Summary
Aquí se presenta un protocolo para propagar células Homalodisca vitripennis y HoCV-1 in vitro. Se retiró el medio de HoCV-1 cultivos positivos y ARN extraído cada 24 h durante 168 horas. Supervivencia celular se cuantificó mediante tinción con azul de tripano. Partículas virales enteras fueron extraídos después de la infección. ARN extraído se cuantificó por QRT-PCR.
Abstract
La chicharrita de alas cristalinas (Homalodisca vitripennis) es un insecto altamente vagile y polífagas encuentra en todo el suroeste de los Estados Unidos. Estos insectos son los vectores predominantes de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), una bacteria xilema limitado que es el agente causal de la enfermedad de Pierce (PD) de la vid. La enfermedad de Pierce es económicamente perjudicial; Por lo tanto, H. vitripennis se han convertido en un objetivo para las estrategias de manejo de patógenos. Un dicistrovirus identificado como Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) se ha asociado con un aumento de la mortalidad en H. poblaciones vitripennis. Debido a que se requiere una célula huésped para la replicación HoCV-01, cultivo celular proporciona un entorno uniforme para la replicación dirigida que es logísticamente y económicamente valiosa para la producción de biopesticida. En este estudio, un sistema para la propagación a gran escala de H. vitripennis células a través de cultivo de tejidos se desarrolló, providing un mecanismo de replicación viral. HoCV-01 se extrajo de insectos de todo el cuerpo y se usa para inocular H. cultivaron vitripennis células en diferentes niveles. El medio de cultivo se eliminó cada 24 h durante 168 h, ARN extraído y analizado con QRT-PCR. Las células se tiñeron con azul de tripano y se contaron para cuantificar la supervivencia celular usando microscopía de luz. Partículas de virus enteros se extrajeron hasta 96 h después de la infección, que fue el punto de tiempo determinado que antes de producirse el colapso total de cultivo celular. Las células también se sometieron a tinción fluorescente y vistos usando microscopía confocal para investigar la actividad viral en la F-actina apego y núcleos integridad. La conclusión de este estudio es que el H. vitripennis células son capaces de ser cultivadas y se utiliza para la producción en masa de HoCV-01 a un nivel adecuado para permitir la producción de un bioplaguicida.
Introduction
La chicharrita de alas cristalinas (Homalodisca vitripennis Germar 1821) ha sido identificado como el vector predominante de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), el agente causal de la enfermedad de la vid (PD) de Pierce en América del Norte 1. Gestión de la población de insectos se ha convertido rápidamente en el foco de la investigación para combatir esta devastadora problema para la industria de la viticultura en California y en todo el sur de Estados Unidos. Una de sentido positivo, el virus de ARN monocatenario perteneciente a la familia Dicistroviridae, Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) ha sido identificada en H. salvaje poblaciones vitripennis y demostrado que aumenta la mortalidad en las poblaciones 2-4, al tiempo que reduce la resistencia de los insectos a los insecticidas.
Desarrollo de métodos para efectivamente trasera infectada H. vitripennis hasta la edad adulta en un entorno de laboratorio han sido difíciles porque
El objetivo general de los siguientes procedimientos es producir una alta concentración de HoCV-01 adecuado para la utilización como agente de control biológico. La replicación viral requiere de una célula viva, que es la razón por cultivar con éxito y optimizar H. vitripennis culturas es vital para el progreso de la producción de los niveles rentables de virus.
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Protocol
1. Cell Culture
NOTA: Las líneas celulares Homalodisca vitripennis establecidos por el laboratorio del Dr. Wayne Hunter en el Servicio de Investigación Agrícola del USDA (Ft. Pierce, FL EE.UU.) se utilizan para iniciar una acción de laboratorio compuesto por etapas de células mixtas incluyendo fibroblastos y monocapas iniciales.
- Lleve a cabo los siguientes procedimientos en un entorno de laboratorio estéril mantenido a una temperatura de 20-24 ° C con 25 frascos de cultivo cm 2.
- Cultivar y mantener culturas en 25 cm 2 frascos de cultivo de tejidos utilizando medio H2G + Saltamontes, un modificado medios abeja WH2 10 (Tabla 1).
- Incubar frascos de cultivo a 24 ° C con ~ 53% de humedad.
- Utilice un microscopio invertido con un aumento total de (TM) de 100X para controlar el crecimiento del cultivo, por ejemplo, comprobar si hay cualquier crecimiento celular anormal, monitorear todos los contaminantes potenciales, y comprobar el progreso de crecimiento a través de la callesuperficie tura.
- Realizar un cambio de medio completo (medio de cultivo ~ 4 ml por matraz) cada 7 - 10 días sin perturbar la superficie de cultivo.
