Summary
Bu yazıda, farmakolojik ajanlar ve sinir uyarımına tepki olarak, düz kas kasılmalarını değerlendirilmesi için bir in vitro yöntem, bir basit, ancak güçlü sunar. Ana uygulamalar ilaç tarama ve anlayış doku fizyoloji, farmakoloji, patoloji ve vardır.
Abstract
Biz, bir in vitro mesane düz kas kasılmasını ölçmek için bir yöntem, ve fizyolojik ve farmakolojik düz kas özellikleri yanı sıra patoloji ile uyarılan değişiklikler araştırmak için kullanımını tarif eder. Bu yöntem, cerrahi ve farmakolojik preparatların istikrar ve sağkalımı etkilediği manipülasyonları, insan dokusunun kullanılması ve / veya pahalı kimyasalların kullanımı gibi in vivo deneylerde karşılaşılan başlıca metodolojik zorlukları, üstesinden gelirken, mesane fonksiyonlarının anlaşılmasına önemli bilgi sağlar. Aynı zamanda sağlıklı ve patolojik koşullarda her mesane bileşenin (yani düz kas, mukoza, sinirler) özelliklerini araştırmak için bir yol sağlar.
Mesane, bir anestezi verilen hayvanın, Krebs çözeltisi içine yerleştirildi ve şeritler halinde kesilir kaldırılır. Şeritler Krebs çözeltisi ile sıcak doldurulmuş bir odacığm içine yerleştirilir. Bir ucu bir izometrik tensio bağlı olduğubüzülme kuvveti ölçmek için n, dönüştürücü, diğer uç, sabit bir çubuk takılır. Doku doğrudan banyosuna veya in vivo mesane kasılmaları tetikleyen benzer sinirleri aktive elektrik alan uyarımı elektrotlar tarafından bileşikler ekleyerek uyarılır. Bu yöntemin kullanılması, gelişme esnasında ve deneysel omurilik yaralanması sonrası kendiliğinden düz kas kontraktilitesini değerlendirmek göstermektedir, nörotransmisyon (ilgili vericileri ve alıcıları), yumuşak kas aktivitesinin modülasyonunda rol oynayan faktörler doğası, tek tek bileşenlerin mesane rolü, ve türleri ve farmakolojik maddelere yanıt organ farklılıklar. Buna ek olarak, verici serbest kalmasına ve / veya düz kas gevşemesi, ilaç yapı-aktivite ilişkileri ve değerlendirme dahil olan hücre içi yolları araştırmak için kullanılabilir.
In vitro olarak, düz kaslar yöntemi yaygın olarak kullanılmaktadır fo50 yıldır r ve önemli ölçüde mesane fonksiyon anlayışımıza yanı sıra halen mesane yönetimi için klinik olarak kullanılan bileşiklerin ilaç gelişmesine katkıda veriler sağlamıştır.
Introduction
Mesane düz kas idrar eleme ortaya çıkarmak için idrar depolamaya izin vermek için gevşer ve sözleşmeler. Gevşeme içsel düz kas özellikleri ile ve detrusor beta adrenerjik reseptörleri (β insan 3 AR) aktive sempatik sinirler norepinefrin (NE) tonik salınımı, aracılık eder. Işeme sempatik girişini engellemek ve ACh / ATP mesane düz kasını 1 sözleşme için serbest parasempatik sinirleri aktive ederek elde edilir. Beyin ve / veya omurilik yaralanması, nörodejeneratif hastalıklar, diyabet, mesane çıkım tıkanıklığı veya interstisyel sistit gibi çeşitli patolojik durumlar, derinden hayatın 2 hastanın kalitesi üzerinde ciddi etkileri olan, mesane fonksiyon değiştirebilir. Düz kas, afferent ve efferent sinirleri ve / veya: Bu koşullar, bir veya daha fazla bileşen mesane etkileyerek düz kasının kasılma kuvveti üzerinde etkisimukoza.
In vivo ve mesane fonksiyonu çalışma için birkaç in vitro yöntemler geliştirilmiştir. In vivo sistometri mesane fonksiyon temel ölçüsüdür. Bu fizyolojik koşullara yakın altında bilgileri toplama sağlayan bir sağlam hazırlanması olsa da, yumuşak kas şeritlerin kullanımı tercih edildiği durumlar da vardır. Bu, cerrahi ve / veya farmakolojik manipülasyonlar hayatta kalmasını ve in vivo preparasyonun stabilitesini veya etkileyebilecek durumlara dahil çalışmalar, insan doku veya pahalı kimyasal maddelerin kullanılmasını gerektirir zaman. Bu yöntem, aynı zamanda, mesane her bir bileşeninin ilaçlar, yaş ve patoloji etkilerinin incelenmesini kolaylaştırmaktadır, düz kas, mukoza, afferent ve efferent sinirleri yani.
Mesane şeritler bilimsel bir dizi soru cevap birçok grup tarafından yılda istihdam edilmiştir. Bunlar eva için kullanıldımiyojenik spontan aktivitede bir değişiklik ölçmek üze- re patoloji ile indüklenen. Bu aktivite aşırı aktif mesane (AAM), aciliyeti ve sıklığı, belirtilere katkıda bulunduğuna inanılan ve bu nedenle AAM 3-9 için geliştirilen ilaç için bir hedef olduğunu. Mesane şeritler de rahatlama ya da düz kas kasılmasını ya ikna etmek için hedef olabilir iyon kanalları ve / veya reseptörleri ve / veya hücre içi yollar keşfetme amacı ile düz kas tonusunu modüle myojenik ve nöronal faktörleri araştırmak için kullanıldı 3,10- 13. Diğer çalışmalar patoloji 14,15 tarafından uyarılan vericileri ve ilgili reseptörleri ve değişiklikler de dahil olmak nörotransmisyonun doğasına odaklanmıştır. Buna ek olarak, yöntem, organ 19-21 ve ilaç yapı-aktivite ilişkisinin değerlendirilmesi 22-24 arasında, farklı türlerdeki 16-18'den dokular arasındaki karşılaştırmalar için kullanılmıştır. Bu yöntemin bir uzantısı MEASUR için kullanılmıştırefferent sinirler 25 yerden verici salınımı üzerindeki ilaçların etkisini e. Ayrıca, dokuların (mesane, üretra, gastrointestinal sistem, GI) (araştırma için onaylanmış ameliyatlar veya organ donör dokudan), insan veya hayvan hasat ve spinal kord yaralanması (SKY), mesane çıkım tıkanıklığı dahil olmak üzere hayvan modellerinde çeşitli çeşitli (BOO), veya interstisyel sistit (IC) bu tekniği kullanılarak incelenmiştir edilebilir.
Bu yazıda yukarıda belirtilen çeşitli bilimsel soruları için gerekli deneysel protokolleri ile birlikte bu yöntemin kullanımı, göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm prosedürler Pittsburgh Üniversitesi IACUC komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Çözümler
- Reçeteye göre Krebs çözeltisi hazırlayın. NaCl 118, KCl 4.7, CaCl2 1.9, MgSO 4 1.2, NaHCO3 24.9, KH 2 PO 4 1.2, dekstroz 11.7: mM Kompozisyon.
- % 95 O2,% 5 CO2 ile Krebs havalandırır ve deney boyunca kullanılmak üzere bir 37 ° C su banyosu içine koyun. Bir yana koyun, oda sıcaklığında gece havalandırılmış Krebs çözeltisi 200 ml doku diseksiyon için kullanılır.
- Havalandırılmış Krebs pH (~ 7.4) ve ozmolariteyi (~ 300 mOsm) ölçün.
2. Deney Seti-up (şematik Şekil 1A)
- (% 95 O2,% 5 CO2) 10 ml Krebs ile gaz odaları doldurun.
- 37 ° C'ye kadar ısıtmak için odaları su sirkülasyon pompası başlanması; gerekli ekipman açın: amplifikatör (ler), uyarıcı (ler) ve kayıt yazılımı.
- 1 g ağırlık çeviricilerine kalibre.
3. Doku (Şekil 1B)
: Aşağıdaki adımları; (~ 10-12 haftalık 200-250 gr) bir yetişkin naif dişi Sprague Dawley sıçanın kesesi çıkarın
- Diseksiyon alanı ve gerekli araçları hazırlayın: elektrikli tıraş, diş forseps, neşter bıçak, kesme makasları, Microscissors, iki diseksiyon forseps, doku klipleri (veya ipek dikiş), Krebs ile Sylgard kaplı diseksiyon çanak (yazarlar Dumont forseps # 3 tercih) doku diseksiyonu pimleri.
