Summary
Her præsenterer vi en protokol til at udbrede Homalodisca vitripennis celler og HoCV-1 in vitro. Medium blev fjernet fra HoCV-1-positive kulturer og RNA ekstraheres hver 24 timer til 168 timer. Cell overlevelsesevne blev kvantificeret ved trypanblåt-farvning. Hele viruspartikler blev ekstraheret efter infektion. Ekstraheret RNA blev kvantificeret ved QRT-PCR.
Abstract
Den glasagtige-vingede skarpskytte (Homalodisca vitripennis) er en yderst vagile og polyphagous insekt fundet i hele det sydvestlige USA. Disse insekter er de fremherskende vektorer for Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), en veddet begrænset bakterie, der er det agens af Pierce sygdom (PD) for Grapevine. Pierce sygdom er økonomisk skadelig; således, H. vitripennis er blevet et mål for patogen ledelsesstrategier. En dicistrovirus identificeret som Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) er blevet forbundet med en øget dødelighed i H. vitripennis befolkninger. Fordi en værtscelle er nødvendig for HoCV-01 replikation, cellekultur giver et ensartet miljø for målrettet replikation, som er logistisk og økonomisk værdifulde for biopesticid produktion. I denne undersøgelse, et system for storstilet udbredelse af H. vitripennis celler via vævskultur blev udviklet, sroviding en viral replikation mekanisme. HoCV-01 blev ekstraheret fra hele kroppen insekter og anvendt til at inokulere dyrkede H. vitripennis celler med forskellige niveauer. Dyrkningsmediet blev fjernet hver 24 timer til 168 timer, RNA ekstraheret og analyseret med QRT-PCR. Celler blev farvet med trypanblåt og talt for at kvantificere celle overlevelsesevne ved hjælp af lysmikroskopi. Hele viruspartikler blev ekstraheret op til 96 timer efter infektion, hvilket var den tid, der bestemmes til at være, før den samlede cellekultur sammenbrud forekom. Cellerne blev også udsat for fluorescensfarvede og vises ved hjælp af konfokal mikroskopi til at undersøge viral aktivitet på F-actin tilknytning og kerner integritet. Konklusionen på denne undersøgelse er, at H. vitripennis celler er i stand til at blive dyrket og anvendt til masseproduktion af HoCV-01 på et passende niveau for at muliggøre produktionen af en biopesticid.
Introduction
Den glasagtige-vingede skarpskytte (Homalodisca vitripennis Germar 1821) er blevet identificeret som den fremherskende vektor af Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), det agens af Pierces sygdom i Grapevine (PD) i Nordamerika 1. Insekt befolkning ledelse er hurtigt blevet fokus for forskning til bekæmpelse af denne ødelæggende problem for vinavl industrien i Californien og på tværs af sydlige USA. En positiv-sense, enkeltstrenget RNA-virus, der tilhører familien Dicistroviridae, Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) er blevet identificeret i vild H. vitripennis befolkninger og vist sig at øge dødeligheden i disse populationer 2-4, og samtidig sænke insektets resistens over for insekticider.
Udvikling af metoder til effektivt bag inficeret H. vitripennis til fuldvoksen i et laboratorium indstilling har været vanskeligt, fordi
Det overordnede mål med følgende procedurer er at producere en høj koncentration af HoCV-01 er egnet til anvendelse som et biologisk bekæmpelsesmiddel. Viral replikation kræver en levende celle, hvilket er grunden til succes dyrke og optimere H. vitripennis kulturer er afgørende for fremskridt producere rentable niveauer af virus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur
BEMÆRK: Homalodisca vitripennis cellelinjer oprettet af Dr. Wayne Hunter laboratorium på USDA Agricultural Research Service (. Ft Pierce USA) blev anvendt til at indlede en lab lager bestående af blandede celle faser, herunder indledende fibroblaster og monolag.
- Udfør følgende procedurer i et sterilt laboratorium miljø holdes ved en temperatur i området 20-24 ° C med 25 cm 2 dyrkningskolber.
- Dyrk og vedligeholde kulturer i 25 cm2 vævskulturkolber hjælp H2G + cikade medium, en modificeret WH2 honningbi medier 10 (tabel 1).
- Inkuber dyrkningskolber ved 24 ° C med ~ 53% fugtighed.
- Brug en omvendt mikroskop ved en total forstørrelse (TM) af 100X til at overvåge vækst kultur, fx tjek for enhver unormal cellevækst, overvåge for eventuelle potentielle kontaminanter og kontrollere væksten fremskridt på tværs af culratur overflade.
- Udfør en komplet medium ændring (~ 4 ml dyrkningsmedium pr flaske) hver 7 - 10 dage uden at forstyrre kultur overflade.
- Pass kulturer når kulturen overfladen er omkring 80% dækket af cellevækst (sammenflydende) under anvendelse af 0,25% trypsin indeholdende ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) for at dissociere cellerne. Tilføj ~ 2 - 3 ml trypsin til hver dyrkningskolbe og eksponere kulturen (s) til enzymet i korte perioder (5 - 10 min) for at opnå fuldstændig celledissociering.
- Tilføj en tilsvarende mængde frisk medium til kulturen kolben (s) (~ 2 - 3 ml) for at stoppe enzymaktivitet og overføre hele løsningen til et konisk rør til centrifugering.
- Pelleter cellerne ved centrifugering ved 4 ° C i 6 minutter ved 350 x g.