- Pase culturas cuando la superficie de cultivo es de aproximadamente 80% cubierto por un crecimiento celular (confluente) usando 0,25% de tripsina que contiene ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para disociar las células. Añadir ~ 2 - 3 ml de tripsina a cada matraz de cultivo y exponer cultivo (s) a la enzima durante períodos cortos de tiempo (5 - 10 min) para lograr la disociación celular completa.
- Añadir una cantidad igual de medio fresco al matraz de cultivo (s) (~ 2 - 3 ml) para detener la actividad enzimática y transferir toda la solución a un tubo cónico para centrifugación.
- Precipitar las células por centrifugación a 4 ° C durante 6 min a 350 x g.
- Eliminar el sobrenadante sin alterar el sedimento celular y añadir ~ 8 ml de medio fresco a cada tubo. Homogeneizar suavemente las células con una pipeta.
- Culturas Split en una relación 1: 2 de 25 cm 2 frascos (~ 4 ml de soluti celularsobre por matraz) y se deja culturas recién pasado en reposo durante 48 horas para permitir que las células en suspensión se adhieran firmemente a la superficie del matraz.
NOTA: El cultivo de células de 48 pocillos en placas de cultivo de tejido estériles con una superficie de crecimiento de 1 cm 2 también es posible y que se puede mantener en la misma manera que los frascos de cultivo con una reducción en el volumen de medio de cultivo a ~ 250 l.
2. Extracción Virus Total
- Homogeneizar cuerpos enteros de virus H. positivo vitripennis en tampón fosfato, pH ~ 7,2, con 0,02% de trihidrato de dietilditiocarbamato de sodio (DETCA) por agitación durante ~ 10 seg intervalos hasta que no haya más grandes masas de tejido presente. Extracto de virus a través de la centrifugación a 124.500 xg supervelocidad durante 4 horas a 4 ° C o 22.000 xg durante 16 horas a 4 ° C. Si se forma un precipitado en la parte superior, retírelo con un algodón estéril 11.
- Eliminar el sobrenadante.
- Recoger el precipitado ydisolver con 5 ml de 10 mM de tampón de fosfato (sin DETCA), pH ~ 7,2, que contiene 0,4% de ácido Na-desoxicólico y 4% de éter hexadecil polietilen glicol (Brij 52).
- Para mezclar bien el sedimento, eliminar el sedimento desde el lado del tubo y aplastar hasta en solución si es necesario.
- Añadir más tampón fosfato 10 mM en ~ incrementos de 5 ml para ayudar a la pastilla entra en solución si es necesario y se combinan en 2 tubos de 11.
- Centrifugar la solución a 300 xg durante 15 min 11.
- Eliminar el sobrenadante y pasar la solución a través de un filtro de 0,45 micras, y recoger el filtrado en un tubo de gran colección 11.
- Transferencia de filtrado a una membrana de diálisis con un corte de peso molecular (MWCO) de 3,5 kD, usando pequeñas cantidades de tampón fosfato 10 mM (pH 7) que no contiene DETCA si es necesario 11.
- Coloque la membrana de diálisis en un gran vaso lleno de ddH2O a 4 ° C. Cambie el ddH2O cada hora fo 5 - 6 horas, hasta que se forma un precipitado blanco en la membrana 11.
- Recoger el virus purificado desde dentro de la membrana y someter la solución de virus 100% a una serie de dilución de 10 veces mediante la adición de 10 l de solución a 90 l de ddH 2 O. A continuación añadir 10 l de la dilución para otros 90 l de ddH2O hasta llegar a una dilución de 1: 100.000.
- Solución de virus Conservar a -80 ° C.
3. replicación viral
- Se siembran las células en placas de cultivo de 48 pocillos y crecen todas las filas hasta que el crecimiento celular es el 80% de confluencia (aproximadamente 72 horas después de pase si las células están creciendo a una tasa promedio).
- Inocular cada fila de células con el virus diluido en serie una vez que el crecimiento celular alcanza la confluencia, es decir, una fila de una dilución 1:10, una fila de una dilución 1: 100, etc, a excepción de la fila superior. Utilice la fila superior como un control y añadir 10 l de ddH2O a cada pocillo como control de volumen.
- Con el fin de establecer una concentración de células de línea de base de partida para la comparación con los recuentos de células experimentales, disociar y contar el primer pocillo de cada fila antes de la inoculación inicial de cualquier pozos en los cultivos con virus.
- Monitorear placas de cultivo cada 24 horas después de la inoculación viral para cualquier cambio de color en el medio que indica un cambio de pH y de cambios en la morfología celular.
- Image una columna de la placa de ensayo en cada punto de tiempo, utilizando un microscopio invertido a 100X TM.