- Indüksiyon odasında izofluran inhalasyonu (O 2% 4) ile hayvan anestezisi. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözlerin veteriner merhem kullanın. Sürekli solunum hızını, dış uyaranlara yanıt, ve refleks çekilme arka uzuv kaybı gözlemleyerek anestezi düzeyini izlemek.
- Hayvan tıraş alt karın bir anestezi zamanrea. Bir orta hat karın kesi yoluyla pelvik organların maruz. Mesane ve üretra tanımlayın. Proksimal üretraya yakın mesane boynu kesilerek kesesi çıkarın. Havalandırılmış Krebs çözeltisi ile doldurulmuş Sylgard kaplı çanak hemen doku yerleştirin.
- Gerekirse, bu zamanda ek doku kaldırmak: üretra, gastrointestinal (Gl) sistemi ve / veya prostat parçaları, vs
- IACUC onaylanmış yöntemler (örneğin, anestezik doz aşımı ya da bir ikincil yöntem izledi CO 2 boğulma) kullanarak hayvan kurban.
- Daha fazla diseksiyon için doku stabilize, mesane kubbesi, boyun ve üreterler yoluyla doku kesme işaretçilerine yerleştirin. Doku germeyin. Yağ, bağ dokusu, proksimal üretra ve üreter varsa çıkarın.
- Düz bir sayfası oluşturmak için kubbeye tabanından mesane açın, serozayı tarafı aşağı / lümen tarafı yukarı (Şekil 1B). Doku her köşesinde kesme işaretçilerine yerleştirin. Mesane dom KaldırE ve boyun doku.
- Deneyin amacı mukozasında (ürotelyum ve lamina propria - diyagram Şekil 1C bakınız) katkısını belirlemek için ise düz kas kasılması için, ile ve ekli mukozasında olmadan detrüsör şeritler özelliklerini karşılaştırın. Bunun için, şeritler dokusunun kesilmesi öncesinde, dikkatli bir şekilde, iris bir tahlil mikroskobu altında makas ve ince forseps yay kullanarak mukoza tabakasının çıkarın. Deneyin sonunda, mukoza tamamen çıkarılmasını teyit etmek için H & E boyaması için şeritler sabitleyin. Bu prosedür, fare mesane daha fare mesane daha kolay olduğuna dikkat edin.
- ~ 2 x 8 mm (Şekil 1B) şeritler halinde kubbe tabandan boyuna doku kesilir. Kravat ya da her şeridin iki ucunda bir doku klip ekleyin.
NOT: Bir fare mesane, genellikle 4 şeritler halinde kesilebilir, ancak dilimlerin sayısını artırabilir veya azaltmak hayvan / mesane boyutuna bağlı olarak değişir. - Exper şerit aktarmaimental odaları. Bir doku kasılmasını ölçen bir kuvvet transformatörüne, her bir şeridin ucunu, sabit bir cam / metal çubuğun diğer takın.
Not: Doku odaları boyutu (20 mi ya da daha büyük 0.2 mi) değişir. Kemirgen mesanesi için tipik odaları şeritler tamamen solüsyona daldırılır edilmesi için yeterli bir yükseklik sağlamak 5-20 mi vardır. Bazı odaları yerleşik uyarım elektrotları, başkaları ile değil gelir. Bakım türlü elektriksel alan stimülasyonu güvenilir değildir, tüm elektrotların bağlantıları iyi durumda olmasını sağlamak için alınmalıdır. - Temel tansiyon, 1 g (~ 10 mi) içindeki ulaşıncaya kadar yavaşça doku germe her şerit kuvvet belirli bir miktarda uygulanır. Başlangıçta doku başlangıç gerilmesinde bir azalma olarak kaydedildiği dinlenmek eğilimindedir. Yıkama doku yaklaşık ve sıcak gazlı Krebs kullanarak her 15 dk her yıkamadan sonra 1 g temel gerginliğini ayarlayın. (Temel tansiyon istikrarlı doku ~ için 1-2 saat kadar ya da gelmesini sağlayınyani başka doku gevşeme).
- ~ 5 dakika için ya da bir plato yanıt kadar banyoya doğrudan KCI (80 mM) eklenerek test dokusu canlılığı ulaşılır. KCI yüksek konsantrasyonlarda yanıtlar da deney sırasında ya da deneyin sonunda tekrarlanır ve (veri analiz bölümü altında normalleştirme bakınız) şeritler diğer ilaçlara yanıtları arasında ya da normalize etmek için kullanılabilmektedir.
- Sıcak gazlı Krebs ile yıkayın doku birden çok kez (3-5x) doku ön arıtma koşulları dönmek için izin vermek.
4. Stimülasyon Protokolleri
- SCI, Yİ, veya yenidoğanlarda gibi farklı hayvan modellerinde düz kas şeritleri kullanmak, spontan myojenik aktivite veya düz kas tonusu üzerinde patoloji etkilerini araştırmak. Şekil 2 gelişimi sırasında mesane spontan aktivite değişiklikleri araştırmak amacıyla bu yöntemin kullanımını göstermektedir ve SKY sonrası. Buna ek olarak, çeşitli ilaç sp modüle etmek için de kullanılabilirontaneous faaliyet. Şekil 3, spontan aktivite ve düz kas üzerindeki KCNQ kanal modülatörlerinin, flupirtinin ve XE991, etkisini göstermektedir.
- Doğrudan belirlenen zaman aralıklarında banyosuna konsantre stok çözeltilerinden bileşiklerin ilave edilmesi ile, farmakolojik düz kas uyarımı konstrukt konsantrasyon yanıt eğrileri için. Araç ve zaman etkilerinin hesaba paralel şeritler halinde ilaç ve araç kullanın.
- 1000x son çalışma konsantrasyonu istenilen Test bileşiklerinin stok çözeltileri hazırlanır. 10 5 M, 3 x 10 5 M, 10 4 M, 3 x 10 4 M, 10 3 M, 3 x 10 3 M: karbakol (CCH), bir muskarinik reseptör agonisti, aşağıda stoklarını 10 -2 M. Banyosu içinde nihai konsantrasyonlar 10 -5 M (Şekil 4C, D) ile 10 M -8. 10 -8 M, 10 -7: neuromedin B (NMB'de), bir bombesin reseptör alt 1 agonisti için aşağıdaki stokları hazırlamakM, 10 -6 M, 10 5 M, 10 4 M, 10 3 M ve banyo içinde nihai konsantrasyonlar olarak 10 -11 M'ye 10 -6 M CCh ve NMB Hem doku kasılmasını artması beklenmektedir.
- Bu cevap, bir plato (Şekil 4C, D) ulaşana kadar bir 10 ml doku banyosuna için, kısa sürede her CCh stok çözeltisinden 10 ul ekle. Paralel şeritler halinde, taşıyıcının (su) eşit bir şekilde artırmıştır. Benzer şekilde, her neuromedin B stok çözeltisi 10 ul her ~ 5 dakika ekleyin.
NOT: Şekil 4 farklı türlerden şeritler halinde düz kas tonusu üzerinde NMB'de ve CCH uyarıcı etkisini gözlemleyin. - Bir uyarıcı madde, genellikle CCH veya KCl ile ön-sözleşmeli dokuda düz kasların gevşemesi özelliklerini incelemek.
- Bir agonist tepkisini bloke etmek için, stimülasyon Agonisti önce doku penetrasyonu izin vermek için antagonisti ile 10-20 dakika boyunca ön-işleme tabi doku.
- Sinir stimülasyonu içindüz kas simülasyonu olarak da adlandırılan elektrik alan uyarımı (EFS) 3.13 adım 1 ila takip ve aşağıda açıklandığı gibi devam edin. EFS, seçici olarak düz kas sinirlerinin karşı aktif hale getirmek için tasarlanmıştır. Uyarılması için parametrelerin dikkatle doğrudan düz kas uyarmayı önlemek üzere seçilmelidir.
- Stimülasyon parametreleri Kurmak: Aşağıdaki adımlarda açıklanan ve Şekil 5A, B de gösterildiği gibi uyarıcı (tek darbeler veya trenler), süresi (darbe süresi ve tren süresi), sıklığı ve şiddeti, tipi.