- Fjern supernatanten uden at forstyrre cellepelleten og tilføje ~ 8 ml frisk medium til hvert rør. Homogeniseres forsigtigt celler ved hjælp af en pipette.
- Split kulturer i en 1: 2 forhold til 25 cm 2 kolber (~ 4 ml celle solutiom pr kolbe) og forlade frisk passeret kulturer uforstyrret i 48 timer for at tillade celler i suspension at fastgøre sikkert til overfladen af kolben.
BEMÆRK: Dyrkning af celler i 48-brønds sterile vævskulturplader med en vækst overflade på 1 cm2 er også muligt, og de kan holdes på samme måde som dyrkningskolber med en reduktion i mængden af dyrkningsmedium til ~ 250 pi.
2. Hel Virus Extraction
- Homogenisere hele kroppe af virus positiv H. vitripennis i fosfatbuffer, pH ~ 7,2, med 0,02% natriumdiethyldithiocarbamat trihydrat (DETCA) ved hvirvelbehandling i ~ 10 sek mellemrum, indtil der ikke er flere store klumper af væv til stede. Uddrag virus via SuperSpeed centrifugering ved 124.500 x g i 4 timer ved 4 ° C eller 22.000 xg i 16 timer ved 4 ° C. Dannes der bundfald i toppen, skal du fjerne det med en steril vatpind 11.
- Supernatanten kasseres.
- Saml pillen ogopløses med 5 ml 10 mM phosphatpuffer (ingen DETCA), pH ~ 7,2, indeholdende 0,4% Na-deoxycholsyre og 4% polyethylenglycol hexadecyl-ether (Brij 52).
- At blande pelleten godt fjerne pillen fra siden af røret og knuse indtil i opløsning, hvis det er nødvendigt.
- Tilføj flere 10 mM fosfatbuffer i ~ 5 ml trin til at hjælpe pillen går i opløsning, hvis behov og kombinere til 2 rør 11.
- Centrifugeres opløsningen ved 300 xg i 15 minutter 11.
- Supernatanten fjernes, og sendes gennem et 0,45 um filter, og filtratet i store samling røret 11 indsamler.
- Overførsel filtratet til en dialysemembran med en molekylvægt (MWCO) på 3,5 kD, ved hjælp af små mængder af 10 mM phosphatbuffer (pH 7) indeholdende ingen DETCA hvis nødvendigt 11.
- Placer dialysemembran i et stort bægerglas fyldt med dobbeltdestilleret 2 O ved 4 ° C. Skift Hedeselskabet 2 O hver time feller 5 - 6 timer, indtil et hvidt bundfald i membranen 11.
- Opsaml det oprensede virus i membranen og underkaste 100% virus opløsning til en 10-fold fortyndingsrække ved tilsætning af 10 ml af opløsningen til 90 pi ddH 2 O. Efterfølgende tilsættes 10 ul af fortynding til yderligere 90 pi Hedeselskabet 2 O, indtil den når en fortynding på 1: 100.000.
- Opbevar virusopløsning ved -80 ° C.
3. Viral Replication
- Seed celler i 48-brønds dyrkningsplader og vokse alle rækker indtil cellevækst er 80% sammenflydende (ca. 72 timer efter aflevering hvis cellerne vokser med en gennemsnitlig hastighed).
- Podes hver række af celler med den serielle fortyndet virus, når cellevækst når konfluens, dvs én række af en 1:10 fortynding, en række af en 1: 100 fortynding, etc., bortset fra den øverste række. Brug den øverste række som en kontrol, og der tilsættes 10 ul Hedeselskabet 2 O til hver samt en volumenkontrol.
- For at etablere en startkoncentration baseline celle til sammenligning med eksperimentelle celletal, afstand og tælle den første brønd af hver række forud for den første podning af eventuelle brønde i kulturerne med virus.
- Overvåg dyrkningspladerne hver 24 timer efter viral inokulering for enhver farveændring i mediet indikerer en pH-ændring og for forandringer i celle morfologi.
- Billede en kolonne af testpladen på hvert tidspunkt ved anvendelse af et inverteret mikroskop ved 100X TM.
- Fjern alle medier fra kolonnen, der blev afbildet ved hver 24 timers tidspunkt og gemme det på kort sigt ved -20 ° C til RNA-ekstraktion og viral kvantificering eller lang sigt ved -80 ° C.
- Dissociere celler fra brøndene efter fjernelse af mediet som tidligere beskrevet i trin 1,6-1,9, der kun bruger ~ 250 pi 0,25% trypsin EDTA og frisk medium for at stoppe enzymaktivitet og ~ 250 ul frisk medium til at re-suspendere cellen pellet.
- Der tilsættes 10 ul 0,4% trypanblåt plet til hvert rør, der indeholder celler, for at udføre celletællinger efter celledissociering for hver 24 timers periode i løbet af en uge. Lad pletten til at sidde i 10 minutter, før du udfører celletallet.
- Udfør celletal inden for 1 time af eksponering for pletter eller levedygtige celler vil begynde at optagelse plet såvel som ikke-levedygtige celler.
- Langsomt tilsættes 10 ul af den farvede celle løsning på hver side af en standard hæmocytometer under anvendelse af en mikropipette. Lad opløsningen tages op ved kapillarvirkning for at undgå luftbobler.