- Retire todo el medio de la columna que se ha proyectado en cada punto de tiempo de 24 horas y almacenarlo a corto plazo a -20 ° C para la extracción de RNA y cuantificación viral o largo plazo a -80 ° C.
- Disociar las células de los pocillos después de retirar el medio como se describió anteriormente en los pasos 1.6 a 1.9, utilizando sólo ~ 250 l de EDTA 0,25% tripsina y medio fresco para detener la actividad enzimática y ~ 250 l de medio fresco para volver a suspender la pelle celulart.
- Añadir 10 l de 0,4% de tripano mancha azul a cada tubo que contiene las células para realizar recuentos de células después de la disociación celular para cada período de 24 horas durante una semana. Permita que la mancha se asiente por 10 minutos antes de realizar el recuento de células.
- Realizar el recuento de células dentro de 1 h de exposición a manchar o células viables comenzará a la absorción de manchas así como las células no viables.
- Agregar lentamente 10 l de la solución de células teñidas a cada lado de un hemocitómetro estándar utilizando una micropipeta. Deje que la solución que se ha tomado por la acción capilar para evitar burbujas de aire.
- Contar el número de células viables (no teñidas) en ambos lados de la hemocitómetro (el equivalente de 4 cargos de las 16 plazas del hemocitómetro). Lleve a cabo el recuento de células de cada pocillo de la columna que se ha quitado.
- La media de los recuentos de células de cada columna y utilizar la siguiente fórmula para obtener el número total de recuento de células: (número medio de células / 4) x factor de dilución = número de células x 10
4. Extracción del virus a partir de cultivos celulares
- Retire H. tratada vitripennis células de los frascos de cultivo como se ha descrito anteriormente en los pasos 1.6 a 1.8, utilizando sólo ~ 250 l de 0,25% EDTA tripsina y medio nuevo para detener la actividad enzimática.
- Eliminar el sobrenadante.
- Extracto de virus a partir de células de cultivo siguiendo el protocolo descrito anteriormente en los pasos 2.3 a 2.8.
5. extracción de RNA
- Extracto de ARN a partir de muestras de medio recogidos durante cada ensayo virus de una semana usando una extracción tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio diseñado para muestras líquidas por el protocolo del fabricante.
- Tienda extrae muestras a -80 ° C.
6. RT-PCR
- Establecer normas virales para RT-PCR mediante la ejecución de PCR tradicional utilizando elpar de cebadores cebador HoCV RT-PCR 1 (adelante 5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 ', 5'-revertir ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3') con el virus aislado de toda H. cuerpo vitripennis.
- Asunto producto de la PCR a electroforesis en gel durante 60 min a 120 V en un gel de agarosa al 2% que contenía 0,1% de bromuro de etidio.
- Escindir las bandas del gel y se purifica utilizando un kit de extracción de gel según el protocolo del fabricante.
- Piscina todo extirpados y producto de gel purificado y purificar aún más por la precipitación básica etanol. Eluir el producto de precipitación en aproximadamente 30 l de Tris EDTA (TE) para aumentar la concentración total de la muestra.
- Cuantificar el nivel de cDNA en muestras combinadas a través de espectrofotometría usando ajustes de longitud de onda 260/230 para la detección de ácido nucleico.
- Lleve a cabo una serie de diez veces diluciones seriadas de la muestra purificada que van desde 57 ng / l a 57 ag / l (10 -18). Realizar la dilución en serie similar a la descrita in 2.8 con los ajustes realizados para la diferencia en los requisitos de concentración.
- Determinar límites de detección de la serie de dilución mediante la realización de QRT-PCR utilizando un kit de QRT-PCR con una cuantificación fiable de las transcripciones de baja abundancia.
NOTA: Las concentraciones virales inferiores a 5 x 10 -3 copias no son detectables. - Extracto de ARN de las muestras experimentales como se describe anteriormente en el paso 5.1 y cuantificar mediante espectrofotometría.
- Normalizar todas las muestras extraídas a 5 ng / l usando agua libre de nucleasa.
- Realizar qRT-PCR en todas las muestras, en los duplicados, como 25 reacciones mu l usando un kit de qRT-PCR de un solo paso con la capacidad de detectar bajo número de copias de la siguiente manera: 50 ° C para mantener 10 min; 95 ° C suspenso durante 5 min; 30 ciclos de 95 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 30 s; fundir 50 a 99 ° C durante 5 segundos en cada paso.
- Hacer la mezcla maestra para que cada mezcla de reacción contiene 12,5 l de masters de 1xmezcla r, 1,0 l (0,3 M) de cebador directo, 1,0 l (0,3 M) de cebador inverso, 0,25 l de la transcriptasa inversa y cantidades variables de plantilla en base a los valores de normalización.
- Llevar el volumen total de reacción de 25 l con agua libre de RNasa.
