Summary
ここでは、in vitroでHomalodisca vitripennis細胞やHOCV-1を伝播するためのプロトコルを提示する。媒体はHOCV-1陽性培養物から除去し、RNAを168時間ごとに24時間抽出した。細胞生存率をトリパンブルー染色によって定量した。全ウイルス粒子は、感染後抽出した。抽出されたRNAは、定量RT-PCRによって定量した。
Abstract
ガラス状の翼狙撃兵（Homalodisca vitripennis）は米国南西部で発見、非常vagileと雑食昆虫です。これらの昆虫はXylella fastidiosa（Xにfastidiosa）、ブドウのピアース病（PD）の病因である木部が制限された細菌の優勢なベクトルである。ピアース病は、経済的に有害である。したがって、H. vitripennisは、病原体管理戦略のターゲットとなっている。 Homalodiscaのcoagulataウイルス-01（HOCV-01）と同定dicistrovirusはHの死亡率の増加と関連していたvitripennis集団 。宿主細胞はHOCV-01の複製に必要とされるため、細胞培養は、ロジスティックや生物農薬生産のための経済的価値がある目標と複製のための均一な環境を提供します。 H.の大規模増殖のために本研究では、システムpを組織培養を介した細胞が開発されたvitripennisウイルス複製のメカニズムをroviding。 HOCV-01は、全身昆虫から抽出され、培養されたH.に接種したさまざまなレベルで細胞をvitripennis。培養培地は168時間、24時間毎に除去し、RNAを抽出し、定量RT-PCRで分析した。細胞は、トリパンブルーで染色し、光学顕微鏡を用いて細胞生存性を定量化するために計数した。全ウイルス粒子は、全細胞培養崩壊が発生する前であると判断した時点であった、感染後96時間までの抽出された。細胞はまた、蛍光染色を施し、F-アクチンの取り付けおよび核完全性に対するウイルス活性を調査するために、共焦点顕微鏡を用いて観察した。この研究の結論は、Hである。 vitripennis細胞を培養し、バイオ農薬の生産を可能にするために適切なレベルでHOCV-01の大量生産のために使用されることが可能である。
Introduction
（Homalodisca vitripennisゲルマール1821）ガラス状の翼狙撃兵はXylella fastidiosa（Xにfastidiosa）、北米1ブドウ（PD）のピアース病の原因因子の優勢なベクトルとして同定されている。昆虫個体群管理はすぐにカリフォルニアのブドウ栽培産業へと南部米国各地、この破壊的な問題に対処するための研究の焦点となっている。家族Dicistroviridae、Homalodisca coagulataのウイルス01（HOCV-01）に属するプラスセンス一本鎖RNAウイルスは、野生H.で同定されているvitripennis集団および殺虫剤に害虫の抵抗性を低下させながら、それらの集団2-4の死亡率を増加させることが示さ。
効果的にリアH.感染させる手法の開発実験室の設定で成体までvitripennisがあるため困難であった
次の手順の全体的な目標は、生物的防除剤としての利用に適しHOCV-01を高濃度で製造することである。ウイルス複製がなぜ成功し、Hを栽培し、最適化された生細胞を必要とし、 vitripennis培養は、ウイルスの収益性の高いレベルを生成するの進展に不可欠です。
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Protocol
1細胞培養
注：米国農務省農業研究サービス（フォートピアス、フロリダ州、米国）での博士ウェイン·ハンター研究所によって確立Homalodisca vitripennisた細胞株は、初期線維芽細胞及び単層を含む混合細胞の段階で構成されるラボ株式を開始するために使用された。
- 25cm 2の培養フラスコを20〜24℃の温度範囲に維持され、無菌の実験室環境では、次の手順を実行します。
- 育成とH2G +ヨコバイ媒体、修正されたWH2ミツバチメディア10（ 表1）を使用して25cm 2の組織培養フラスコに培地を維持する。
- 〜53％の湿度で24℃で培養フラスコをインキュベートする。
- 例えば、培養増殖をモニターし、異常な細胞増殖のためにチェックし、潜在的な汚染物質を監視し、CULを越え、成長の進行状況をチェックするために100Xの総合倍率（TM）での倒立顕微鏡を使用してくださいトゥーレ表面。
- 培養表面を乱すことなく10日 - 7日毎完全培地変化（フラスコあたり〜4ミリリットル培養培地）を実行します。
- 培養表面が、細胞を解離するためにエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含む0.25％トリプシンを用いて細胞増殖（コンフルエント）によって覆わ約80％である場合、培養物を通過させる。各培養フラスコにトリプシン3ミリリットルと短期間酵素に培養物（複数可）を公開する - 〜2の追加 - 完全な細胞解離を達成するために、（5〜10分）。
- 酵素活性を停止し、遠心分離コニカルチューブにソリューション全体を転送するために - （3mlの〜2）培養フラスコ（複数可）に新鮮な培地を同量を追加します。