- Tæl antallet af levedygtige (ikke-farvede celler) på begge sider af hæmocytometeret (svarende til 4 tællinger af de 16 pladser i hæmocytometeret). Udfør celletal for hver brønd af den kolonne, der blev fjernet.
- Gennemsnittet af celletal fra hver kolonne og bruge følgende formel til at opnå den totale celletal nummer: (gennemsnitligt antal celler / 4) x fortyndingsfaktor = antal celler x 10
4. Virus Udsugning fra Cell Culture
- Fjern behandlet H. vitripennis celler fra dyrkningskolber som tidligere beskrevet i trin fra 1,6 til 1,8, ved hjælp af kun ~ 250 pi af 0,25% trypsin EDTA og frisk medium for at stoppe enzymaktivitet.
- Supernatanten kasseres.
- Uddrag virus fra kultur-celler efter den tidligere beskrevne i trin 2.3 protokol - 2,8.
5. RNA-ekstraktion
- Uddrag RNA fra mellemstore prøver indsamlet i løbet af hver en uges virus undersøgelse med guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform ekstraktion beregnet til flydende prøver pr fabrikantens protokol.
- Opbevar det ekstraherede prøver ved -80 ° C.
6. RT-PCR
- Etablering af virale standarder for RT-PCR ved at køre traditionelle PCR ved anvendelse afprimerpar HoCV RT-PCR-primer 1 (frem 5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 ', omvendt 5'-ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3') med virusisolat fra hele kroppen H. vitripennis.
- Om PCR-produkt til gel elektroforese i 60 minutter ved 120 V i en 2% agarosegel indeholdende 0,1% ethidiumbromid.
- Udskære bånd fra gelen og renses ved hjælp af en gelekstraktionskit pr fabrikantens protokol.
- Pool alle udskåret og geloprenset produkt og yderligere rensning ved basisk ethanoludfældning. Elueres udfældning produkt i omkring 30 pi Tris-EDTA (TE) at øge den samlede prøve koncentration.
- Kvantificer niveauet af cDNA i poolede prøver via spektrofotometri hjælp 260/230 bølgelængde indstillinger for nukleinsyredetektion.
- Udfør en ti-fold seriefortynding serie oprenset prøve i området fra 57 ng / pi til 57 ag / ul (10 -18). Udfør den serielle fortynding svarende til den, der er beskrevet in 2.8 med justeringer for forskellen i kz krav.
- Bestem detektionsgrænser for fortyndingsrækken ved at udføre QRT-PCR under anvendelse af en QRT-PCR kit med pålidelig kvantificering af med lav hyppighed transkripter.
BEMÆRK: Viral koncentrationer lavere end 5 x 10 -3 kopier ikke påvises. - Uddrag RNA fra eksperimentelle prøver som beskrevet tidligere i trin 5.1 og kvantificere ved hjælp af spektrofotometri.
- Normalisere alle de ekstraherede prøver til 5 ng / ul hjælp nukleasefrit vand.
- Udfør QRT-PCR på alle prøver, i dubletter, som 25 pi reaktioner ved hjælp af en et-trins QRT-PCR-kit med evnen til at sanse lavt kopiantal som følger: 50 ° C hold i 10 minutter; 95 ° C hold i 5 minutter; 30 cyklusser af 95 ° C i 10 sek, 60 ° C i 30 sek; smelte 50-99 ° C i 5 sekunder på hvert trin.
- Gør stamblanding således at hver reaktionsblanding indeholder 12,5 pi 1x Master mix, 1,0 pi (0,3 uM) af forward primer 1,0 pi (0,3 uM) af revers primer, 0,25 ul revers transkriptase og varierende mængder af skabelon baseret på standardiseringsorganer værdier.
- Bring det samlede reaktionsvolumen på 25 pi med RNase frit vand.
- Medtag fem standard koncentrationer i hver PCR køre med følgende kopiantal: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4, og 5 x 10 -2 eksemplarer. Indstil tærsklen for hver kørsel til lige under en fluorescens på 10x -2.5 at reducere støj i den tidlige overtagelse i begyndelsen af hver kørsel.
7. konfokalmikroskopi
- Grow Homalodisca vitripennis celler i en periode på tolv brøndsplade indeholdende dækglas måler 18 mm i diameter i hver brønd.
- Podes en kolonne på pladen hver 24 timer i en periode på fire dage, når et monolag er opnået. Sørg for, at hver Kolumn indeholder en kontrol godt, et lavt viral fortynding (1:10) godt og en høj viral fortynding (1: 100.000) godt. Brug virus løsninger opnået fra trin 2.8.
- Fjern alle medier på den femte dag og vaske cellerne to gange med 1x PBS (pH 7,4).
- Fix cellerne med kold 4% paraformaldehyd ved 4 ° C i 30 minutter.
- Tilsæt 500 pi 1x phosphatpufret saltvand (PBS) til cellerne og vaskes i 10 minutter ved stuetemperatur på en rocker ved lav hastighed. Vaskes cellerne tre gange.
- Tilsæt 500 pi 0,1% Triton X-100 til cellerne for at permeabilisere dem. Lad sidde i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Vask cellerne igen som tidligere beskrevet i trin 7.5.
- Tilsæt 500 pi af en bovin serumalbumin (BSA) opløsning på 5% for at blokere cellerne ved stuetemperatur. Lad sidde i 2 timer og derefter fjerne.