- Incluir cinco concentraciones estándar en cada PCR se ejecutan con los siguientes números de copias: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4 y 5 x 10 -2 copias. Establecer el umbral para cada ejecución hasta justo debajo de una fluorescencia de 10x -2,5 para reducir el ruido durante la adquisición temprana en el comienzo de cada ejecución.
7. Microscopía Confocal
- Se cultivan las células Homalodisca vitripennis en unas doce placas que contiene así cubreobjetos de vidrio que miden 18 mm de diámetro en cada pocillo.
- Inocular una columna en la placa de cada 24 h durante un período de cuatro días, una vez se logra una monocapa. Asegúrese de que cada cCOLUMNA contiene también un control, una dilución baja viral (1:10) bien y una dilución viral alta (1: 100.000) también. Utilice soluciones de virus obtenidos en la etapa 2.8.
- Quite todos los medios de comunicación en el quinto día y lavar las células dos veces con 1x PBS (pH 7.4).
- Fijar las células con paraformaldehído al 4% frío a 4 ° C durante 30 min.
- Añadir 500 l de 1x tampón fosfato salino (PBS) a las células y se lavan durante 10 min a TA en un agitador a baja velocidad. Lavar las células tres veces.
- Añadir 500 l de 0,1% de Triton X-100 a las células para permeabilizar ellos. Deje reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Lavar las células de nuevo como se describió previamente en el paso 7.5.
- Añadir 500 l de una solución al 5% de albúmina de suero bovino (BSA) para bloquear las células a TA. Deje reposar durante 2 horas y luego retire.
- Diluir de stock rodamina faloidina-rojo conjugado (RCP) 1: 250 en 1X PBS que contenía 5% de BSA y añadir 250 l de la dilución a cada pocillo para manchas para F-actina.
- Placa de cubierta de aluminio faceite para evitar que el tinte de blanqueo e incubar las células a 4 ° CO / N.
- Retire la RCP después de 12 h de incubación y reemplazarlo con 250 l de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (250 mg / ml) diluido en PBS 1x conteniendo 5% de BSA, para teñir los núcleos de las células .
- Se incuban las células que contienen DAPI a TA durante 1 h.
- Lavar las células tres veces con 1x PBS como se describe anteriormente en el paso 7.5.
- Retire con cuidado los cubreobjetos de los pozos y montar a portaobjetos de microscopio utilizando un medio de montaje con un reactivo anti-fade.
- Deje que los portaobjetos se sequen en lightproof cajas hasta que se observa bajo el microscopio confocal. Ver prepara diapositivas tan pronto como sea posible ya que los tintes pueden desvanecerse rápidamente.
- Image células teñidas utilizando un sistema confocal equipado con un microscopio que contiene una lente de 63X (aceite) plan de apochromate.
- Establezca las longitudes de onda de láser a 543 ± 10 nm de excitación y 575 ± 10 nm de emisión para Rhoadmine phalloidin-rojo conjucated, Y 369 ± 10 nm de excitación y 450 ± 30 nm de emisión para DAPI.
- Utilice ganancia idéntica y los ajustes establecidos fuera de para el detector para obtener todas las imágenes.
- Procesar imágenes utilizando el software adecuado para el procesamiento de imágenes y la clasificación e importar imágenes deseado en un software de gestión de imágenes.
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Representative Results
La unión celular y el crecimiento se observó dentro de las 48 horas de paso en los dos frascos de cultivo de pequeños y grandes, a partir de cultivos primarios y pasajes continuos. Crecimiento y desarrollo de fibroblastos también se observó dentro de este marco de tiempo. Cuando frascos recién sembrados fueron perturbados antes de 48 horas, se produjo una disminución visible en la unión de las células, lo que lleva a las culturas de crecimiento más lento ya veces no sujeción o de crecimiento en absoluto. Las células fueron aproximadamente 80% de confluencia dentro de la semana pasada y formaron una monocapa en 10-14 días (Figura 1). Los cultivos primarios que fueron cultivadas en el inicio de este estudio, han sobrevivido más de 30 pases de células sin ningún deterioro morfológico o disminución general de la viabilidad celular.
La unión celular y el crecimiento se observó dentro de las 48 horas de paso de los matraces a las placas. Formación de monocapa se logró en un período de tiempo más corto, aproximadamente 5-6 días, ya que es una superficie de crecimiento más pequeño. Los cultivos infectados fotografiaron unt 100X con microscopía de luz mostró signos de disminución de la integridad de la forma celular. A las 48 horas después de la infección, lo que parecen ser grandes agujeros estaban presentes en la superficie de las células. Al otro lado de frascos de cultivo, las células encogidos y separadas de la superficie de cultivo de aproximadamente 72 a 96 horas después de haber sido infectado con no diluida HoCV-01 (Figura 2).
