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins | Size 5 | To pin tissue |
| Bench Pad | VWR International | 56617-014 | Absorbent bench underpads |
| Rat surgical Kit | Kent Scientific Corporation | INSRATKIT | To remove and dissect tissue |
| 2 Dumont #3 Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500064 | To remove and dissect tissue |
| Tissue Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500092 | To remove and dissect tissue |
| Scalpel | Kent Scientific Corporation | INS500236 | To remove and dissect tissue |
| Scalpel blade | Kent Scientific Corporation | INS500239 | To remove and dissect tissue |
| Professional Clipper | Braintree Scientific, Inc. | CLP-223 45 | To remove fur |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Tie tissue |
| Tissue Clips | Radnoti, LLC | 158802 | Attach tissue to rod/transducer |
| 1 g weight | Mettler Toledo | 11119525 | For transducer calibration |
| Chemicals | |||
| Krebs Solution: Sodium chloride Potassium chloride Monobasic potassium phosphate Magnesium sulfate Dextrose Sodium bicarbonate Calcium chloride Magnesium chloride |
Sigma Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma EMD Baker |
S7653 P217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444 |
To prepare Krebs solution |
| Isoflurane | Henry Schein | 029405 | To anesthetesize the animal |
| Oxygen tank | Matheson Tri Gas | ox251 | To use with anesthesia system |
| Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide) | Matheson Tri Gas | Moxn00hn36D | To aerate Krebs solutions |
References
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