- Fortynd lager rhodamin red-konjugeret phalloidin (RCP) 1: 250 i 1x PBS indeholdende 5% BSA og tilsættes 250 ul af fortynding til hver brønd for at pletten til F-actin.
- Dækplade i aluminium folie for at forhindre farvestoffet fra blegning og inkuberes cellerne ved 4 ° CO / N.
- Fjern RCP efter 12 timer inkubation og erstatte det med 250 pi 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (250 ug / ml) fortyndes i 1x PBS indeholdende 5% BSA, at plette kernerne i cellerne .
- Inkubér cellerne indeholdende DAPI ved stuetemperatur i 1 time.
- Vask cellerne tre gange med 1x PBS som tidligere beskrevet i trin 7.5.
- Forsigtigt fjerne dækglas fra brøndene og mount til mikroskopobjektglas ved hjælp af en montering medier med en anti-fade reagens.
- Lad objektglassene tørre i lystæt kasser indtil ses under konfokal mikroskop. Vis fremstilles slides hurtigst muligt, da farvestoffer kan falme hurtigt.
- Billede farvede celler ved anvendelse af et konfokalt system, er udstyret med et mikroskop, der indeholder en 63X (olie) plan-apochromate linse.
- Indstil laser bølgelængder til 543 ± 10 nm excitation og 575 ± 10 nm emissionen for Rhoadmine røde conjucated phalloidin, Og 369 ± 10 nm excitation og 450 ± 30 nm emission for DAPI.
- Brug ens gevinst og indpresningsdybde indstillinger for detektoren at indhente alle billeder.
- Proces billeder ved hjælp af passende software til billedbehandling og sortering og import ønskede billeder til et billede styring software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellebinding og vækst sås inden for 48 timer af passage i både små og store dyrkningskolber, fra primære kulturer og fortsatte passager. Fibroblast vækst og udvikling blev også observeret inden for denne tidsramme. Når nyligt seedede kolber blev forstyrret før 48 timer, var der en synlig nedgang i celle vedhæftet fil, der fører til langsommere voksende kulturer og undertiden ingen tilknytning eller vækst overhovedet. Cellerne var omtrent 80% sammenflydende inden for en uge passerer og dannede et monolag i 10-14 dage (Figur 1). Primære kulturer, som blev dyrket ved indledningen af denne undersøgelse, har overlevet 30 + cellepassager uden nogen morfologiske forringelse eller generelle levedygtighed celle tilbagegang.
Cellebinding og vækst sås inden for 48 timer af passage fra kolber til plader. Monolag dannelse blev opnået i et kortere tidsrum, ca 5-6 dage, da det er en mindre vækst overflade. Inficerede kulturer fotograferet ent 100X under lysmikroskopi viste tegn på faldende celleform integritet. Ved 48 timer efter infektion, hvad der synes at være store huller var til stede på overfladen af celler. Tværs dyrkningskolber celler skrumpet og frigjort fra kulturoverfladen ca 72-96 timer efter at være inficeret med ikke-fortyndet HoCV-01 (figur 2).
Middel levende celletal til kontrol og eksperimentelle prøver blev beregnet og plottet at skildre forskelle i overflod af levende celler mellem virale belastninger over tid (figur 3). En konsekvent stigning i levende celler til kontrol-gruppen er til stede, hvilket indikerer, raske celler. Forholdsvis, alle behandlingsgrupper havde en markant nedgang i antallet af levende celler til stede over tid. De højere virale behandlingsgrupper indikerer en langt mere markant nedgang i kultur sundhed med et stort fald i levende celler mellem 48-72 timer, mens de lavere virale grupper langsomt falde indtil springer fra omkring 144 timer. En to-vejs ANOVA with Bonferroni post-hoc analyse blev anvendt til at teste forskelle i cellekultur dræbe satser med HoCV-01 er baseret på levende celletal i hver behandlingsgruppe sammenlignet med hvert tidspunkt i undersøgelsen, såvel som mellem grupperne. De to-vejs variansanalyse havde en signifikant hovedvirkning af tidsfaktoren, F (7, 432) = 82,5, p <0,0001, hvilket tyder på, at længden af tid kulturer blev udsat for en behandling påvirket kultur levetid. Effekten af den type behandling kulturer fik, var signifikant samt, F (5, 432) = 170,6, p <0,0001, hvilket indikerer, at mængden af virusmængden en kultur oprindelig modtager påvirker kultur overlevelse. En væsentlig effekt i samspillet mellem tidsfaktoren og behandling faktor er også til stede, F (35, 432) = 17,63, p <0,0001, hvilket understreger, at jo højere virusmængden modtog kortere tid er nødvendig for at reducere kultur fitness og omvendt jo lavere virusmængde, denlængere tid, der kræves for den samme virkning. Bonferroni post hoc-test viser en signifikant forskel mellem behandling og kontrol grupper, hvilket indikerer en bemærkelsesværdig dosis respons.
Sandsynlighed for overlevelse af celler podet med højere virale behandlinger var lavere som testet af Kaplan-Meier kurver (figur 4), korrelerer til konklusionerne fra den gennemsnitlige levende celletal analyser. Der var en overlevelsesprocent på 100% for kontrol eller ikke-inficerede celler. Celler udsat for de høje virale behandlinger havde et markant fald i overlevelse sandsynlighed over tid, mens lavere virale behandlinger har en større sandsynlighed for at overleve, indtil 144 timer, og derefter et fald i overlevelse sandsynlighed er til stede. Cox proportionel risiko modelanalyse ikke var signifikant, behandling coeff = 0,8812 (95% CI [0,76, 1,02]), p> 0,05. Selvom det ikke er signifikant, det tyder på, at celler udsat for virus, er 88% mere tilbøjelige til at udvise lavere overlevelsesrater over tid.