- Tek darbe uyarım, seti darbe süresi, inter-uyaran aralığı ve istenen uyaranların sayısı için. Her zamanki stimülasyon süre parametreleri istenilen aralıklarla (Şekil 5A) teslim 0.05-0.3 msn süresince tek sinyallerdir. Uyaran yoğunluğu için adımı 4.3.1.4 izleyin.
- Tren uyarılması için, tren süresini ve inter tren aralığını ayarlayın. Mesane dokusu için tipik değerler 3-10 sn en az 1 m teslim edilirayrı olarak (Şekil 5B). Doku yorgunluk (yani EFS kasılmaları kontrol döneminde azalma) oluşursa, arası tren aralığını artırın.
- Bir tren bakliyat tren uyaranlara sıklığını (dizi Kurmak - Şekil 5B). 0.5-50 Hz arasındaki bir frekans tepkisi eğrisi. Kesesi için tipik frekans ATP ve ACh ile aracılık tekrar üretilebilir ve kararlı kasılmalar elde 10-20 Hz bulunmaktadır. Bu yöntem, kolinerjik ve sinirsel purinerjik mekanizmaların katkısını araştırmak için nasıl kullanılabileceğini gösteren Şekil 5 fare mesane şeritler EFS uyarısına frekansa bağımlı tepkiler dikkate alınmalıdır.
- Uyaranın şiddeti Kurmak: daralmanın genlik bir plato ulaşıncaya kadar (kullanarak trenler frekans sabit tutarsanız) sistematik uyaran yoğunluğunu (voltaj) artar.
- Bağlı olarak uyaran yoğunluğunu ayarlayınDeney hedefliyoruz. Amaç, nöral-uyarılmış kasılma artırmak için ise, o zaman kasılma büyüklüğü ~ maksimum kontraksiyonun% 50 olacak şekilde, submaksimal yoğunluğu kullanılır. Amaç, nöral-uyarılmış kasılma azaltmak için ise, daha sonra ~ en yüksek amplitüdde% 80 doku yorgunluğu önlemek için yoğunluğunu ayarlamak için.
- Stimülasyon parametreleri (süresi, sıklığı ve yoğunluğu) oluşturulduktan sonra, EFS- için 20-30 dk uyuşturucu testi öncesinde stabilize kasılmaları uyarılmış ~ izin verir.
NOT: (; 0.5-1 mcM TTX) sinir iletim, Na + kanal blokörü, tetrodotoksin'in blok sinir iletimi için EFS seçiciliği doğrulamak için. TTX nispeten kolay yıkar gibi, deney başında bu adımı gerçekleştirin. Buna ek olarak, (aşama 4.3.5 bkz. Aşağıda), deneyin sonunda bu gerçekleştirin. - Son işleme konsantrasyonları için 1,000x de stok çözelti hazırlayın: alfa, beta-metilen ATP (ABMA, purinerjik alıcı aktivatörüve desensitize edici) -2 10 E, atropin (muskarinik alıcı antagonisti) 3 M 10 (Şekil 5C). Şekil 6'da başka örnekler dikkate alınmalıdır. 5HT4 reseptör agonisti, sisaprid ile (3 x 10 -6 M, 10 -6 M, 3 x 10 5 M, 10 5 M, 3 x 10 4 M, 10 4 M, 3 x 10 -3 M, 10 -3 M), doku kasılma ve SB-203186 (3 x 10 -3 M), bir 5HT4 reseptör antagonisti artırır sisapridi etkilerini tersine çevirir.
- EFS (Şekil 5C) üzerindeki etkilerini ABMA atropin ve test edilmesi için, iki kontrol frekans tepkisi eğrileri gerçekleştirin. 10 uM'lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere banyo 10 -2 M ABMA 10 ul. Bu durum düz kas purinerjik reseptörlerinin doğrudan uyarılması doku küçülecek. Başlangıca yanıt döndükten sonra, frekans tepkisi eğrileri tekrarlayın. Son bir concentrat için 10 -3 M atropin 10 ul ekle1 uM'lik iyonu temsil etmektedir. (Muskarinik reseptörleri bloke atropin için gerekli) ~ 10 dakika, tekrar frekans tepkisi eğrileri sonra. Paralel şeritler halinde, her bir adımda, taşıyıcı olarak, su, 10 ul ekle.
Not: Şekil 6 'da, diğer örnekler için, tanımlı zaman aralıklarında (~ 15 dakikada; tartışmaya bakınız) her sisaprid stok çözeltisi 10 ul doğrudan banyoya SB-203186 stok solüsyonu, 10 ul ve ardından ve üzerindeki etkisini izlemek daralma EFS neden oldu. Paralel şeritler halinde, aracın, 10 ul DMSO ilave edin. Sisapridin etkilerini incelemek, Şekil 6 'da insan mesane karaciğer, akciğer dokularında EFS uyarılmış kasılma bir 5HT4 reseptör agonisti,. İlave olarak, insan mesane ve ileum dokularda EFS uyarılmış kasılmaları üzerindeki etkisini DMSO, sisapridin için araç, gözlemlemek . - EFS protokol sonunda Na + kanal blokörü, tetrodotoksin'in (TTx ile nöral iletimi bloke ederek EFS seçiciliğini doğrulamak; 0.5-1 &181. M). TTX dirençli kasılmalar hala varsa, daha sonraki deneylerde uyaran süresini ve yoğunluğunu ayarlamak için tavsiye edilir.
- Stimülasyon parametreleri Kurmak: Aşağıdaki adımlarda açıklanan ve Şekil 5A, B de gösterildiği gibi uyarıcı (tek darbeler veya trenler), süresi (darbe süresi ve tren süresi), sıklığı ve şiddeti, tipi.
- Öncesi veya post-sinaptik sitelerinde (Şekil 7A) ilaçların etkilerini belirlemek için 4.3.2 izleyin 1. Karbakole tekrarlanabilir yanıtları oluşturulması ve EFS, daha sonra uyuşturucu X eklemek
- Deneyin sonunda, sökülüp takılmasını veya şeritler çöz ekstra sıvı ortadan kaldırmak ve bir denge kullanarak her bir şeridin ağırlığı ölçmek için ince kağıt parçası üzerine nazikçe bekletin. Ayrıca, enine kesit alanı belirlemek için bir kumpas kullanılarak doku uzunluğunu ölçer. Bu bilgiler veri normalizasyonu için kullanılır (bölüm 5.4).
5. Veri Analizi
Yeterli yazılımını kullanarak verileri analiz (örneğin, Windaq, LabChart).
- Spontan aktivite için, önce ve ilaç kaynaklı yanıt ve beni zirvesine en az 30 saniye, bir pencere seçmekaşure genlik ve Miyojenik aktivite sıklığı (Şekil 3).
- Mesane farklı parçaları arasındaki farklar vardır yanıtları kasılma olup olmadığını katkıda frekansların spektrumunu belirlemek için hızlı Fourier dönüşüm analizi kullanın (örneğin, boyun vs kubbe) veya geliştirme, patoloji, ve uyuşturucu 8 ile.
- Düz kas üzerindeki etkiler için, önce ve ilaç uyarımlı tepkisinin zirvesine en az 10-30 saniyelik bir pencere seçmek ve büzülme genlik ölçmektedir.
- Nöral ile uyarılan kasılmaları üzerindeki etkiler için, önce ve ilaca bağlı yanıtının tepe noktasında kasılmaları eğrisi (en az 3) altında genlik, süresi ve alanı ölçer.