- 350×gで6分間、4℃で遠心分離により細胞をペレット化。
- 細胞ペレットを乱すことなく上清を除去し、各チューブに新鮮な培地〜8ミリリットルを追加します。静かにピペットを用いて細胞をホモジナイズする。
- 1での分割培養：2比25 cm 2のフラスコ（〜セルsoluti 4mlのフラスコ当たりで）及び新たに渡された文化を残して、懸濁液中の細胞がフラスコの表面にしっかりと付着させ48時間平静。
注：1cm 2の成長表面を有する48ウェル滅菌組織培養プレート中の細胞の培養も可能であり、それらは〜250μlのに培養培地の体積の減少と培養フラスコと同様に維持することができる。
2全ウイルスの抽出
- ウイルス陽性のHの体全体を均一化〜10秒間隔ボルテックス0.02％のジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物（DETCA）とリン酸緩衝液中vitripennis、pH約7.2、ノー存在する組織のより大きな塊がなくなるまで。 4℃または4℃で16時間22000×gで4時間124,500×gで超高速遠心分離を経由してウイルスを抽出します。一番上に沈殿物が形成した場合、滅菌綿棒11でそれを削除してください。
- 上清を捨てる。
- ペレットを収集し、0.4％のNa-デオキシコール酸および4％のポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル（ブリジ52）を含む、5ミリリットルの10mMリン酸緩衝液（無DETCA）、pH約7.2で溶解する。
- よくペレットを混合するために、チューブの側面からペレットを除去し、必要に応じて、溶液中まで押しつぶす。
- ペレットは、必要に応じて溶液中に行くと2のチューブ11内に組み合わせる助けるために〜5ミリリットル刻みで、10 mMのリン酸緩衝液を追加します。
- 遠心分離し、15分間11、300×gでソリューションを提供します。
- 上清を除去し、0.45μmのフィルターを通して溶液を渡し、大規模なコレクションチューブ11内のろ液を収集します。
- 3.5 kDの分子量カットオフ（MWCO）を用いて透析膜に転送するろ液、11を必要に応じて何DETCAを含まないリン酸緩衝液（pH7）に10 mMの少量を使用した。
- 4℃でのddH 2 Oで満たされた大きなビーカーに透析膜を配置します。のddH 2 Oを1時間ごとにFを変更するまたは5から6時間後、膜11中の白色の沈殿物が形成されるまで。
- 膜内から精製されたウイルスを回収し、のddH 2 O を 90μlに溶液10μlを添加することによって、10倍希釈シリーズに、100％のウイルス液を施す：100,000その後1の希釈に達するまでのddH 2 Oをさらに90μlに希釈液10μlを加える。
- -80℃で保存ウイルス液。
3。ウイルス複製
- 48ウェル培養プレートにおける種子細胞と細胞増殖が80％コンフルエント（細胞が平均速度で成長している場合は約72時間後に合格）になるまで、すべての行を育てる。
- 一番上の行を除いて、 等 100希釈、：細胞増殖がコンフルエント、 すなわち、1:10希釈、1つの行の一つの行に達する連続希釈したウイルスを用いてセルの各行に接種する。コントロールとして一番上の行を使用し、ボリュームコントロールなどの各ウェルにのddH 2 O10μlのを追加します。
- 前ウイルスと培養中のいずれかの井戸の最初の接種に、各行の最初のウェルを、実験的な細胞数と比較するための出発ベースライン細胞濃度を確立解離とカウントするため。
- pH変化を示す培地中のいずれかの色の変化のためと細胞形態の変化のためのウイルス接種後、培養プレートを24時間毎に監視します。
- 100X TMに倒立顕微鏡を用いて、各時点で試験板の画像つの列。
- -80℃でRNA抽出とウイルス定量化または長期-20℃でそれぞれ24時間の時点で撮像された列からすべてのメディアを取り外し、短期的に保管してください。
- 再懸 濁細胞ペレに酵素活性を停止させ、0.25％トリプシンEDTAおよび新鮮培地のみ〜250μlのを使用して、1.9の新鮮な培地〜250μlの-以前のステップ1.6で説明したように培地を除去した後、ウェルから細胞を解離させるトン。
- 一週間にわたって各24時間の期間のための細胞解離後の細胞数を実行するための細胞を含有する各チューブに0.4％トリパンブルー染色液10μlを追加します。汚れが細胞数を実行する前に、10分間静置する。
- 汚れや生細胞への曝露の1時間以内に細胞数を実行すると、汚れだけでなく、非生存細胞を取り込むために開始されます。
- ゆっくりとマイクロピペットを用いて、標準的な血球計数器の両側に染色された細胞溶液10μlを加える。溶液を、気泡を避けるために、毛管作用によって取り込まれることを可能にする。
- 血球計数器の両側に実行可能な（非染色）細胞（血球計数器16の正方形の4カウントに相当）の数をカウントします。削除された列の各ウェルのために細胞数を実行します。
- 各列からの細胞数を平均し、全細胞カウント数取得するには、次の式を使用します。x希釈係数（セル/ 4の平均数）=セル×10の数を