For hver QRT-PCR-kørsel, de højere virale standarder optrappet tidligere end lavere virale standarder og eksperimentelle prøver. Fra hver kørsel replikere Ct-værdier blev analyseret under anvendelse af en to-vejs ANOVA for at teste for forskelle i overflod af HoCV-01-RNA til stede i eksperimentelle prøver og sammenligne værdier til flere styreværdier. De to-vejs variansanalyse viste ingen signifikant hovedvirkning af tidsfaktoren, F (7, 289) = 0,38, p> 0,05, eller i samspillet mellem tid og behandlingsgrupper, F (63, 289) = 0,14, p > 0,05. En signifikant hovedvirkning mellem behandlingsgrupper, F (9, 289) = 135,7, p <0,0001, hvilket indikerer, at mængden af virus i første omgang introduceret til cellekultur påvirker mængden af virus-RNA opdaget blev observeret. Bonferroni post hoc-test blev kørt og vise signifikante interaktioner mellem behandlingsgrupper og kontrolforanstaltninger, men ingen signifikante interaktioner mellem behandling groups alene, hvilket indikerer ingen målbare dosisrespons.
Forskelle i celle morfologi sunde og HoCV-01 inficerede H. vitripennis celler ved 24 og 72 timer blev set under fluorescens. Nedgangen i antallet af kerner til stede samt misdannet udseende F-actin i celler udsat for HoCV-01 sammenlignet med kontrolgruppen viser, at virus har en stor indvirkning på kultur sundhed. Celler udsat for højere 01:10 virusmængden viste større nød end celler udsat for den nedre viral behandling. Kontrol celler synes mere rigelige og har normal morfologi mellem de to tidspunkter (figur 5).
| Graces Insect medium (suppleret 1x) | 210 ml |
| 0,06 M L-histidin monohydrat opløsning (pH = 6,5) | 290 ml |
| Medium 199 (10x) | 10 ml |
| Mellem 1066 (1x) | 17 ml |
| Hanks Balanced Salts (1x) | 33 ml |
| L-Glutamin (100x) | 1,5 ml |
| MEM aminosyre mix (50x) | 1,5 ml |
| 1 M MgClz-opløsning | 6 ml |
| Pen-Strep (w / glutamin) | 2,5 ml / 500 ml |
| Nystatin | 1,0 ml / 500 ml |
| Gentamycin | 1,5 ml / 500 ml |
| Dextrose | 1,8 g |
| Kalvefosterserum | 10% af det endelige volumen |
Tabel 1. H2G + cikade mediumbestanddele.
Figur 1. Billeder H. vitripennis cell vækst in vitro fanget på 100X TM. (A) Celler to dage (48 timer) efter passage udviser tilknytning og fibroblast udvikling. (BE) Celler fire, seks, otte og ti dage efter passage fortsætter med at vokse på tværs af kultur overflade. (F) monolag dannelse forekommer ~ 10- 14 dage. Skalapanelerne:. 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Inficerede H. vitripennis celler afbildes på 100X TM fange morfologiske ændringer. (A) fibroblastvækstfaktor forud for inokulering. (B) Celler 24 timer efter infektion. (C) Celler 48 timer efter infektion. (D) 96 timer efter infektion celler harhovedsagelig løsrevet fra kultur overflade og medie er blevet uklar. Skalapanelerne:. 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. søjlediagram, der viser: levende celletal for eksperimentelle prøver.: Levende celletal blev beregnet for eksperimentelle prøver af virusmængden modtaget for hver dag i løbet af forsøgsperioden og er vist her med standardafvigelse barer. Gennemsnitligt celletal viser et signifikant fald i levende celler ~ 72 timer efter infektion med høj viral belastning og signifikante fald i levende celletal på ~ 144 timer efter infektion med lavere virusindhold. venligstKlik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Kaplan-Meier overlevelse analyse af fem forskellige HoCV-01 behandlinger sammenlignet med en ikke-inficeret kontrol i H. vitripennis cellekulturer. Kontrolkulturer opretholdt en overlevelse på 100% i forhold til de fem behandlingsgrupper. Den laveste overlevelse sandsynlighed blev set i den høje behandlingsgruppe og alle behandlingsgrupper hovedet mod nul overlevelse sandsynlighed på 168 timer, når n = 10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figu. Ad 5. Konfokale billeder af kontrol og inficerede H.vitripennis celler Homalodisca vitripennis celler blev inficeret med seriel fortyndet HoCV-01 i 1:10 og 1: 100.000 koncentrationer på 24 timers intervaller. Cellerne blev behandlet med rhodamin phalloidin og DAPI pletter at visualisere F-actin-og kerner inden kulturerne. Konfokal billeder blev taget til fange ved 63X og vise en pause ned i celle morfologi på 72 timer ved både lave og høje virale fortyndinger. Skalapanelerne:. 1 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stigende bekymringer vedrørende tilstrømningen af invasive arter af afgrøder, har ført til en øget efterspørgsel efter nye metoder til at forsvare sig mod nye skadedyr og patogener. Fokus forebyggelse og håndtering sygdommen indebærer håndtering af patogene vektorer og var det primære mål for denne undersøgelse. Økonomi spiller en afgørende rolle i beslutningen om at producere denne type biopesticid at styre patogene vektorer i landbruget, fordi den praktiske anvendelse skal være store mængder over store områder, men til en lav pris 12. Den praksis at udnytte cellekultur for forskning og udvikling er blevet mere og mere almindeligt som sådan virkningerne af denne undersøgelse er væsentlige. Identifikation økonomisk gennemførlige integreret skadedyrsbekæmpelse (IPM) strategier er nøglen til fortsat succes landbrugsproduktion verdensplan og resultaterne i denne undersøgelse bidrage til fremskridt i forbedringen af IPM-strategier og reducere forekomsten af PD for Grapevine.