Not: Bu, purinerjik ve kolinerjik bileşenler farklı olan bir kinetiğe sahiptir, çünkü EFS uyarılan kasılmaların eğri altındaki alanı, hem de amplitüd ve ölçmek gereklidir. Purinerjik bileşen hızlı ve geçicidir (ATP purinergi aktivekalsiyum hızlı akışını izin veren bu P2X1 c iyonotropik kanallar, daha sonra bu şekilde, eğri altındaki alan en yüksek amplitüdü yanıt daha az katkıda) desensitize. Kolinerjik bileşeni (ACh sonuçta bir daralma ikna etmek düz kas depolarize iyon kanallarını aktive hücre içi yolları aktive daha fazla zamana ihtiyaç metabotropik muskarinik reseptörleri aktive) yavaş ve sürekli olduğunu. Dolayısıyla, muskarin ile ilgili bölümü eğri altındaki alanın ölçülmesi ve daha iyi yakalanır. - Şeritler ve farmakolojik tedavilerde sonuçlarını karşılaştırmak mümkün veri normalleştirmek. Normalleştirme için seçilen parametre patolojik durum, araştırma veya deney tasarımı, test bileşikleri ile etkilenmemelidir. Bu parametreler, kullanım şerit ağırlığına enine kesit alanı, KCI tepkisinin (Şekil 4B), bir kasılma ajana en yüksek tepkinin maksimum tepki (Şekil 7B) ve%% 'si arasında,(Örneğin, CCh) veya rahatlatıcı maddeler (örneğin, papaverin).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spontan andMyogenic Etkinlik
Spontan Miyojenik etkinlik sonrası gelişim 6-9 ve patoloji (örneğin, SCI, Yİ) 3-5 ile değişikliğe uğrar önemli bir düz kas özelliğidir. Bu aktivite aşırı aktif mesane (AAM), 2 belirtilerine katkıda inanılmaktadır çünkü, onu modüle reseptörleri, hücre içi yollar ve farmakolojik ajanların bir değerlendirme, AAM ve diğer düz kas fonksiyon bozuklukları için etkili tedaviler geliştirmek için yüksek ilgi olduğunu. . Burada sunulan yöntem kolaylıkla, yavru bu soruları araştırmak 2 neonatal (i) gelişimi sırasında Miyojenik spontan aktivite farklı desen göstermektedir Şekil olabilir (ii) yetişkin (iii) ve spinal kord yaralı sıçanlar (SCI, iv). Neonatal sıçanlarda Şeritler büyük bir genlik, düşük frekanslı ritmik kasılmalar (Şekil 2AI), sergilerken yetişkin sıçanın şeritlerolarak küçük genliği, yüksek frekanslı bir aktivite gösterdi (Şekil 2Aii iii) bulunmaktadır. SCI sonra yenidoğan desen (Şekil 2Aiv) yeniden ortaya çıkar. Hayvan modellerinden şeritler kullanmanın yanı sıra, çeşitli farmakolojik maddeler, kendiliğinden kasılmaları altında yatan mekanizmaların anlaşılması amacıyla, denenmemiş hayvanlarda ikinci şeritler spontan kontraksiyonları uyarılması için kullanılabilir. Uygun farmakolojik maddelerin örnekleri, muskarinik reseptör agonistleri (karbakol, CCh) içerir. (Örneğin, asetil kolinesteraz inhibitörleri) ACh seviyelerini arttıran bileşikler, KCI (örneğin 20 mM) veya diğer deneysel ilaçların düşük konsantrasyonlarda Şekil 3A-B, modülasyon açıklamaktadır düz kas bulunan KCNQ kanallarının üzerinde etkili farmakolojik maddeler ile spontan aktivite. KCNQ kanal açıcı, flupirtin, konsantrasyona bağımlı bir şekilde genlik ve spontan aktivite sıklığını azaltır (Şekil 3AI-III), whileKCNQ kanal tıkayıcı, XE991, genliğini düşürür spontan aktivite sıklığı artar (Şekil 3BI-III).
Düz Kas Ton
Düz kas tonu ve kontraktilite özellikleri depolama ve işeme sırasında mesane düzgün fonksiyonu için önemli faktörlerdir. Bu yöntem düz kas tonusu üzerinde farmakolojik ajanların etkilerini ekran kolayca yapabilirsiniz. Rakamlar 3Aiv ve 3Biv flupirtin, düz kas gevşemesi ile tutarlı bazal sesi, azaldığını gösteriyor XE991 artar düz kas tonu ise. 4 düz kas tonusu, konsantrasyon bağımlı artış göstermektedir Şekil neuromedin B ile bombesin reseptörlerinde aktif hale getirerek (NMB Şekil 4A, B) ya da muskarinik reseptörler karbakol ile (CCh, Şekil 4C, D). Ayrıca, bu düz kas yanıtları arabuluculuk içi yollar u araştırılabilirBelirli bir şarkı modülatörleri (veriler gösterilmemiştir).
Sinirsel aracılı Yanıtları ve Nörotransmisyon modülasyonu
Mesane daralma parasempatik efferent sinirler ACh / ATP salınımı ile elde edilir. Mesane daralma muskarinik ve purinerjik sistemlerinin katkısı bu tür interstisyel sistit, kısmi çıkış tıkanıklığı ve aşırı aktif mesane 26 gibi patolojilerin purinerjik katkısı baskın artış ile, türlerin ve patolojik durumlar arasında değişmektedir. Şekil 5C belirlemek için bu yöntemin kullanımını gösterir muskarinik ve purinerjik bileşenlerinin katkısı fare mesane şeritler sinirsel. Kolinerjik bileşenin katkısı, atropin, muskarinik reseptör antagonisti kullanılarak değerlendirildi. Purinerjik sisteminin katkısı purinerjik reseptör aktivatörü ve desensitize edici, alfa kullanılarak değerlendirildi, beta-metilen ATP (ABMA). Buna ek olarak, her bir bileşenin frekansa bağlı katkı düşük yüksek frekanslar için (2-50 Hz) için uyarım frekansı değiştirilerek değerlendirildi.
Mesane daralma gücü verimli işeme önemli bir rol oynamaktadır. Bu yöntemi kullanarak, sinir iletimini modüle reseptörleri ve yolları fonksiyon bozukluklarını işeme için ilaç hedefleri olarak incelenebilir. 5HT4 reseptörleri, parasempatik nöronlar ön junctionally ifade edilir ve bunların aktivasyonu ACh seviyelerini 27 artar. 6, insan mesane ve ileum şeritler 5HT4 reseptör agonisti, sisaprid, en uyarıcı etkisini göstermektedir.
Çeşitli deney protokolleri, bir test bileşiğinin etki alanını belirlemek için kullanılabilir. Şekil 7A'da şeması öncesi vs sonrası birleşim the değerlendirmek için kullanılan bir protokolü göstermektedir. İlaç X azaltır (veya artar) EFS yanıtı ama hiçbir effec varsaCCh yanıt t, eylem büyük olasılıkla sitesi ön-kavşak olduğunu. X, her iki ilaç değiştirmek, EFS ve CCH yanıt varsa, o zaman sonrası junctionally ya da her iki pre-ve post-junctionally bulunan reseptörleri üzerinde hareket edebilir.
Her Bileşen Rolü: Düz kas, mukoza ve Nöronal
Farklı patolojik durumlar, mesane çeşitli bileşenleri etkileyebilir. AAM değiştirilmiş düz kas kasılması sonuçlanabilir örneğin interstisyel sistit (IC) öncelikle ürotelyumu etkiler. Aynı zamanda, farklı reseptörleri her bir balon bileşeni olarak ifade edilebilir ve bu nedenle, özellikle belli bir patolojide hedeflenebilir. Mesane bileşenlerin net etkiyi elde in vivo yöntemler ile, farklı olarak, bu in vitro bir yöntem, cerrahi ve farmakolojik prosedürlerin bir kombinasyonu kullanılarak özel bileşenlerin soruşturma sağlar. Nöronal yokluğunda düz kas kasılması / gevşeme test etmek içiniletim TTX (0.5-1 uM) banyoya ilave edilebilir. Şekil 4'te, NMB ve CCH TTX varlığında test edildi. Düz kas kasılması için mukoza (ürotelyum ve lamina propriya) katkısını test etmek için, ve mukoza tabakası olmayan şeritler. Göre Şekil 7B CCH tepkiler domuz 28 mukozada varlığında azalmış olduğunu göstermektedir edilir. Benzer sonuçlar insan mesane şeritler 29 bildirilmiştir. Sinir liflerinin rolü test etmek için, pek çok yaklaşım alınabilir. Bir aktif ya da farmakolojik maddeler kullanılarak fiberleri inhibe etmektir. Örneğin, kapsaisin afferent sinirlerin belirli bir nüfusa aktif hale getirir ve türlere bağlı düz kas kasılması ve gevşemesi 17,18 neden olur. Guanetidin böylece bu liflerin katkı ortadan kaldırarak, sempatik liflerden norepinefrin salınımını inhibe eder. Diğer bir yaklaşım / duyarsız in vivo fiberleri ortadan kaldırmak içinDeneyden önce. Örneğin, kapsaisin ile hayvanın sistemik tedavi kapsaisin duyarlı afferent sinirlerin duyarsız. Bu hazırlık okudu edilebilecek diğer mesane parçalar aktive veya belirli maddeler ile bunları bloke ederek interstisyel hücreleri veya boşluk dezmozomlardır.