La media de los recuentos de células vivas para el control y se calcularon y se representan para representar diferencias en la abundancia de células vivas entre las cargas virales a través del tiempo (Figura 3) muestras experimentales. Un aumento constante de células vivas para el grupo de control está presente, lo que indica las células sanas. Comparativamente, todos los grupos de tratamiento tuvieron un marcado descenso en el número de células vivas presentes en el tiempo. Los grupos de tratamiento virales más altas indican un mucho más marcado deterioro de la salud de cultivo con una caída importante en las células vivas entre 48-72 horas, mientras que los grupos virales más bajas disminuyen lentamente hasta dejar a alrededor de 144 horas. Una de dos vías ANOVA wiSe utilizó el análisis º de Bonferroni post-hoc para probar las diferencias en las tasas de interrupción de cultivo celular por HoCV-01 basado en los recuentos de células vivas en cada grupo de tratamiento en comparación con cada punto de tiempo en el estudio, así como entre los grupos. El análisis de dos vías de la varianza tuvo un efecto principal significativo del factor tiempo, F (7, 432) = 82,5, p <0,0001, lo que sugiere que la longitud de las culturas tiempo se expusieron a un tratamiento afectados cultura longevidad. El efecto del tipo de cultivos recibieron tratamiento fue significativa, así, F (5, 432) = 170,6, p <0,0001, lo que indica que la cantidad de la carga viral de una cultura recibe inicialmente afecta a la supervivencia de cultivo. Un efecto significativo en la interacción entre el factor tiempo y el factor de tratamiento también está presente, F (35, 432) = 17,63, p <0,0001, subrayando que la mayor carga viral recibió la cantidad de tiempo más corto necesario para reducir la cultura de fitness y a la inversa la parte inferior de la carga viral, elperíodo más largo de tiempo requerido para el mismo efecto. Pruebas post-hoc de Bonferroni ilustran una diferencia significativa entre los grupos de tratamiento y control, lo que indica una respuesta a la dosis notable.
Probabilidad de supervivencia de las células inoculadas con tratamientos virales más altas fue menor según lo probado por las curvas de Kaplan-Meier (Figura 4), en correlación con las conclusiones extraídas de los análisis del recuento medio de células en vivo. Hubo una tasa de supervivencia del 100% para el control o células no infectadas. Las células expuestas a los tratamientos virales altas tenido una marcada disminución en la probabilidad de supervivencia en el tiempo, mientras que los tratamientos virales más bajas tienen una mayor probabilidad de supervivencia hasta que el 144 hr, a continuación, una disminución de la probabilidad de supervivencia está presente. Riesgos proporcionales de Cox análisis del modelo no fue significativa, el tratamiento (IC del 95% [0,76, 1,02]) coeficiente = 0,8812, p> 0,05. Si bien no es significativa, los datos sugieren que las células expuestas al virus son 88% más propensos a exhibir tasas de supervivencia más bajas a través del tiempo.
Para cada serie de QRT-PCR, los estándares más altos virales intensificaron antes que normas virales más bajas y las muestras experimentales. De cada ejecución, se replican los valores de Ct se analizaron mediante un ANOVA de dos vías para evaluar las diferencias en la abundancia de HoCV-01 ARN presente en las muestras experimentales y comparar los valores para varios valores de control. El análisis de dos vías de la varianza no mostró ningún efecto principal significativo del factor tiempo, F (7, 289) = 0.38, p> 0.05, o en la interacción entre los grupos de tiempo y el tratamiento, F (63, 289) = 0,14, p > 0,05. Un efecto principal significativo entre los grupos de tratamiento, F (9, 289) = 135,7, p <0,0001, lo que indica que la cantidad de virus introducido inicialmente para el cultivo celular afecta la cantidad de ARN viral detectada se observó. Pruebas post-hoc de Bonferroni se realizaron y muestran interacciones significativas entre los grupos de tratamiento y medidas de control, pero no hay interacciones significativas entre el tratamiento grupos solo, indica que no hay respuesta a la dosis medibles.
Las diferencias en la morfología de las células de saludables y HoCV-01 infectadas H. vitripennis células a las 24 y 72 horas se observaron en la fluorescencia. La disminución de número de núcleos presentes, así como la apariencia deforme de F-actina en las células expuestas a HoCV-01 en comparación con los controles indican que el virus tiene un impacto importante en la salud de cultivo. Las células expuestas a la mayor carga viral uno y diez mostraron una mayor angustia que las células expuestas al tratamiento viral más baja. Las células de control aparecerá más abundante y tener morfología normal entre los dos puntos de tiempo (Figura 5).
| Medio de insectos de Grace (complementado, 1x) | 210 ml |
| 0,06 M solución de monohidrato de L-histidina (pH = 6,5) | 290 ml |
| Medio 199 (10x) | 10 ml |
| Media 1066 (1x) | 17 ml |
| Sales equilibradas de Hank (1x) | 33 ml |
| L-glutamina (100x) | 1,5 ml |
| MEM, mezcla de aminoácidos (50x) | 1,5 ml |
| Solución 1 M de MgCl | 6 ml |
| Pen-Strep (w / glutamina) | 2,5 ml / 500 ml |
| Nistatina | 1,0 ml / 500 ml |
| Gentamicina | 1,5 ml / 500 ml |
| Dextrosa | 1,8 g |
| Suero bovino fetal | 10% de volumen final |
Tabla 1. H2G + componentes del medio saltahojas.