細胞培養から4ウイルスの抽出
- 処理されたHを削除する1.8酵素活性を停止させ、0.25％トリプシンEDTAおよび新鮮培地のみ〜250μlのを使用して、 -以前のステップ1.6で説明したように培養フラスコから細胞をvitripennis。
- 上清を捨てる。
- 2.8 -以前のステップ2.3で説明したプロトコルに従って、培養細胞からウイルスを抽出します。
5。RNA抽出
- 製造業者のプロトコルごとの液体サンプル用に設計されたグアニジニウムチオシアネート - フェノール - クロロホルム抽出を使用して、各1週間のウイルス試験中に回収した培地のサンプルからRNAを抽出します。
- ストアを-80℃でサンプルを抽出した。
6 RT-PCR
- 使用した伝統的なPCR法を実行して、RT-PCRのためのウイルスの基準を確立ウイルスとのプライマー対HOCV RT-PCRプライマー1（フォワード5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 '、5'-ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3を逆転'）全身H.から分離するvitripennis。
- 主題PCR産物は、0.1％臭化エチジウムを含む2％アガロースゲルで120 Vで60分間電気泳動をゲル化する。
- ゲルからのバンドを切り出し、製造業者のプロトコルに従ってゲル抽出キットを用いて精製する。
- プールは、すべて切除し、ゲル精製し、製品と、さらに基本的なエタノール沈殿により精製し。全体的な試料濃度を増加させるためにトリスEDTA（TE）の約30μlの沈殿生成物を溶出する。
- 核酸検出のための260/230波長設定を使用して分光光度法を介してプールされたサンプル中のcDNAのレベルを定量化する。
- 57 ngの/ 57 AG /μL（10 -18）μLの範囲までの精製標品の10倍連続希釈系列を実行します。 iを記載したものと同様の連続希釈を行うnの濃度の要件の違いのために作ら調整を2.8。
- 低存在転写産物の信頼性の高い定量化と定量RT-PCRキットを使用して定量RT-PCRを行うことによって希釈系列の検出限界を決定します。
注：5×10 -3コピーよりウイルス濃度は低いが検出されない。 - ステップ5.1で、前述のように実験試料からRNAを抽出し、分光光度法を使用して定量化する。
- 5 ngの/ヌクレアーゼを含まない水を使用してμlに抽出されたすべてのサンプルを正規化します。
- 次のように低コピー数を感知する能力を持つワンステップ定量RT-PCRキットを用いて25μlの反応として、二重に、すべての試料について定量RT-PCRを行う：50℃で10分間保持し; 5分間95℃で保持。 10秒、30秒、60°C、95°Cの30サイクル;各ステップでの5秒間99℃ - 50から溶融。
- 各反応混合物は1倍maste12.5μlのが含まれているように、マスターミックスを作るRミックス、フォワードプライマー1.0μL（0.3μM）、リバースプライマー1.0μL（0.3μM）、逆転写酵素および標準化値に基づいて、テンプレートの可変量の0.25μlの。
- RNaseを含まない水で25μlの総反応容量を持参してください。
- 5×10 -10、5×10 -8、5×10 -6、5×10 -4、5×10 -2のコピー：各PCRの5つの標準濃度以下のコピー数を使用して実行を含めます。各実行の開始時に早期取得時のノイズを低減するためにちょうど10倍-2.5の蛍光の下にそれぞれの実行のためのしきい値を設定します。
7。共焦点顕微鏡
- 各ウェルに直径18mmのガラス製カバースリップを含む12ウェルプレートにHomalodisca vitripennis細胞を成長させる。
- 単層が達成された後、四日間の期間プレートに24時間毎に1つの列に接種する。各Cことを確認してくださいolumnがうまくコントロールが含まれている、低ウイルス希釈（1:10）だけでなく、高いウイルス希釈（1：100,000）よく。ステップ2.8から得られたウイルス溶液を使用してください。
- 5日目にすべてのメディアを取り出して、1×PBS（pH7.4）で細胞を2回洗浄する。
- 30分間、4℃での冷4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。
- 1Xリン酸500μlの細胞に緩衝食塩水（PBS）を追加し、低速でロッカー上、室温で10分間、それらを洗ってください。細胞を3回洗浄する。
- それらを透過するために、細胞を0.1％トリトンX-100の500を添加する。室温で10分間放置します。
- 先にステップ7.5で説明したように、再び細胞を洗浄する。
- RTで細胞をブロックするために、5％ウシ血清アルブミン（BSA）溶液500μlを加える。 2時間放置した後、削除してみましょう。
- ×PBS中5％BSAを含む250およびF-アクチンのため汚れに各ウェルに希釈液を250μlを追加：在庫ローダミンレッド - 結合ファロイジン（RCP）1に希釈する。
- アルミFのカバープレート漂白から染料を防止し、4℃のCO / Nで細胞を培養するためのオイル。