Türler Farklar
En çok ilaç geliştirme insanlardaki rahatsızlıkların tedavisinde kullanılmak üzere tasarlanmıştır olsa da, temel araştırmalar, temelde hayvan dokusundan yapılır. Türlere farklılıklar bir dizi reseptör bulunmaktadır. Örneğin, 5HT4 reseptör agonistleri insan mesane nöral-uyarılmış kasılmaları geliştirmek ancak sıçan mesane 19,30 olarak, EFS kaynaklı kasılmalar istikrarlı mesanelere 31 insan ve eski dünya maymun detrüsör neredeyse sadece atropin-duyarlı ama kısmen haline edilmez atropin dirençli insan detrüsör kararsız mesane koşulları (örneğin, nörojenik, obstructe olan hastalarınd mesaneler) 15,32,33, kapsaisin sıçan ve insan mesane şeritler bir uyarıcı tepki, domuz mesane şeritler ve kobay mesane şeritler 17,18 inhibitör yanıt yok yanıtı doğurur. reseptör agonistleri bombesin üzerinde uyarıcı etkilere sahiptir 4: Şekil sıçan mesane ve fare ve domuz mesane şeritler 16 üzerinde hiçbir etkisi. Bu bilgi özel bir reseptör çalışmaları için uygun bir hayvan modeli olarak seçilmesi için kritik öneme sahiptir.
Organların genelinde Duyarlılık Karşılaştırılması
Mesane bozukluklarının tedavi edilmesine yönelik ilaçlar aynı zamanda bu yöntem, yan farklı dokuların yan yana tutup karşılaştırarak bir farmakolojik ajan için organ seçiciliği ve duyarlılık tahminini sağlar vb gastrointestinal yol, idrar, safra kesesi gibi diğer organlarda düz kas etkileyebilir. Sisaprid Şekil 6, 5HT4 reseptör agonisti, gösterildiği gibi, farklı biriktirdiileum dokusu ile insan mesane ent etkinlik ve güç.
Deney düzeneği Şekil 1. deney düzeneği ve mesane şerit hazırlanması a.) Şematik. Mesane şeritler 37 ° gazlı Krebs çözeltisi ile dolu doku odalarına tutulur daldırılır Dolaşan su pompası vasıtasıyla ° C. Şeridin bir ucu sabit bir çubuk, diğer doku kasılma ölçmek için izometrik bir transdüktöre eklenir. Kuvvet dönüştürücü veri kaydı için bir amfi ve bilgisayara bağlı. Bir uyarıcısı bağlı elektrik alan uyarımı elektrotlar odası içine yerleştirilmiş ve nöral aracılı mesane kasılması için kullanılır. Şeritlerinin B) hazırlanması. Mesane bir tabak aşağı tutturulmuş ve aşağıdaki işlemler gerçekleştirilir: 1. dikey kesme thüretradan kubbeye mesane ough ventral yarısı düz bir levha içine mesane açın. # Mesane / proksimal üretra kubbe ve tabanını çıkarırken 2 yatay keser. . Şerit bileşenleri arasında eşit şeritler halinde orta mesaneyi bölünmesi 3 dikey kesimler (bir sıçan mesane 4 şeritler) C) Şematik: düz kas ve mukoza, hem de içeren afferent (mavi) ve efferent (yeşil) sinirler. Mukoza ürotelyum ve lamina propria oluşur. Lamina propria kan damarları [1], [2] interstisyel hücreleri içerir ve mukozalarda Muscularis [3]. # 2b etiketli noktalı çizgi mukoza tabakasını kaldırmak için prosedürü gösterir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Gelişim sırasında ve sonrasında 2. andMyogenic spontan aktivitesini Şekilpatoloji. A), neonatal (i spontan aktivite örnekleri arasında), yaralı juvenil (ii) sağlam bir yetişkin omurilik, (iii) ve omurilik (SCI), yetişkin (iv) sıçan mesane şeritler. SCI sıçan, incelenen dört grupta genlik (B) ve spontan kontraksiyonların frekansı (C) 'nin cerrahi., B, C) Özeti 4 hafta sonra kullanıldı. (Artim DE, Kullmann FA, Daugherty SL, Bupp E Edwards CL, de kabuksuz WC izni ile çoğaltılmıştır Neurourol Urodyn 2011 Kasım; 30 (8):.. 1666-1674.) Bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız rakam.
Miyojenik spontan aktivite ve düz kas tonusunun Şekil 3. modülasyonu. A), KCNQ kanal açıcı etkisi, flupirtine, spontan aktivite ve yetişkin sıçan mesane şeritler bazal tonu. (I) Flupirtin oklarla belirtilen zamanlarda konsantrasyonları (toplam) artan ilave edildi. Kontrolü sırasında ve 10 mikron ve 50 mikron flupirtinin uygulamasından sonra şerit faaliyet iz gösterisi 4 dakika altında genişlemelerin. Genliği (II-IV) flupirtinin etkilerinin özeti (4 farelerin 7 şeritler), (ii) ve (iv), kontrol (ilaç öncesi) değerleri% değişiklik olarak ifade edilmiştir, (iii) spontan aktivite ve bazal tonu sıklığı hangi) 100%. B'ye spontan aktivite ve yetişkin sıçan mesane şeritlerinde başlangıç sesi üzerine KCNQ kanal blokörü, XE991, etkisi, kuruldu. (I) XE991 oklarla belirtilen zamanlarda konsantrasyonları (toplam) artan ilave edildi. Iz altında genişlemeler kontrolü sırasında ve 10 mikron ve 50 mikron XE991 uygulanmasından sonra şerit aktivite 2 dk gösteriyor. On (II-IV) XE991 etkileri Özeti (4 sıçanlardan 9 şeritler)genlik (ii) ve frekans (iii) (iv),% 100 ayarlandı kontrol (ön-ilaç) değerlerden,% değişikliği olarak ifade spontan aktivite ve bazal tonusu. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız .
Sıçan mesane şeritler B (NMB) nöromedin bombesin reseptör agonisti cevaben Şekil 4. Türler farklılıklar. A) Konsantrasyon bağımlı düz kas kasılmaları,. B) sıçan mesane şeritlerinde düz kas kasılması üzerinde NMB'de etkilerinin özeti. Veri KCl normalize edilmiştir (80 mM) tepki. C, D) fare (C) ve domuz (D), mesane şeritlerinde NMB'de yanıtlarının olmaması. Karbakol (CCh) güçlü konsantrasyon bağımlı con ortaya çıkarırşeritler uyaranlara yanıt verebilir belirten iki fare ve domuz şeritler traksiyonlar. TTX (0.5 uM) bütün şeritler banyosu içinde mevcuttu. (. Kullmann FA, McKenna D, Wells GI, Thor KB nöropeptitler 2013 Ekim izni ile çoğaltıldı; 47 (5):. 305-13) Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tek darbe stimülasyon parametreleri Şekil 5. Elektrik alan stimülasyon. A) şematik. Kısaltmalar: d = darbe, i süresi = nabız yoğunluğu, ipi = arası nabız aralığı B) şematik tren stimülasyon parametrelerinin.. Kısaltmalar: td = tren süresi, i = nabız yoğunluğu, ITI arası tren aralığı =. Ankastre trende bakliyat sayısını ve aralığını betw gösterirbirlikte tren süresi ile tren stimülasyon sıklığını belirleyen, onlara een. C) Purinegic ve kolinerjik bileşenlerinin katkısı mesane büzülmelerini nöral-uyarılmış. EFS FR stimülasyon frekansları, 2, 5, 10, 20, 50 Hz temsil eder. Her 90 saniye içindir üç uyarıcı her bir frekans için test edildi ve iki kez her bir frekans kontrol serisi ve iki kez her bileşiğin eklenmesi sonra tekrarlandı. Alfa, beta-metilen ATP ABMA (şerit 1), purinerjik reseptörler ve atropin (şerit 2) muskarinik reseptörlerini bloke etmek için kullanıldı duyarsız için kullanılmıştır kısaltılır. Şerit 3, kontrol olarak kullanılmıştır ve araç, su ile muamele edilmiştir. Her bir bileşik, herbir şerit eklendiğinde Oklar zamanı göstermektedir. Araç tarafından etkilenmeyen ise EFS uyarılmış kasılma güçlü, ABMA ve atropin tarafından azaltılır unutmayın. EFS 20 Hz teslim ederken TTX deneyin sonunda ilave edildi. Kontrolda müşahade edilen oranın kalan kasılmaları dikkatşerit 3 (intramural sinirler verici sürümü tarafından başlatılan yani) kendi nöral doğasını göstererek, TTx tarafından kaldırıldı. # EFS yokluğunda ABMA şekilde düz kas yanıtları göstermektedir. Ölçek çubukları x ekseni boyunca 5 dk ve y ekseni için 2 g vardır. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil nöral uyarılmış mesane kasılmaları 6. modülasyonu. A, B) 5HT4 reseptör agonist tarafından nöral uyarılmış kasılmalar iyileştirmenin örnekleri arasında, insan mesane (A) ve ince bağırsak şeritleri (B) cisaprid. Sisaprid (siyah kayıt sayısı) ya da DMSO (gri kayıtları) oklarla gösterilen zamanlarda, konsantrasyon bağımlı bir tarzda ilave edilmiştir. Her panelde kayıtların aşağıdaki siyah çubuklar20 Hz her 120 sn teslim 10 saniye trenlerin oluşuyordu EFS, temsil eder. Dikey eksen çubuklar, tüm örnekler için 1 gr arasındadır. TTX konsantrasyonu 0.5 uM mesane şeritler (C, D) ve ileum şeritler içinde sisaprid (siyah çubuklar) veya DMSO (gri çubuklar) yanıt olarak eğri EFS uyarılmış kasılma (AUC) altındaki alan. CF) Özet (S olduğu F). CF, SB 5HT4 reseptör antagonisti ilave edildikten sonra elde edilen verilerin bir özetini temsil eden, SB-203186 anlamına gelir. Noktalı çizgiler% 100 olarak ayarlanır ve kontrol temsil eder. (Kullmann FA, Kurihara R, Ye L, Wells GI, McKenna DG, Burgard EC, Thor KB izni ile çoğaltılmıştır Auton Neuroscı 2013 Jul; 176 (1-2).:.. 70-7) bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonu.