Figura 1. Imágenes de H. vitripennis cell crecimiento in vitro capturado a 100X TM. Las células (A) dos días (48 h) post-pasaje exhibiendo unión y el desarrollo de fibroblastos. (BE) Células cuatro, seis, ocho y diez días después de la de paso seguir creciendo través de la superficie de cultivo. Formación (F) se producen Monocapa ~ 10 14 días. Las barras de escala:. 100 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Infected H. vitripennis células fotografiadas a 100X TM para capturar cambios morfológicos. (A) de crecimiento de fibroblastos antes de la inoculación. (B) Las células 24 horas después de la infección. (C) Las células después de la infección 48 h. (D) las células después de la infección 96 h tienensobre todo separado de la superficie de cultivo y medio se ha convertido nublado. Las barras de escala:. 100 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. gráfico de barras que muestra los recuentos de células vivas medias para muestras experimentales. La media de los recuentos de células vivas se calcularon para las muestras experimentales por la carga viral recibidos para cada día durante el periodo experimental y se muestra aquí con barras de desviación estándar. La media de los recuentos de células muestran una disminución significativa en células vivas ~ 72 horas después de la infección con cargas virales altas y una disminución significativa en el recuento de células vivas en ~ 144 horas después de la infección con cargas virales más bajas. Por favorhaga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. de Kaplan-Meier análisis de supervivencia de cinco diferentes HoCV-01 tratamientos en comparación con un control no infectado en H. cultivos celulares vitripennis. cultivos de control mantienen una tasa de supervivencia del 100% en comparación con los cinco grupos de tratamiento. La probabilidad de supervivencia más baja se observó en el grupo de tratamiento con altas y todos los grupos de tratamiento dirigimos hacia cero probabilidad de supervivencia en 168 horas cuando n = 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figu. re 5. Confocal imágenes del control y las células infectadas H.vitripennis Homalodisca vitripennis células fueron infectadas con serial diluida HoCV-01 en 1:10 y 1: 100.000 concentraciones en intervalos de 24 horas. Las células fueron tratadas con rodamina faloidina y las manchas DAPI para visualizar la actina F y los núcleos dentro de las culturas. Confocal imágenes fueron capturadas a 63X y muestran una ruptura en la morfología de las células a las 72 horas en ambos diluciones virales bajas y altas. Las barras de escala:. 1 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El aumento de las preocupaciones en cuanto a la afluencia de especies agrícolas invasivas han llevado a una mayor demanda de nuevas metodologías para la defensa frente a plagas y patógenos emergentes. Un enfoque de la prevención y manejo de la enfermedad consiste en la gestión de vectores de patógenos y era el objetivo principal de este estudio. Economía desempeñan un papel vital en la decisión de producir este tipo de bioplaguicida para manejar vectores de patógenos en la agricultura debido a la aplicación práctica tiene que ser grandes cantidades en grandes áreas, pero a un bajo costo 12. La práctica de utilizar el cultivo de células para la investigación y el desarrollo se ha convertido cada vez más común y, como tal, los impactos de este estudio son significativos. Identificar estrategias económicamente viables manejo integrado de plagas (MIP) es clave para continuar la producción agrícola en todo el mundo con éxito y los resultados de este estudio contribuyen al avance en la mejora de las estrategias de manejo integrado de plagas y la reducción de la incidencia de la EP de la vid.