H. vitripennis cellekulturer blev opformeret og opretholdt i over et år uden nogen synlig morfologisk forringelse. Passage numre kan drastisk påvirke resultaterne af in vitro-studier i pattedyrsceller ved at ændre celle metabolisme og vækst variablerne 13. Som celler replikere in vivo og in vitro, telomerer forkorte med hver runde af cellereplikation og til sidst nå en kritisk grænse, hvor telomerer bliver for kort, og inducere cellulær ældning 14. Når svær telomer afkortning sker, genetisk ustabilitet og endelig krise eller massiv celledød indtræffer 15. På grund af dette fænomen, kulturer sjældent overleve over 50 subcultivations eller et år anså Hayflick Limit, baseret på følgende kriterier: tilbageholdelse af køn kromatin, histotypical differentiering inadaptability at suspendere kultur, ikke-maligne egenskaber in vivo, finite grænse for dyrkning, Svarende cellemorfologi til primær væv, øget syre produktion i forhold til cellelinjer, tilbageholdelse af Coxsackie A9 receptor stof og lethed, hvormed der kan udvikles stammer 16. De potentielle komplikationer numre passage blev ikke observeret i løbet af denne undersøgelse indikerer, at denne metode cellelinie formering er i stand til kontinuerlig produktion over længere perioder. Da anvendelse af cellekultur i levende insekt opdræt eller andre dyre og komplicerede fremstillingsmetoder er hurtigt ved at blive almindeligt blandt mange fagområder, levetiden af denne type cellelinje har mange praktiske anvendelser. Hvis vedligeholdes ordentligt, kan en enkelt primær cellelinie bruges til flere runder af virus produktion.
De to vigtigste faktorer i en vellykket vedligeholdelse af disse celler langsigtede var forstyrrelse tid til frisk seedede kulturer og ordentlig medium forberedelse. Kulturer, der forblev urørt i de første 48 timer efter passage viste en markant stigning i på tværs af kolbe vækst i forhold til dem, der blev flyttet inden denne første vindue. Når uforstyrret, hurtig replikation af celler opnået monolag i så lidt som ti dage efter passage i dyrkningskolber. Medium forberedelse var så afgørende i løbet af undersøgelsen, da forstyrrelse tid så langt som generel kultur helbred var bekymret. Selv med antibiotika er tilstede i mediet, bakteriel forurening var stadig en vigtig faktor til at overveje, når de udarbejder medium. Ved at tillade portioner af mediet til at forblive ved stuetemperatur i flere dage før brug i kulturer, er sandsynligheden for en ødelæggende serie af kultur kollapser på grund af bakteriel forurening blev reduceret til et næsten ikke-eksisterende faktor. Antibiotika, såsom gentamicin og streptomycin, er almindeligt anvendt i celledyrkningsmedium til bekæmpelse af bakterier, der findes i cellerne og alle uden forurening. Begge disse antibiotika har været knyttet til en nedtrykning af cellevækst i kulturer mammale end til et fald i anvendelsen af aseptisk teknik og bekymring for at øge sandsynligheden for at udvikle antibiotikaresistente bakteriestammer 17,18. Antibiotika bør ikke anvendes for meget; imidlertid er nødvendigt for at undgå cellekultur forurening problemer deres anvendelse.
Konsekvenserne af disse faktorer er således, at opskalering produktion af celler er en farbar vej for hurtig masseproduktion af biopesticid materialer med mindre skridt for at sikre kvaliteten af cellekulturer. Bioreaktorer opstod i 1950'erne og 1960'erne, og har siden udviklet sig til at levere effektive midler til at producere milliarder af celler i en usædvanlig kort tid 19. Mange typer af bioreaktorer findes, som kunne anvendes til dramatisk øge antallet af H. vitripennis celler produceret på én gang, og processen med at udvikle denne type produktion system vil kræve udvikling af en metode til at behandle celler for at forhindre forskydning tilbagevækst m overflader i bioreaktorer.