- インキュベーションの12時間後にRCPを除去し、4を250μlと交換して '、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）（250μg/ ml）を、5％BSAを含む1×PBS中に希釈し、細胞の核を染色する。
- 室温で1時間DAPIを含有する細胞をインキュベートする。
- 先にステップ7.5で説明したように1×PBSで細胞を3回洗浄する。
- 静かに井戸からカバースリップを除去し、抗退色試薬とマウントメディアを使用してスライドを顕微鏡にマウントします。
- 共焦点顕微鏡下で観察されるまでスライドを遮光箱に乾燥することができます。 Viewは、できるだけ早く染料が急速にフェードすることができますようにスライドを用意しました。
- 63X（油）は平面-apochromateレンズを含む顕微鏡を備えた共焦点顕微鏡システムを用いて画像染色された細胞。
- 543±10nmの励起及びRhoadmine赤conjucatedファロイジン575±10 nm発光レーザの波長を設定しますDAPI用、および369±10nmの励起及び450±30 nm発光。
- すべての画像を取得するために、検出器のために、同一のゲインとオフセットの設定を使用します。
- ソフトウェアを管理イメージに適切な画像処理ソフトウェアおよびソーティングおよびインポート所望の画像を用いて処理画像。
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Representative Results
細胞の付着および成長が一次培養し、継続的な通路から、小規模および大規模の両方の培養フラスコ中の通路の48時間以内に見られた。線維芽細胞成長および発達にも、この時間枠内で観察された。新たに播種したフラスコは、48時間前に妨害されたとき、そこに、細胞の接着では見え下落したこともある遅い成長している文化や全く付着または成長につながる。細胞は、通過する一週間以内に約80％コンフルエントと10〜14日間（ 図1）で単層を形成した。この研究の開始時に培養した初代培養は、任意の形態学的劣化や、全体的な細胞生存率の低下なしに30以上の細胞継代を生き延びてきた。
細胞の付着および成長がプレートにフラスコからの流路の48時間以内に見られた。それは小さな成長面であるように、単層の形成は、約5〜6日間、短い時間で達成された。感染した培養を撮影T 100Xは、光学顕微鏡下衰退セル形状の完全性の徴候を示した。 48時間の感染後に、大きな穴が細胞の表面上に存在したことをどのよう見える。約72〜96時間後、非希釈しHOCV-01（ 図2）に感染した後、培養フラスコ全体で、細胞が収縮し、培養表面から剥離。
対照および実験サンプルのための生細胞数を算出して時間をかけてウイルス量との間に生きた細胞（ 図3）の存在量の違いを示すためにプロットした平均。対照群のために生細胞中の一貫した増加は、健康な細胞を示す、存在する。比較的に、全ての処置群は、時間にわたって存在生細胞数の著しい減少があった。下のウイルスのグループがゆっくり144時間のまわりの脱落まで下落しながら、より高いウイルス治療群では、48〜72時間の間に生きた細胞内の主要な低下に培養健康はるか著しい減少を示している。二元配置ANOVAのWI第ボンフェローニポストホック分析は、研究において、ならびに群間のそれぞれの時点と比較した各処置群における生存細胞数に基づいてHOCV-01による細胞培養の死滅率の差を試験した。分散の二方向解析は、時間の培養の長さは治療の影響を受け培養寿命にさらされたことを示唆し、時間係数、F（7、432）= 82.5、p <0.0001の有意な主効果があった。処置培養物のタイプの効果は、受信した、同様に有意であったF（5、432）= 170.6、p <0.0001は、培養物が最初に受信したウイルス負荷量は、培養の生存に影響を与えることを示している。時間因子および治療 因子との相互作用における有意な効果は、より高いウイルス負荷は、培養適応度を減少させるのに必要な短い時間を受信し、逆にあることを下線、またF（35、432）= 17.63、p <0.0001存在する低いウイルス量、同じ効果のために必要な時間より長い期間。ボンフェローニポストホックテストは、顕著な用量応答を示す、治療群と対照群の間で有意差を示している。
平均生存細胞数の分析から導かれた結論に相関カプラン·マイヤー曲線（ 図4）によって試験し、より高いウイルス治療を接種した細胞の生存確率は低かった。対照または非感染細胞を100％の生存率があった。下のウイルスの治療はその後生存確率の低下が存在し、144時間まで生存の高い確率を持っている間高いウイルスの治療にさらされた細胞は、経時的な生存確率が著しく低下していた。 Cox比例ハザードモデル分析は有意ではなかった、治療のcoeff = 0.8812（95％CI [0.76、1.02]）において、p> 0.05。有意ではないが、データがウイルスに曝露された細胞は、経時的に低い生存率を示すために88％以上の可能性が高いことを示唆している。