H. Primaria cultivos celulares vitripennis se propagaron y se mantuvieron durante más de un año sin ningún deterioro morfológico visible. Números de pasaje puede afectar drásticamente los resultados de los estudios in vitro en células de mamíferos, cambiando el metabolismo celular y las características de crecimiento 13. Como las células se replican in vivo e in vitro, los telómeros se acortan con cada ronda de replicación celular y, finalmente, alcanzan un límite crítico en el que los telómeros se vuelven demasiado cortos e inducen la senescencia celular 14. Cuando se produce severa acortamiento de los telómeros, inestabilidad genética y, finalmente, crisis, o muerte celular masiva se produce 15. Debido a este fenómeno, culturas rara vez sobreviven más allá de 50 subcultivos o un año, considerado el límite de Hayflick, en base a los siguientes criterios: la retención de cromatina sexual, la diferenciación histotypical, inadaptación a suspender la cultura, las características no malignas en vivo, límite finito de cultivo, Morfología celular similar a tejido primario, el aumento de la producción de ácido en comparación con líneas celulares, la retención de la sustancia receptor de Coxsackie A9 y la facilidad con la que se podrían desarrollar cepas 16. Las complicaciones potenciales de números de pases no se observaron durante la duración de este estudio lo que indica que este método de propagación de la línea celular es capaz de la producción continua durante largos períodos de tiempo. Debido a la utilización del cultivo de células sobre la cría de insectos vivos o otros métodos de producción costosos y complicados está convirtiendo rápidamente en un lugar común en muchas disciplinas, la longevidad de este tipo de línea celular tiene muchas aplicaciones prácticas. Si se mantienen adecuadamente, una única línea celular primaria podría ser utilizado para múltiples rondas de producción de virus.
Los dos factores más importantes en el éxito de mantenimiento a largo plazo de estas células fueron el tiempo de perturbación para los cultivos recién sembrados y preparación del medio adecuado. Culturas que se mantuvieron intactas durante los primeros 48 hr después del paso mostró un marcado aumento en el crecimiento matraz de cruz en comparación con aquellos que se han movido dentro de esa ventana inicial. Cuando se deja sin tocar, la rápida replicación de las células monocapas logró en tan sólo diez días después de la aprobación en frascos de cultivo. Preparación Medio era tan vital durante el estudio como tiempo de perturbación en lo que se refiere a la salud la cultura general. Incluso con los antibióticos presentes en el medio, la contaminación bacteriana seguía siendo un factor importante a considerar cuando se prepara medio. Al permitir alícuotas de medio de permanecer a temperatura ambiente durante varios días antes de su uso en cultivos, la probabilidad de una serie devastadora de la cultura colapsa debido a la contaminación bacteriana se redujo a un factor casi inexistente. Antibióticos, tales como gentamicina y estreptomicina, se utilizan comúnmente en medio de cultivo celular para combatir bacterias que se encuentran dentro de las células y cualquier contaminación exterior. Ambos antibióticos se han relacionado con una depresión del crecimiento celular en cultivos de mamíferos unad a una disminución en el uso de técnicas asépticas y la preocupación por el aumento de la probabilidad de desarrollar cepas resistentes a los antibióticos de bacterias 17,18. Los antibióticos no se deben utilizar en exceso; sin embargo, su uso es necesario para la prevención de los problemas de contaminación de cultivos celulares.
Las implicaciones de estos factores son tales que el escalamiento de producción de las células es una opción viable para la producción en masa rápida de materiales de bioplaguicida con pasos pequeños para asegurar la calidad de los cultivos celulares. Biorreactores surgido en los años 1950 y 1960, y desde entonces han evolucionado para proporcionar medios eficientes de producir miles de millones de células en una excepcionalmente corto período de tiempo 19. Existen muchos tipos de biorreactores que podrían utilizarse para aumentar drásticamente el número de H. vitripennis células producen a la vez y el proceso de desarrollo de este tipo de sistema de producción requeriría el desarrollo de un método para el tratamiento de las células para prevenir la esquila frocrecimiento m superficies en biorreactores.
Crecimiento continuo éxito de las líneas celulares es crucial para HoCV-01 de replicación y una vez logrado, se puede utilizar para tratar el tema de la cantidad de virus que se necesita para cuantificar la replicación in vitro y por cuánto tiempo se debe permitir que el virus de permanecer dentro de las culturas. Una clara correlación se encontró entre la cantidad de la carga viral inicial recibida por las células y la duración de las partículas de virus en tiempo se les permitió incubar dentro de las células. Cuanto mayor sea la carga viral recibida, menor será el tiempo requerido para la muerte celular, lo que indica la replicación viral rápida. Sin embargo, en todos los tratamientos el número de células disminuyeron por debajo del valor umbral de 25 x 10 4 células / ml a aproximadamente 144 horas después de la infección, lo que demuestra un umbral de supervivencia de cultivo celular global. Los resultados ilustran que las grandes cantidades de virus se pueden producir rápidamente si están fácilmente disponibles para la infección inicial grandes cantidades de virus, o que increAsed cantidades de virus se pueden producir durante un período de tiempo más largo con la dosis inicial más baja. La variabilidad en la relación entre los factores de concentración y tiempo permite una cierta flexibilidad en las opciones de producción para los estudios de mayor escala con un tiempo de extracción viral óptima de 72 a 96 horas después de la infección.