FiBir ilacın etki yerinin tanımlama saat'in ilaçlar ve mesane. A'nın farklı bileşenlerinin rolü etki 7. Yer) protokolünün şematik. Şeritler ESF ve karbakol (CCh) ile stimüle edilmiştir. I X, ilaç etki ön birleşim yerini işaret, EFS yanıt değil CCH yanıtları azaltır. Ii, uyuşturucu X-sonrası kavşak veya her ikisi öncesi ve sonrası kavşak reseptörleri üzerinde bir eylem gösteren, hem de yanıtlar değiştirir. Yatak düz kas kasılması üzerinde mukoza) etkisi. Karbakol'ün Etkileri (soyulmuş) kaldırıldı mukozası ile şeritler kıyasla mukoza mevcut (sağlam) ile şeritler halinde azalır. (. B Alıç MH, Chapple CR, Cock M, Satranç-Williams R. Br JPharmacol 2000 Şubat izni ile çoğaltılabilir, 129 (3): 416-9). , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda mesane fizyolojisi ve patolojisi, yanı sıra mesane bozukluklarının tedavisinde yeni ilaçların keşfini yardım ile ilgili önemli bilimsel sorular çok sayıda adrese kullanılabilir vitro düz kas kasılması yönteminde basit bir tarif. Biz, mesane düz kas kasılmasının, gelişim, patolojik ve farmakolojik özellikler (Şekil 2-4), sinir iletimini modülasyonu (Şekil 5-7A), tür farkları (Şekil 4), organ farklılıkları değerlendirmek için bu yöntemin kullanımını gösterdik (Şekil 6) ve belirli mesane bileşenlerin uygunluğu (örneğin, mukoza, Şekil 7B). Burada gösterilmeyen ek uygulamalar farmakolojik ajanlar 3,10,11, çeşitli ilaçlar 22-24 veya değerlendirme / verici Rele miktarının yapı-aktivite ilişkileri kullanarak hücre içi yollarının değerlendirilmesini içermektedirsinir stimülasyonu 25 sonra ase.
Mesane fonksiyonu nihai olarak canlı üzerinde test edilebilir olsa da, bu in vitro bir yöntem, in vivo olarak pek çok sorunlu durumları üstesinden gelmektedir. Bu, cerrahi ve farmakolojik manipülasyonlar canlılığı ve / veya organ veya hayvanın, insan dokusunun kullanımı yaşam sürelerini azaltacağı durumları arasında, ihtiyaç tanımlamak ve özel bileşenlerin (sinir genel epitel vs, örneğin düz kas yanıtlarını karakterize etmek için ) veya pahalı kimyasal maddelerin kullanımı. Bir yöntem olup, düz kas kasılma aktivitesi ve iyi kontrol edilen bir şekilde ve çevre sistematik, çeşitli farmakolojik maddeler etkilerinin araştırılması hem de patoloji sağlar.
Yöntem, bilginin bir işaretleme dili sayfaları; yorumlama ve bu bilgileri genelleştirerek ancak, bakım alınmalıdır. Bu azaltılmış hazırlık bir in vitro yöntem olup, Disnormal çevre ve nöral kontrolünden bağladı. Deney koşulları böylece veri tamamen vivo fizyolojik durumlarda yansıtmayabilir, fizyolojik değildir. Örneğin, yöntem kan akımı, hormonlar, hümoral maddeler, dış mekanik kuvvetler, ya da dışsal nöral kontrol değişiklikleri için hesap edemez. Doku akut böylece yaralanma ve iskemi ile ilgili cevaplar değerlendirilir ve dikkate alınması gereken, merkezi değildir. Onlar zaten afferent, düz kas, mukoza ya da intramural sinir fonksiyonu (yani hücresel plastisite) değişmiş sürece beyin veya omurilik meydana gelen patolojik değişiklikler bu yöntemi kullanarak test edilemez. Elektrik alan stimülasyonu (EFS) nökardiyojenik tepkilerin değerlendirilmesini sağlamaktadır. Idrar kaçırma refleksi sadece bazı aktive pathw, in vivo duruma karşı Ancak, bu şerit (örneğin, sempatik, parasempatik, ileticileri) içinde gelişigüzel sinirleri uyarırays. Bu durumun üstesinden gelmek için bir yolu, farklı yollar engelleyen özel antagonistleri ile EFS birleştirmektir. Örneğin, guanetidin kasılma özelliklerini inceleyerek zaman norepinefrin salınımını engellemek için kullanılabilir veya atropin gevşeme özelliklerini çalışıldığında mesane kasılmalarını önlemek için muskarinik reseptörlerini bloke etmek için kullanılabilir. Son olarak, doku canlılığı saat belirli bir sayısı ile sınırlıdır. Genel olarak, mesane dokusu en bileşenleri 6-8h veya daha uzun bir süre boyunca (bozulan yanıtlar olmaksızın EFS yanıt örneğin) uygulanabilir ve stabildir. Ancak, diğer dokular daha duyarlı olabilir (; yazarın kişisel deneyim, örneğin, ileum ~ 6 saat veya daha az sürer).
Yöntem teknik olarak uygulanabilir ve iyi tekrarlanabilirlik ile olmasına rağmen, başarısını sağlamak için gereken birkaç kritik adımlar vardır. İlk olarak, doku hazırlanması gerekli değişiklikleri yaparak canlılığı sağlamak için dikkatle yapılmalıdırdiseksiyon işlemi için, farklı doku tiplerinin veya türler için gerekirse ve / veya araçları (çubuklarının hazırlanması sırasında doku germe kaçının). Bir başka önemli adım ayarı-bitti tavan etkisi kaçınılması şekilde nöronal stimülasyon parametreleri. Yöntem bölümünde tarif edildiği gibi, bu test bileşiğinin etki deney gerçekleştirilmiştir ve beklenen mekanizmasının türüne bağlıdır. Örneğin, mesane şeritler üzerinde, (Şekil 6) sisaprid, bir 5HT4 reseptör agonisti etkilerini test etmek için, biz maksimal ~% 50 EFS uyarılmış kasılma şiddetini ayarlayın. Bu münasebetle da EFS uyarılmış kasılma artması beklenmektedir ön birleşim parasempatik sinir 27, ikinci ACh salgılanmasını artırıcı 5HT4 reseptör agonistleri, etki mekanizması bilinen dayanıyordu. Sinirlerin vs kasın uyarılması EFS uyarılmış kasılmalarını da inhibe eder ve böylece gereken sinir iletimini önler ve TTX kullanılarak test edilmesi gerekir. Araç ve tim için yeterli kontrollerie zamanla dokusunun bozulması hesaba uyuşturucu testi sırasında ve aracın olası etkileri için yapılmalıdır. Örneğin, bir çok ilaç DMSO ya da etanol içinde çözülür. Verilerimiz, (Şekil 6) DMSO (% 0.1 ve daha yüksek), test ilacının etkisinden çıkarılması gerekmektedir etkisi ile uyarılan kasılmaları nöral artırabileceğini göstermektedir. Benzer şekilde, etanol (en fazla% 1) kendiliğinden düz kas kasılmalarını azaltmakta, ama nöral ile uyarılan kasılmaları 34,35 üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Genetik olarak hayvan modelleri ya da cerrahi (örneğin, omurilik yaralanması ya da ovariektomi) kullanılıyorsa, sırasıyla kontrol fare türünde uygun bir fon veya sahte ameliyat hayvanların doku içermelidir. Buna ek olarak, insan, fare ve gine domuz mesaneleri gibi organ dokuları, okul içi ganglionlar içerir. Bu dokular ile çalışırken, protokol seçimi ve veri yorumlama içi NE ilaçların veya EFS hesabı etkileri dikkate almak gerekirbundan başka, düz kas teşvik urons.
