膀胱平滑肌条收缩力作为评估下尿路药理学的方法

摘要

本文介绍了一种简单而高效的方法， 体外 评估平滑肌在药物作用或神经刺激下收缩功能的方法。主要应用于药物筛选以及组织生理学和药理学研究 和病理学。

摘要

我们描述了一种 体外 测量膀胱平滑肌收缩力的方法及其在研究平滑肌生理学与药理学特性以及病理诱导变化中的应用。该方法为理解膀胱功能提供了关键信息，同时克服了在研究过程中遇到的主要方法学难题 体内 实验，例如影响制备物稳定性和存活率的手术和药物干预、人体组织的使用和/或昂贵化学品的使用。它还提供了一种研究膀胱各个组分特性的方法即 平滑肌、黏膜、神经在健康与病理状态下的表现。

将麻醉动物的膀胱取出后置于克雷布斯（Krebs）溶液中，并切成条状。将组织条放入盛有温热克雷布斯溶液的浴槽中，一端连接等长张力传感器以测量收缩力，另一端固定于固定杆上。可通过直接向浴槽中添加化合物，或通过电场刺激电极激活神经来刺激组织，从而诱发膀胱收缩，模拟生理条件下的收缩反应 体内我们展示了该方法在评估发育过程中以及实验性脊髓损伤后自发性平滑肌收缩功能方面的应用，包括神经传递的性质（所涉及的神经递质和受体）、调节平滑肌活动的相关因素、膀胱各组成部分的作用，以及不同物种和器官对药理学试剂反应的差异。此外，该方法还可用于研究平滑肌收缩和/或舒张过程中涉及的细胞内信号通路、药物结构-活性关系以及神经递质释放的评估。

的 体外 平滑肌收缩性测定方法已广泛应用50余年，其提供的数据极大地增进了我们对膀胱功能的理解，并推动了目前临床用于膀胱管理的药物化合物的开发。

引言

膀胱平滑肌通过舒张实现尿液储存，并通过收缩引发排尿。舒张过程由平滑肌的内在特性以及交感神经持续释放去甲肾上腺素（NE）介导，后者激活逼尿肌中的β肾上腺素能受体（人类为β₃AR）。排尿则通过抑制交感神经输入并激活副交感神经实现，副交感神经释放乙酰胆碱（ACh）和三磷酸腺苷（ATP）以引起膀胱平滑肌收缩¹。多种病理状态，包括脑和/或脊髓损伤、神经退行性疾病、糖尿病、膀胱出口梗阻或间质性膀胱炎，均可显著改变膀胱功能，对患者的生活质量造成严重影响²。这些疾病通过影响膀胱的一个或多个组成部分——平滑肌、传入或传出神经和/或黏膜——来改变平滑肌的收缩能力。

多个 体内 和 体外 研究膀胱功能的方法已经得到开发。 体内，膀胱测压是评估膀胱功能的主要方法。尽管这是一种完整的制备方法，可在接近生理条件下收集信息，但在某些情况下更倾向于使用平滑肌条。这些情况包括外科和/或药物干预可能影响整体组织存活率和稳定性的场合 体内 制备，或当研究需要使用人体组织或昂贵化学品时尤为适用。该方法还有助于考察药物、年龄和病理因素对膀胱各组成部分的影响， 即 平滑肌、黏膜、传入神经和传出神经

多年来，许多研究团队采用膀胱条组织来回答一系列科学问题。这些组....

方案

本文所述所有操作程序均已获得匹兹堡大学动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 溶液

1. 根据配方配制 Krebs 溶液。成分（单位：mM）：NaCl 118，KCl 4.7，CaCl₂ 1.9，MgSO₄ 1.2，NaHCO₃ 24.9，KH₂PO₄ 1.2，葡萄糖 11.7。
2. 用 95% O₂ 和 5% CO₂ 饱和 Krebs 溶液，并将其置于 37 ºC 水浴中，供整个实验过程中使用。另取约 200 ml 已饱和的 Krebs 溶液置于室温下，用于组织解剖。
3. 测定饱和 Krebs 溶液的 pH 值（约 7.4）和渗透压（约 300 mOsm）。

2. 实验装置（示意图1A）

1. 用10 ml Krebs溶液填充通气（95% O₂，5% CO₂）的腔室。
2. 启动循环水泵，将腔室加热至37 °C；打开必要的设备：放大器、刺激器和记录软件。
3. 使用1 g砝码校准换能器。