Vellykket fortsatte vækst af cellelinier er afgørende for HoCV-01 replikation og en gang nået, kan bruges til at behandle spørgsmålet om, hvor meget virus er nødvendig for kvantificerbare in vitro-replikation og hvor længe skal virus have lov til at forblive inden for kulturer. En klar korrelation mellem mængden af indledende viral belastning modtaget af celler og varighed af tid viruspartikler blev tilladt at inkubere i celler. Jo højere virusmængden modtagne lavere tid krav til celledød, hvilket indikerer hurtig viral replikation. Imidlertid faldt i alle behandlinger celleantal til under tærskelværdien på 25 x 10 4 celler / ml ved omtrent 144 timer efter infektion, hvilket viser en overordnet cellekultur overlevelsesevne tærskel. Resultaterne illustrerer, at store mængder virus kan fremstilles hurtigt, hvis større mængder virus er let tilgængelige for første infektion, eller at støased mængder virus kan produceres over en længere periode med lavere indledende dosis. Variation i forholdet mellem koncentration og tidsfaktorer tillader en vis fleksibilitet i produktionen muligheder for undersøgelser i stor skala med en optimal viral udvinding tid på 72-96 timer efter infektion.
Brug af cellekulturer til virale studier er afhængig af evnen til at detektere målet virus og kvantificere resultaterne af undersøgelsen. En pålidelig metode til dette er at bruge PCR til at kontrollere for tilstedeværelsen af virale RNA-sekvenser inden for eksperimentelle prøver. Analysen af Ct-værdier fra PCR-data i denne undersøgelse ikke giver et klart svar på, hvad den optimale udvinding tidspunktet for virus ville være; Men manglen på en endelig udvinding tid er ikke udtryk for en manglende evne til at replikere HoCV-01 in vitro, men af den følsomme karakter af virale studier. Celletællinger anvender trypanblå behøver låne til et klarere billede af optimal udsugning gange, men er på ingen måde en definitive svar. Celledød data viser at høje virusbelastning føre til stærkt nedsat celle overlevelsesevne efter 72 timer, hvilket indikerer, at viral ekstraktion mellem 48 timer og 72 timer efter infektion kan være ideel til at reducere cellulær fordeling af virale partikler som celler i kulturen begynder at dø eksponentielt. Ekstraktionstider ved lavere initiale virale belastninger er mere tvetydig, men med dramatiske fald i celle overlevelsesevne efter 144 timer, kan det spekuleret på, at optimal udsugning tidspunkt ville være 24-48 timer forud for dette tidspunkt. Bestemmelse af optimale viral udvinding tid er afgørende for virkningsfuld produktion af biopesticider til brug mod H. vitripennis parasitære og denne undersøgelse har taget et vigtigt skridt i retning af fastlæggelse af de tidspunkter.
Mikroskopi er et vigtigt redskab til cellekultur analyse og denne undersøgelse er den første til at bruge konfokalmikroskopi med H. vitripennis celler. Imaging protein vedhæftet fil, stigning eller fald og overflod afcellekerner er det første skridt i retning af mere detaljerede undersøgelser af den intracellulære aktivitet af HoCV-01 in vitro. I denne undersøgelse blev cellekulturer opretholdt med ingen synlige morfologiske forandringer. Efter hver efterfølgende celle passage, blev den normale fibroblast vækst observeret, efterfulgt af dannelsen af et monolag. Celler forblev ensartet i form og størrelse. Men når inficerede kulturer blev afbildet med konfokal mikroskopi blev cellemorfologi fald observeret, især på 72 timer tidspunkt, med både høje og lave initiale virale belastninger. Lille hul-lignende strukturer kan ses på celleoverflader, muligvis på grund af celledød og fordrive af intracellulært materiale. Celler tværs kolbeoverfladen indskrumpede og til sidst begyndte at løsne sig fra overfladen. Konsekvenserne af denne første brug af højere opløsning mikroskopi korrelere til de resultater, der ses i cellen overlevelsesevne analyse og giver anledning til andre mulige anvendelser for øgede virale studier. Avanceret microscopy teknikker kunne udnyttes til sin maksimale kapacitet, hvis udvikling af antistof til HoCV-01 blev gennemført. Antistoffer til virus vil ikke kun tillade visualisering af intercellulære arbejdssteder af de virale partikler, men kan også hjælpe med at bestemme opformeringsrater og endnu mere præcise ekstraktioner tider.
Processen med opskalering produktionsmetoder udviklet i dette studie til at producere en effektiv biologisk bekæmpelse middel til et punkt, hvor store biomasser celler høstes til virus og derefter anvendt på markerne, er mest et spørgsmål om pris. Startomkostninger for at opbygge store systemer er høj, og mange faktorer skal tages i betragtning, såsom: rentabilitet, celle og virus produktivitet, cellekulturmedium omkostninger, dosering, produktion omfang og batch produktionsomkostninger 12. Trods indledende omkostninger, de potentielle pay offs er værd at investeringen. Ved at udnytte cellekulturteknikker, stream rensning spørgsmål ned, er stærkt reduceret bemedføre muligheden for tarmen mikrobe og andre virus fundet i en hele kroppen insekt er voldsomt reduceret, samt facility omkostninger for levende insekt vedligeholdelse og opdræt.