, Deneysel protokol tasarımı test edilecek (ilaç uyarılması için, EFS için) doğru parametreleri seçimi ve konsantrasyonları anlamlı verileri sağlamak için kritik öneme sahiptir. Parametreleri bireysel dokular ve uyuşturucu, genel ilkeler için ayarlanabilir olmalıdır yaparken / aşağıda belirtilen kurallar geçerlidir. Kümülatif konsantrasyon-tepki eğrileri, ancak bu bütün bileşikler için bu mümkün değildir, arzu edilir. Bu tür doku (örneğin, Ach) hızlı bir şekilde metabolize edilir purineric iyonotropik reseptörler (P2X) veya ilaç gibi desensitize reseptörlerini hedefleyen ilaçlar, güvenilir bir şekilde aynı dokuda, kümülatif konsantrasyon cevap eğrileri kullanılarak test edilemez. Bu durumlarda, tek bir doku konsantrasyonları farklı gruplar halinde test edilir. Desensitizasyonu değerlendirmek için, kümülatif konsantrasyon sonunda elde edilene tek bir yüksek konsantrasyon tarafından sağlanan yanıtının kuvvetini karşılaştırma önerilircevap eğrisi.
Konsantrasyon yanıt eğrilerinden elde edilen verilerin doğru montaj için, yarım log konsantrasyonlarda (Şekil 6'da örnek CCh) test etmek için tercih edilir. Dokusu canlılığı sınırlı olabilir veya benzeri diğer sınırlamaların bir yerde olabilir, ancak, günlük konsantrasyonu (Şekil 4A Örnek NMB) kabul edilebilir.
Yeni bir bileşik için bir konsantrasyon aralığını seçmek için ön deneyler, bu 10, iki güç konsantrasyonunda yukarıda ve aşağıda bileşik ve test bağlanma afinitesini dikkate yararlıdır. Daha sonraki deneylerde, protokol ilacın herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir bir başlangıç noktası ve maksimum tepki ya da test edilen konsantrasyon, artık, amaçlanan hedefe özgü olan ya bir noktasını belirlemek için rafine edilir.
A) Zaman, bir için: bir ilaç uygulamak için zaman aralığı dikkate çeşitli faktörler dikkate alınarak seçilmelidirİlaç bir etkiye sahip olduğu. (- 3 saat 30 dakika), membran reseptörlerinin hedef, genel olarak hücre-içi ilaç hedefleri için ilaç ise (örneğin, forskolin ve diğer enzim inhibitörleri 36, botulinum toksini 37) ilave bir inkubasyon süresi gerektirir, nispeten hızlı bir tepki (dakika saniye). Ayrıca, doku kalınlığı önemli bir rol oynayabilir. b) Süresi ve ilacın etki mekanizması. Gibi durumlar için, ilaç etkisi Şekil 6'da bu Şekil 4A'da NMB şekilde sürdürülür plato ve sisapridin ulaştığında, ilaç uygulamaları ile 5-15 dakika arasında zaman aralıkları yeterli veri toplama için yeterlidir. Bu ilaçların etki veya etki mekanizması, farklı (ATP, CCh) çok daha kısa bir süreye sahip olan ile mümkün değildir. Örneğin, Şekil 4C ya da 4D CCH etkisi, hızlı bir düzlüğe ulaşır, ancak doku gerilim taban değere dönmelerine eğilimindedir. Bu durumda, zaman aralıkları uygun olarak ayarlanması gerekebilirilk tepki maksimum ulaştığında ly, genellikle bir sonraki konsantrasyon ekleyerek.
Veri analizi, şeritler arasındaki karşılaştırmalara olanak veri özellikle normalleşme çok önemli bir adımdır. Farklı çalışmalar diğer kasılma madde (örneğin, CCh 38) için en yüksek tepkinin maksimum tepkinin% 28 veya ağırlıkça 38 şerit, şerit kesit alanı 39, 12 karşılık KCI,% dahil normalleştirilmesi için farklı parametreler kullanılır. Normalleştirme parametre deney amacına bağlı olarak seçilmelidir, parametre test bileşikleri, patoloji veya deney tasarımı etkilenmez şekilde. Örneğin, KCI yanıt normalleştirme ağırlığı ve şeritlerin diğer boyutlarının ortadan kaldırır ve dolayısıyla patolojik duruma şeritler (örneğin, şeker hastalığı, mesane kitlesini arttıran) ağırlığını arttırabilir burada dokularda cevapları karşılaştırmak için kullanılabilir. Buna ek olarak, yenidenKCI ye yanıtlarının yokluğu mukoza / ürotelyumu 29 uzaklaştırılması etkilenmeyen, bu şekilde mesane (örneğin, genel mukoza düz kaslar) farklı bileşenlerinin değerlendirilmesinde deneylerde kullanılabilir.
Özetle, bu kontraktilitesi yöntem mesane (ve diğer organ) fizyoloji ve farmakoloji değerlendirmek için hızlı, kolay ve çok güçlü bir yaklaşım sağlar. Uygun biçimde kullanıldığında, bu azaltılmış ve iyi kontrol edilen bir ortamda doku değiştirme olanağı sağlar. Mesane fonksiyonu çalışma, bu yöntem, şu an için antimuskarinik AAM yönetimi için kullanılan bileşiklerin keşfedilmesi ve test edilmesi ve etkili yeni 3 AR agonistleri β edindi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma LB NIH R37 DK54824 ve R01 DK57284 hibe ile desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Tissue Bath System with Reservoir | Radnoti, LLC | 159920 | isolated tissue baths |
| Warm water recirculator pump | Kent Scientific Corporation | TPZ-749 | to keep tissue baths to 37 °C |
| Computer | |||
| Data Acquisiton System | DataQ Instruments | DI-710-UH | To view, record and analyze data |
| Transbridge Transducer Amplifier | World Precision Instruments | SYS-TBM4M | Transducer amplifier |
| Grass stimulator | Grass Technologies | Model S88 | Stimulator |
| Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | ACV-1205S | To anesthetesize the animal |
| Anesthetizing Box | Harvard Apparatus | 500116 | To anesthetesize the animal |
| Anesthesia Masks | Kent Scientific Corporation | AC-09508 | To anesthetesize the animal |
| Materials and Surgical Instruments | |||
| Sylgard | Dow Corning Corp | 184 SIL ELAST KIT | To pin, dissect, & cut tissue |
| Petri Dish | Corning | 3160-152 | To dissect/cut tissue |
| Insect Pins | ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins | Size 5 | To pin tissue |
| Bench Pad | VWR International | 56617-014 | Absorbent bench underpads |
| Rat surgical Kit | Kent Scientific Corporation | INSRATKIT | To remove and dissect tissue |
| 2 Dumont #3 Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500064 | To remove and dissect tissue |
| Tissue Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500092 | To remove and dissect tissue |
| Scalpel | Kent Scientific Corporation | INS500236 | To remove and dissect tissue |
| Scalpel blade | Kent Scientific Corporation | INS500239 | To remove and dissect tissue |
| Professional Clipper | Braintree Scientific, Inc. | CLP-223 45 | To remove fur |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Tie tissue |
| Tissue Clips | Radnoti, LLC | 158802 | Attach tissue to rod/transducer |
| 1 g weight | Mettler Toledo | 11119525 | For transducer calibration |
| Chemicals | |||
| Krebs Solution: Sodium chloride Potassium chloride Monobasic potassium phosphate Magnesium sulfate Dextrose Sodium bicarbonate Calcium chloride Magnesium chloride |
Sigma Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma EMD Baker |
S7653 P217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444 |
To prepare Krebs solution |
| Isoflurane | Henry Schein | 029405 | To anesthetesize the animal |
| Oxygen tank | Matheson Tri Gas | ox251 | To use with anesthesia system |
| Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide) | Matheson Tri Gas | Moxn00hn36D | To aerate Krebs solutions |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Andersson, K. E. Detrusor myocyte activity and afferent signaling. Neurourol Urodyn. 29, 97-106 (2010).