3. 组织（图1B）

结果

自发性肌源性活动

自发性肌源性活动是平滑肌的一个重要特征，会随着出生后发育^6-9和病理状态（例如，脊髓损伤（SCI）、膀胱出口梗阻（BOO））^3-5而发生变化。由于这种活动被认为与膀胱过度活动症（OAB）的症状相关²，因此研究调控该活动的受体、细胞内信号通路及药理学因素，对于开发治疗OAB及其他平滑肌功能障碍的有效疗法具有重要意义。本文所介绍的方法可便捷地探讨上述问题。图2展示了新生期（i）、幼年期（ii）、成年期（iii）以及脊髓损伤大鼠（SCI；iv）在发育过程中肌源性自发性活动的不同模式。来自新生大鼠的肌条表现出大振幅、低频率的节律性收缩（图2Ai），而成年大鼠的肌条则表现为小振幅、高频率的活动（图2Aii, iii）。脊髓损伤后，新生期的活动模式重新出现（图2Aiv）。除了使用动物模型的肌条外，还可利用多种药理学试剂诱导未经.......

讨论

本文中，我们描述了一种简单的方法 体外 一种可用于研究膀胱生理学与病理学中多个重要科学问题的平滑肌收缩力检测方法，同时有助于发现治疗膀胱功能障碍的新药物。我们已通过该方法展示了其在评估膀胱平滑肌收缩力的发育特性、病理变化及药理学特性方面的应用图2-4），神经传递调节（图5-7A），物种差异（图4），器官差异（图6）以及特定膀胱组分的相关性（例如黏膜 图7B）。此处未展示的其他应用包括使用药理学试剂评估细胞内信号通路^3,10,11，不同药物的构效关系^22-24或神经刺激后递质释放的评估/定量²⁵.

尽管膀胱功能最终可能被评估 体内，这一点 体外 该方法克服了诸多棘手的情况 体内这些情况包括外科手术和药物干预会降低器官或动物的存活率或生存能力时、使用人体组织时，以及.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
设备
带储液罐的组织浴系统	Radnoti, LLC	159920	离体组织浴
温水循环泵	Kent Scientific Corporation	TPZ-749	将组织浴槽保持在 37 °C
计算机
数据采集系统	DataQ Instruments	DI-710-UH	用于观察、记录和分析数据
跨桥换能器放大器	World Precision Instruments	SYS-TBM4M	换能器放大器
Grass 刺激器	Grass Technologies	Model S88	刺激器
麻醉系统	Kent Scientific Corporation	ACV-1205S	麻醉动物
麻醉箱	哈佛仪器	500116	麻醉动物
麻醉面罩	Kent Scientific Corporation	AC-09508	麻醉动物
材料与手术器械
Sylgard	道康宁公司	184 SIL ELAST KIT	固定，解剖， &并切割组织
培养皿	康宁	3160-152	解剖/切割组织
昆虫针	ENTOMORAVIA Austerlitz 昆虫针	5号	固定组织
实验台垫	VWR International	56617-014	吸水实验台垫
大鼠手术器械包	Kent Scientific Corporation	INSRATKIT	组织的取出与解剖
2 把 Dumont #3 镊子	Kent Scientific Corporation	INS500064	组织的取出与解剖
组织镊	Kent Scientific Corporation	INS500092	去除并解剖组织
手术刀	Kent Scientific Corporation	INS500236	组织的取出与解剖
手术刀刀片	Kent Scientific Corporation	INS500239	组织的取出与解剖
专业修剪器	Braintree Scientific, Inc.	CLP-223 45	去除毛发
缝合线	精细科学工具	18020-50	结扎组织
组织夹	Radnoti, LLC	158802	将组织固定于杆/换能器上
1 g 砝码	Mettler Toledo	11119525	用于换能器校准
化学品
Krebs 溶液： 氯化钠 氯化钾 磷酸二氢钾 硫酸镁 葡萄糖 碳酸氢钠<膀胱平滑肌收缩力的体外测定方法及其在生理学、药理学及病理学研究中的应用> 氯化钙 氯化镁	Sigma Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma EMD 贝克	S7653 P217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444	配制 Krebs 溶液
异氟烷	Henry Schein	029405	麻醉动物
氧气罐	Matheson Tri Gas	ox251	用于麻醉系统
Carbogen气罐（95%氧气；5%二氧化碳）	Matheson Tri Gas	Moxn00hn36D	为 Krebs 溶液通气