各定量RT-PCRのランのために、より高いウイルス性の基準は以前より低いウイルスの基準および実験試料よりもランプアップ。各実行から、Ct値は、実験試料中に存在するHOCV-01 RNAの存在量の違いをテストして、複数の制御値に値を比較するために、双方向ANOVAを用いて分析した複製する。分散の双方向の分析はF（7、289）= 0.38、P> 0.05、または時間と処置群との間の相互作用、F（63、289）において、時間ファクタの有意な主効果を示さなかっ= 0.14 頁 > 0.05。最初に細胞培養物に導入ウイルスの量を示す治療群、F（9、289）= 135.7、p <0.0001、間に有意な主効果が観察された検出、ウイルスRNAの量に影響を与える。ボンフェローニポストホックテストは実行されず、処置群とコントロール測定値の間に有意な相互作用を示すが、治療gの間に有意な相互作用し測定可能な用量応答がないことを示し、単独でroups。
健康でHOCV-01の細胞形態の違いは、H感染 24および72時間で、細胞を蛍光下に見られたvitripennis。現在の核の数の減少だけでなく、コントロールと比較して、HOCV-01に曝露された細胞中のF-アクチンの不格好な外観は、ウイルスが培養の健康に大きな影響を有することを示している。高一時10ウイルス量にさらされた細胞は、より低いウイルス治療に曝露された細胞よりも大きな苦痛を示した。対照細胞は、より豊富現れる二つの時点（ 図5）の間に正常な形態を有すること。
| グレース昆虫培地（補充した1×） | 210ミリリットル |
| 0.06MのL-ヒスチジン一水和物液（pH = 6.5） | 290ミリリットル |
| 培地199（10倍） | 10ミリリットル |
| ミディアム1066（1×） | 17ミリリットル |
| ハンクス（1×） | 33ミリリットル |
| L-グルタミン（100×） | 1.5ミリリットル |
| MEM、アミノ酸ミックス（50×） | 1.5ミリリットル |
| 1 MのMgClソリューション | 6ミリリットル |
| （グルタミン/ w）のペニシリン - ストレプトマイシン | 2.5ミリリットル/ 500ミリリットル |
| ナイスタチン | 1.0ミリリットル/ 500ミリリットル |
| ゲンタマイシン | 1.5ミリリットル/ 500ミリリットル |
| ブドウ糖 | 1.8グラム |
| ウシ胎仔血清 | 最終容量の10％を |
表1 H2G +ヨコバイ培地成分。
Hの1。イメージ図vitripennis CE100X TMで取り込まin vitroでのLL成長。 （A）細胞2日間（48時間）後の経過出展アタッチメントおよび線維芽細胞の開発。（BE）細胞4、6、8および10日後に継代培養表面にわたって成長を続けて。（F）単層の形成が起こる〜10 14日。スケールバー：100μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：H.感染100X TMで画像化vitripennis細胞が形態変化をキャプチャします。接種の前に（A）線維芽細胞増殖。（B）細胞を24時間感染後（C）細胞を48時間感染後96時間後の感染細胞が持っている（D）ほとんどが培養表面から剥離し、媒体が白濁している。スケールバー：100μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ウイルス量は実験期間中、毎日のために受信と標準偏差バーをここに示されていますによって実験試料の平均生細胞数を示す図3棒グラフ。生細胞数の平均は、実験試料について計算した。 。細胞数が低いウイルス量で〜144時間の感染後における生細胞数の高いウイルス負荷および有意な減少と生細胞が有意に減少〜72時間後に感染を示し、平均してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
H.非感染対照と比較して、五つの異なるHOCV-01治療の図4カプラン·マイヤー生存分析vitripennis細胞培養物。対照培養は、5つの治療群と比較して100％の生存率を維持した。最低の生存確率が高い治療群で見られたし、全ての処置群では168時間はn = 10でゼロ生存確率に向かう。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ふぃぎゅ24時間間隔で10万濃度：Homalodisca vitripennis細胞はシリアルに感染していた5。コントロールの共焦点画像や感染したH.vitripennis細胞再1:10 1 HOCV-01に希釈した。細胞は、培養物中のF-アクチンおよび核を可視化するためにローダミン - ファロイジンおよびDAPI汚れで処理した。共焦点画像は63Xで取得され、低および高ウイルス希釈液の両方で72時間後に細胞形態にブレークダウンが表示されました。スケールバー：1μm以下、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