- Artim, D. E., et al. Developmental and spinal cord injury-induced changes in nitric oxide-mediated inhibition in rat urinary bladder. Neurourology and urodynamics. 30, 1666-1674 (2011).
- Kita, M., et al. Effects of bladder outlet obstruction on properties of Ca2+-activated K+ channels in rat bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 298, 1310-1319 (2010).
- Barendrecht, M. M., et al. The effect of bladder outlet obstruction on alpha1- and beta-adrenoceptor expression and function. Neurourol Urodyn. 28, 349-355 (2009).
- Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. Postnatal development of myogenic contractile activity and excitatory innervation of rat urinary bladder. The American journal of physiology. 247, 972-978 (1984).
- Ng, Y. K., de Groat, W. C., Wu, H. Y. Smooth muscle and neural mechanisms contributing to the downregulation of neonatal rat spontaneous bladder contractions during postnatal development. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 292, 2100-2112 (2007).
- Szell, E. A., Somogyi, G. T., de Groat, W. C., Szigeti, G. P. Developmental changes in spontaneous smooth muscle activity in the neonatal rat urinary bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, 809-816 (2003).
- Szigeti, G. P., Somogyi, G. T., Csernoch, L., Szell, E. A. Age-dependence of the spontaneous activity of the rat urinary bladder. J Muscle Res Cell Motil. 26, 23-29 (2005).
- Frazier, E. P., Braverman, A. S., Peters, S. L., Michel, M. C., Ruggieri, M. R. Does phospholipase C mediate muscarinic receptor-induced rat urinary bladder contraction. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 322, 998-1002 (2007).
- Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Selective inhibition of phosphodiesterase 1 relaxes urinary bladder smooth muscle: role for ryanodine receptor-mediated BK channel activation. American journal of physiology. Cell physiology. 303, 1079-1089 (2012).
- Frazier, E. P., Peters, S. L., Braverman, A. S., Ruggieri, M. R., Michel, M. C. Signal transduction underlying the control of urinary bladder smooth muscle tone by muscarinic receptors and beta-adrenoceptors. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 377, 449-462 (2008).
- Svalo, J., et al. The novel beta3-adrenoceptor agonist mirabegron reduces carbachol-induced contractile activity in detrusor tissue from patients with bladder outflow obstruction with or without detrusor overactivity. European journal of pharmacology. 699, 101-105 (2013).
- Yokota, T., Yamaguchi, O. Changes in cholinergic and purinergic neurotransmission in pathologic bladder of chronic spinal rabbit. J Urol. 156, 1862-1866 (1996).
- Bayliss, M., Wu, C., Newgreen, D., Mundy, A. R., Fry, C. H. A quantitative study of atropine-resistant contractile responses in human detrusor smooth muscle, from stable, unstable and obstructed bladders. J Urol. 162, 1833-1839 (1999).
- Kullmann, F. A., McKenna, D., Wells, G. I., Thor, K. B. Functional bombesin receptors in urinary tract of rats and human but not of pigs and mice, an in vitro study. Neuropeptides. 47, 305-313 (2013).
- Sadananda, P., Kao, F. C., Liu, L., Mansfield, K. J., Burcher, E. Acid and stretch, but not capsaicin, are effective stimuli for ATP release in the porcine bladder mucosa: Are ASIC and TRPV1 receptors involved. European journal of pharmacology. 683, 252-259 (2012).
- Maggi, C. A., et al. Species-related variations in the effects of capsaicin on urinary bladder functions: relation to bladder content of substance P-like immunoreactivity. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 336, 546-555 (1987).
- Kullmann, F. A., et al. Effects of the 5-HT4 receptor agonist, cisapride, on neuronally evoked responses in human bladder, urethra, and ileum. Autonomic neuroscience : basic & clinical. 176, 70-77 (2013).
- Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Human tachykinin NK2 receptor: a comparative study of the colon and urinary bladder. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30, 632-639 (2003).
- Zoubek, J., Somogyi, G. T., De Groat, W. C. A comparison of inhibitory effects of neuropeptide Y on rat urinary bladder, urethra, and vas deferens. The American journal of physiology. 265, 537-543 (1993).
- Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationship of neurokinin A(4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the effect of amino acid substitutions on receptor affinity and function. Biochem Pharmacol. 63, 2181-2186 (2002).
- Warner, F. J., Mack, P., Comis, A., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationships of neurokinin A (4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the role of natural residues and their chirality. Biochem Pharmacol. 61, 55-60 (2001).
- Dion, S., et al. Structure-activity study of neurokinins: antagonists for the neurokinin-2 receptor. Pharmacology. 41, 184-194 (1990).
- Somogyi, G. T., Zernova, G. V., Yoshiyama, M., Yamamoto, T., de Groat, W. C. Frequency dependence of muscarinic facilitation of transmitter release in urinary bladder strips from neurally intact or chronic spinal cord transected rats. British journal of pharmacology. 125, 241-246 (1998).
- Andersson, K. E., Wein, A. J. Pharmacology of the lower urinary tract: basis for current and future treatments of urinary incontinence. Pharmacological reviews. 56, 581-631 (2004).
- D’Agostino, G., Condino, A. M., Gallinari, P., Franceschetti, G. P., Tonini, M. Characterization of prejunctional serotonin receptors modulating [3H]acetylcholine release in the human detrusor. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 316, 129-135 (2006).
- Hawthorn, M. H., Chapple, C. R., Cock, M., Chess-Williams, R. Urothelium-derived inhibitory factor(s) influences on detrusor muscle contractility in vitro. British journal of pharmacology. 129, 416-419 (2000).
- Chaiyaprasithi, B., Mang, C. F., Kilbinger, H., Hohenfellner, M. Inhibition of human detrusor contraction by a urothelium derived factor. J Urol. 170, 1897-1900 (2003).
- Testa, R., et al. Effect of different 5-hydroxytryptamine receptor subtype antagonists on the micturition reflex in rats. BJU international. 87, 256-264 (2001).
- Craggs, M. D., Rushton, D. N., Stephenson, J. D. A putative non-cholinergic mechanism in urinary bladders of New but not Old World primates. J Urol. 136, 1348-1350 (1986).
- Fry, C. H., Bayliss, M., Young, J. S., Hussain, M. Influence of age and bladder dysfunction on the contractile properties of isolated human detrusor smooth muscle. BJU international. 108, 91-96 (2011).
- Kennedy, C., Tasker, P. N., Gallacher, G., Westfall, T. D. Identification of atropine- and P2X1 receptor antagonist-resistant, neurogenic contractions of the urinary bladder. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 845-851 (2007).
- Levin, R. M., Danek, M., Whitbeck, C., Haugaard, N. Effect of ethanol on the response of the rat urinary bladder to in vitro ischemia: protective effect of alpha-lipoic acid. Molecular and cellular biochemistry. 271, 133-138 (2005).
- Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: Involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American journal of physiology. Cell physiology. 306, 45-58 (2013).
- Longhurst, P. A., Briscoe, J. A., Rosenberg, D. J., Leggett, R. E. The role of cyclic nucleotides in guinea-pig bladder contractility. British journal of pharmacology. 121, 1665-1672 (1997).
- Takahashi, R., Yunoki, T., Naito, S., Yoshimura, N. Differential effects of botulinum neurotoxin A on bladder contractile responses to activation of efferent nerves, smooth muscles and afferent nerves in rats. J Urol. 188, 1993-1999 (2012).
- Sadananda, P., Chess-Williams, R., Burcher, E. Contractile properties of the pig bladder mucosa in response to neurokinin A: a role for myofibroblasts. British journal of pharmacology. 153, 1465-1473 (2008).
- Liu, G., Daneshgari, F. Alterations in neurogenically mediated contractile responses of urinary bladder in rats with diabetes. American journal of physiology. Renal physiology. 288, 1220-1226 (2005).