Med cellekultur allerede udnyttes til produktion af proteiner, biopesticider og andre lægemidler, er den økonomiske værdi for dette forskningsområde stigende. For storstilet produktion af biopesticider i landbruget, vil det være en fordel at prøve en lignende undersøgelse til den færdig her, men ved hjælp af en større cellevækst system. Bioreaktorer, og den nye metode 3D matrix celle dyrkningssystemer giver mulighed for større volumen produktion af celler, og i den samme respekt, større mængder af viral produktion 20. Mens de indledende udgifter til at opbygge store systemer er høj, payoff i mængden af produkt i stand til at blive produceret har potentiale til at blive endnu større. Et område af undersøgelsen, der i høj grad ville låne til at fremme transmission studier i store systemer described ovenfor antistof design. Antistof design er blevet brugt mere og mere i virale undersøgelser for sygdomme som hiv og hepatitis C. Selv om det er en tidskrævende og detaljeret proces for HoCV-01, det ville give mulighed for visualisering af viral aktivitet in vitro med konfokal mikroskopi og kan føre til andre områder af undersøgelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cell culture flasks | Sigma Aldrich | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Inverted microscope and camera | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049 | 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Sigma Aldrich | M8937 | 48 wells (TC treated with lid) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma Aldrich | CLS431206 | Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 ml |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Polyethylene glycol hexadecyl ether |
| Phosphate buffer solution | Sigma Aldrich | P5244 | Received as 100 mM diluted to 10 mM with sterile water |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | For electrophoresis |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, for molecular biology, powder |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Reagent grade, crystalline |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Phosphate buffered saline |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Rhodamine red-conjugated phalloidin | Life Technologies | R415 | Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Confocal System | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace’s Insect medium (supplemented, 1x) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ leafhopper medium component |
| L-histidine monohydrate | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 199 (10x) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 1066 (1x) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ leafhopper medium component |
| Hank’s Balanced Salts (1x) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ leafhopper medium component |
| L-Glutamine (100x) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ leafhopper medium component |
| MEM, amino acid mix (50x) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ leafhopper medium component |
| 1 M MgCl solution | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ leafhopper medium component |
| Pen-Strep (w/ glutamine) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ leafhopper medium component |
| Nystatin | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ leafhopper medium component |
| Gentamycin | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ leafhopper medium component |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ leafhopper medium component |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ leafhopper medium component |
References
- Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
- Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X. Molecular analysis of capsid protein of Homalodisca coagulata Virus-1, a new leafhopper-infecting virus from the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata. J. Insect Sci. 6 (28), 1-10 (2006).
- Hunnicutt, L. E., Hunter, W. B., Cave, R. D., Powell, C. A., Mozoruk, J. J. Genome sequence and molecular characterization of Homalodisca coagulata virus-1, a novel virus discovered in the glassy-winged sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae). Virology. 350 (1), 67-78 (2006).
- Hunnicutt, L. E., Mozoruk, J., Hunter, W. B., Crosslin, J. M., Cave, R. D., Powell, C. D. Prevalence and natural host range of Homalodisca coagulata virus-1 (HoCV-1). Virology. 153, 61-67 (2008).
- Jones, W. A., Setamou, M. Biology and Biometry of Sharpshooter Homalodisca coagulata (Homoptera) Cicadellidae) Reared on Cowpea. Ann. Entomol. Soc. Am. 98 (3), 322-328 (2005).
- Turner, W. F., Pollard, H. N. Life histories and behavior of five insect vectors of phony peach disease. US Dep. Agric. Tech. Bull. 1188, 1-32 (1959).
- Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Utilization of primary nutrients by the polyphagous xylophage, Homalodisca coagulata, reared on single host species. Arch. Insect Biochem. Physiol. 32, 65-83 (1996).
- Brodbeck, B. V., Andersen, P. C., Mizell, R. F. Effects of total dietary nitrogen and nitrogen form on the development of xylophagous leafhoppers. Arch. Insect Biochem. Physiol. 42, 37-50 (1999).
- Kamita, S. G., Do, Z. N., Samra, A. I., Halger, J. R., Hammock, B. D. Characterization of Cell Lines Developed from the Glassy-winged Sharpshooter, Homalodisca coagulata (Hemiptera: Cicadellidae). In vitro Cell Dev.-An. 41, 149-153 (2005).
- Hunter, W. B. Medium for development of bee cell cultures (Apis mellifera: Hymenoptera: Apidae). In vitro Cell Dev.-An. 46 (2), 83-86 (2010).
- Identification and whole extraction of Homalodisca coagulata-virus01. (HoCV-01) from Texas glassy-winged sharpshooter populations. Bextine, B., Hunter, W., Marshall, P., Hail, D. CA Pierce’s Disease Symposium, Sacramento, CA, , 9-12 (2009).
- Rhoades, D. J. Economics of baculovirus – insect cell production. Cytotechnology. 20, 291-297 (1996).
- Briske-Anderson, M. J., Finley, J. W., Newman, S. M. The influence of culture time and passage number on the morphological and physiological development of Caco-2 cells. P. Soc. Exp. Biol. Med. 214 (3), 248-257 (1997).
- Chin, L., et al. Deficiency Rescues the Adverse Effects of Telomere Loss and Cooperates with Telomere Dysfunction to Accelerate Carcinogenesis. Cell. 97 (4), 527-538 (1999).
- Counter, C. M., et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. Embo. J. 11, 1921-1929 (1992).
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res. 25, 585-621 (1961).
- Goetz, I. E., Moklebust, R., Warren, C. J. Effects of some antibiotics on the growth of human diploid skin fibroblasts in cell culture. In Vitro. 15 (2), 114-119 (1979).
- Coriell, L. L. Methods of prevention of bacterial, fungal, and other contaminations. Contamination in Tissue Culture. Fogh, J. . , Academic Press. 29-49 (1973).
- Hambor, J. E. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. Bioprocess Tech. Bull. 10 (6), 22-33 (2012).
- Abbot, A., Cyranoski, D.