侵略的な農業の種の流入に関するライジング懸念は、新興害虫や病原体から身を守るための新たな方法論の需要増加につながりました。病気の予防と管理の焦点は、病原体のベクトルの管理を含み、この研究の主な対象となった。経済性、実用的なアプリケーションは、大面積にわたって、低コスト12に大量である必要があるため、農業において、病原ベクトルを管理するためのバイオ農薬のこのタイプを生成するための決定において重要な役割を果たしている。研究開発のための細胞培養を利用する実施は、ますます一般的になっている、そのようなものとして、本研究の影響は重要である。経済的に実現可能な統合された害虫管理（IPM）の戦略を特定することは世界的に継続的な成功の農業生産への鍵であり、本研究における知見は、IPM戦略を改善し、ブドウのPDの発生を低減するの進展に貢献します。
H. vitripennis細胞培養物を増殖させ、目に見える形態的劣化させることなく1年以上維持された。継代数が急激に細胞の代謝及び増殖特性13を変更することにより、哺乳動物細胞におけるインビトロ試験の結果に影響を与えることができる。細胞は、 インビボおよびインビトロで複製するように、テロメアは、細胞複製の各ラウンドで短縮し、最終的にテロメアが短くなりすぎ限界に達し、細胞老化14を誘導する。重度のテロメア短縮が発生すると、遺伝的不安定性、最終的に危機、あるいは大量の細胞死が15を発生する。この現象、文化はほとんど50継代培養または1年を超えて生き残るないため、以下の基準に基づいて、ヘイフリック限界とみなさ：セックスのクロマチン、histotypical分化、不応症の保持を文化、非悪性in vivoでの特性、栽培の有限制限を一時停止する一次組織と同様の細胞形態、細胞株と比較しコクサッキーウイルスA9受容体物質の保持を、酸の産生を増加させ、16を開発することができた株を容易にする。継代数の潜在的な合併症は、細胞株の増殖のこの方法は、長期間にわたって継続的な生産が可能であることを示す本研究の期間中には観察されなかった。生きた昆虫飼育や他の高価かつ複雑な製造方法を超える細胞培養物の利用は急速に多くの分野にわたって一般的になってきているので、細胞株のこの種の寿命は多くの実用的な用途を有する。適切に維持する場合、単一の一次細胞株は、ウイルス産生の複数のラウンドのために使用することができる。
これらの細胞の成功した長期維持に2つの主な要因は、新たに接種した培養物と、適切な媒体を製造するための妨害の時間でした。最初の4のために手付かずのままであった文化通過後の8時間は、その初期ウィンドウ内で移動されたものと比較して、クロスフラスコ成長の著しい増加を示した。静置すると、細胞の迅速な複製は、培養フラスコで、わずか10日間でポスト通過を単層を達成しました。ミディアム準備は限り一般的な培養の健康が心配していたように外乱時間と研究の間のような不可欠でした。でも、培地中に存在する抗生物質で、細菌汚染は依然としてメディアを準備する際に考慮すべき重要な要因であった。細菌汚染のほとんど存在しない要因に還元されたため、培養液に使用する前に、数日間室温で維持する媒体の一定分量を可能にすることにより、文化の壊滅的な一連の可能性が崩壊する。ゲンタマイシンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質は、一般に細胞、および任意の外部の汚染物質内に見出さ細菌と戦うために細胞培養培地で使用されている。これらの抗生物質の両方を、哺乳動物培養における細胞増殖の抑うつに関連している細菌17,18の抗生物質耐性株を発症する可能性を増大させるための無菌技術の利用の減少と懸念するD。抗生物質は、過剰に使用するべきではありません。しかしながら、それらの使用は、細胞培養の汚染の問題を防ぐために必要である。
これらの因子の影響は、細胞のアップスケーリング生産は、細胞培養物の品質を確保するマイナーステップのバイオ農薬物質の迅速な大量生産のための実行可能な選択肢であるようなものである。バイオリアクターは、1950年代と1960年代に登場し、それ以来、時間19の非常に短時間で細胞の数十億を生成する効率的な手段を提供するために進化してきた。バイオリアクターの多くの種類は劇的H.の数を増加させるために利用することができる存在vitripennis細胞は、一度に生産され、生産システムのこの種の開発プロセスは、往復剪断防ぐために細胞を処理する方法の開発を必要とするバイオリアクターにおけるm個の成長面。
細胞株の成功した継続的な成長はHOCV-01の複製に不可欠であると一旦達成インビトロ複製およびどのくらいのウイルスが培養物内に残留させるべきで定量化のために必要とされるどのくらいのウイルスの問題に対処するために使用することができる。明らかな相関が細胞によって受信された最初のウイルス負荷量と時間ウイルス粒子の持続時間の間に見出されたが、細胞内でインキュベートすることが許された。急速なウイルス複製を示す細胞死に対する時間要件、低いウイルス負荷が受信高い。しかしながら、全ての処置を横切る細胞数は包括的な細胞培養生存閾値を示す、約25×10 4細胞/ mlの閾値144時間後に感染以下に低下した。結果は、ウイルスのより大きな量は、初期感染のために容易に利用可能である場合には大量のウイルスを迅速に製造することができることを示している、またはそのincreウイルスの量は、低い初期用量で長期間にわたって産生され得るASED。濃度と時間の要因との関係の変動は、72〜96時間の感染後の最適なウイルスの抽出時間を持つ大規模な研究のための制作オプションでいくつかの柔軟性を可能にする。
ウイルスの研究のための細胞培養物を使用して、標的ウイルスを検出し、研究の結果を定量する能力に依存する。このための信頼できる方法は、実験試料中のウイルスRNA配列の存在を確認するためにPCRを使用することである。本研究におけるPCRデータからCt値の分析は、ウイルスの最適な抽出時間がどうなるかに明確な答えを与えるものではありません。しかし、決定的な抽出時間の不足は、in vitroで HOCV-01を複製することができないのが、ウイルス研究の敏感な性質を示すものではありません。トリパンブルーを用いて細胞数は、最適な抽出時間をより明確にビューに貸すが、決してDEFINITIVというわけでありませんかE回答。細胞死データは、高ウイルス量が非常に培養中の細胞が死に始めるように48時間および72時間後に感染の間にウイルスの抽出は、ウイルス粒子の細胞破壊を減少させるために理想的であり得ることを示している、72時間後の細胞生存性の低下につながることを示している指数関数的に。低い初期ウイルス負荷における抽出時間は、より曖昧であるが、144時間後の細胞生存性が劇的に減少すると、それは最適な抽出時間は24であろうと推測することができる - その時点の前に48時間。最適なウイルスの抽出時間の決定は、Hに対して使用するため生物農薬の効果的な生産に不可欠ですvitripennis蔓延し、この研究では、それらの時の決定に向けた重要な一歩を踏み出した。
顕微鏡検査は、細胞培養分析のための重要なツールであり、この研究は、H.で共焦点顕微鏡を使用する最初の一つであるvitripennis細胞。イメージングタンパク質の付着の増加または減少との豊富細胞核は、in vitroで HOCV-01の細胞内活性に、より詳細な研究に向けた最初のステップです。この研究を通じて、細胞培養物を、目に見える形態学的劣化を維持した。後続の各セルを通過した後、正常な線維芽細胞成長は、単層の形成に続いて、観察された。細胞は、形状及びサイズで均一のままであった。感染した培養物は、共焦点顕微鏡で画像化したときしかし、細胞形態の減少は、高いおよび低い初期ウイルス負荷の両方で、特に72時間の時点で観察された。小さな穴状構造は、おそらく細胞死に起因し、細胞内物質の放出、細胞表面上で見ることができた。フラスコ表面を横切る細胞はしなび、最終的に表面から剥離し始めた。より高解像度の顕微鏡検査は、この最初の使用からの影響は、細胞生存性分析で見られた結果と相関して増加したウイルスの研究のための他の可能な用途を生じさせる。高度なマイルHOCV-01に対する抗体の開発を行った場合croscopy技術がその最大能力に利用することができる。このウイルスに対する抗体は、ウイルス粒子の細胞間の仕組みの可視化が可能になるだけでなく、増殖率、さらにより正確な抽出時間を決定するのを助けることができます。
細胞の大バイオマスウイルスのために収穫した後、フィールドに適用される点に効果的な生物的防除剤を製造するために本研究で開発した製造方法をスケールアップするプロセスは、主にコストの問題である。収益性、細胞およびウイルスの生産、細胞培養培地コスト、適用率、生産規模バッチ製造コスト12：大規模なシステムを構築する初期コストが高く、多くの要因のような、考慮されなければならないれる。初期費用にもかかわらず、潜在的な給与額は、投資価値があります。細胞培養技術を利用して、ストリームの精製の問題まで大幅に低減される腸微生物の可能性を引き起こし、全身の昆虫の中に見られる他のウイルスが大幅に削減されるだけでなく、ライブ昆虫のメンテナンスや飼育のための設備コスト。
細胞培養は、すでにタンパク質、バイオ農薬や他の医薬品の製造のために利用されると、この領域の研究のための経済的価値が増加している。農業における生物農薬の大規模生産のためには、大きな細胞増殖システムを使用して、ここに完了したがものと同様の研究を試みることが有益であろう。バイオリアクターおよび3Dマトリックスセル成長システムの新たな方法論は、細胞の大きな量産を可能と、ウイルス産生20の同じ面で、より大容量。大規模なシステムを構築する初期コストが高いものの、製造することができる生成物の量のペイオフはさらに大きくなる可能性がある。大幅に大規模システムのdescribにおける伝送の研究を促進する貸すだろう研究分野edは、上記抗体デザインです。抗体の設計は、それが時間がかかり、詳細なプロセスですが、HOCV-01のために、それは、共焦点顕微鏡を用いてin vitroでのウイルス活性の可視化を可能にし、他につながる可能性がHIVやC型肝炎のような病気のためのウイルスの研究でますます使用されてきた調査の分野。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cell culture flasks | Sigma Aldrich | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Inverted microscope and camera | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049 | 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Sigma Aldrich | M8937 | 48 wells (TC treated with lid) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma Aldrich | CLS431206 | Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 ml |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Polyethylene glycol hexadecyl ether |
| Phosphate buffer solution | Sigma Aldrich | P5244 | Received as 100 mM diluted to 10 mM with sterile water |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | For electrophoresis |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, for molecular biology, powder |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Reagent grade, crystalline |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Phosphate buffered saline |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Rhodamine red-conjugated phalloidin | Life Technologies | R415 | Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Confocal System | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace’s Insect medium (supplemented, 1x) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ leafhopper medium component |
| L-histidine monohydrate | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 199 (10x) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 1066 (1x) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ leafhopper medium component |
| Hank’s Balanced Salts (1x) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ leafhopper medium component |
| L-Glutamine (100x) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ leafhopper medium component |
| MEM, amino acid mix (50x) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ leafhopper medium component |
| 1 M MgCl solution | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ leafhopper medium component |
| Pen-Strep (w/ glutamine) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ leafhopper medium component |
| Nystatin | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ leafhopper medium component |
| Gentamycin | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ leafhopper medium component |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ leafhopper medium component |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ leafhopper medium component |
References
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