El uso de cultivos celulares para los estudios virales depende de la capacidad para detectar el virus objetivo y cuantificar los resultados del estudio. Un método fiable para esto es utilizar PCR para comprobar la presencia de secuencias de ARN viral dentro de las muestras experimentales. El análisis de los valores de Ct a partir de datos de PCR en este estudio no da una respuesta clara a lo que sería el tiempo de extracción óptima de los virus; Sin embargo, la falta de un tiempo de extracción definitiva no es indicativo de una incapacidad para replicar HoCV-01 in vitro, sino a la naturaleza sensible de los estudios virales. Los recuentos de células usando azul tripán se prestan a una visión más clara de los tiempos óptimos de extracción, pero de ninguna manera son una Definitive respuesta. La muerte celular de datos ilustra que las cargas virales altas conducen a la disminución de supervivencia altamente celular después de 72 horas, lo que indica que la extracción viral entre 48 horas y 72 horas después de la infección puede ser ideal para reducir la degradación celular de partículas virales como las células en el cultivo comienzan a morir exponencialmente. Tiempos de extracción con cargas virales iniciales más bajas son más ambiguos, pero con descensos dramáticos en la supervivencia celular después de 144 horas, se puede especular que el tiempo óptimo de extracción sería 24 - 48 horas antes de ese punto del tiempo. Determinación del momento óptimo de extracción viral es vital para la producción eficaz de bioplaguicidas para el uso contra H. vitripennis infestaciones y este estudio ha dado un paso importante hacia la determinación de aquellos tiempos.
La microscopía es una herramienta clave para el análisis de cultivo de células y este estudio es el primero en utilizar la microscopía confocal con H. vitripennis células. Aumento de unión a proteínas Imaging o el declive y la abundancia denúcleos de células es el primer paso hacia los estudios más detallados en la actividad intracelular de HoCV-01 in vitro. A lo largo de este estudio, los cultivos celulares se mantuvieron sin deterioros morfológicas visibles. Después de cada paso subsiguiente de células, se observó un crecimiento normal de fibroblastos, seguido por la formación de una monocapa. Las células se mantuvieron uniformes en forma y tamaño. Sin embargo, cuando los cultivos infectados fueron imágenes con microscopía confocal, se observaron disminuciones de la morfología celular, especialmente en el punto de tiempo de 72 horas, con las dos cargas virales iniciales altas y bajas. Pequeñas estructuras agujero como se podían ver en las superficies celulares, posiblemente debido a la muerte celular y la expulsión de material intracelular. Células en toda la superficie del matraz se marchitaron y, finalmente, comenzaron a desprenderse de la superficie. Las implicaciones de esta primera utilización de la microscopía de alta resolución se correlacionan con los resultados observados en el análisis de supervivencia celular y da lugar a otros usos posibles para el aumento de los estudios virales. Advanced mitécnicas de microscopia se podrían utilizar a sus capacidades máximas si se llevó a cabo el desarrollo de anticuerpos para HoCV-01. Los anticuerpos para el virus no sólo podrían permitir la visualización de funcionamiento intercelulares de las partículas virales, pero también podría ayudar a determinar las tasas de proliferación e incluso extracciones más precisos momentos.
El proceso de la ampliación de los métodos de producción desarrollados en este estudio para producir un agente de control biológico efectivo a un punto donde gran biomasa de células se recogen para el virus y luego se aplican a los campos es principalmente una cuestión de costo. Los costos iniciales de construcción de sistemas de gran escala es alta y muchos factores tienen que ser considerados, tales como: la rentabilidad, la productividad celular y virus, los costes medios de cultivo de células, dosis de aplicación, la escala de producción y los costos de producción por lotes 12. A pesar de coste inicial, los posibles compromisos de pago valen la inversión. Mediante la utilización de técnicas de cultivo celular, por cuestiones de purificación de la corriente se reducen en gran medida seacausa la posibilidad de microbio intestino y otros virus que se encuentran dentro de todo un insecto cuerpo se reduce enormemente, así como los costes de las instalaciones para el mantenimiento y la cría de insectos vivos.
Con el cultivo de células que ya se está utilizando para la producción de proteínas, bioplaguicidas y otros productos farmacéuticos, el valor económico de esta área de investigación es cada vez mayor. Para la producción a gran escala de bioplaguicidas en la agricultura, sería beneficioso para tratar un estudio similar a la completado aquí, pero utilizando un sistema de crecimiento de celda más grande. Biorreactores y la nueva metodología de los sistemas de cultivo de células de la matriz 3D permiten una mayor producción de volumen de las células y, en el mismo sentido, un mayor volumen de producción viral 20. Si bien el costo inicial de la construcción de sistemas de gran escala es alta, la recompensa en la cantidad de producto capaz de ser producido tiene el potencial de ser aún mayor. Un área de estudio que se prestaría en gran medida a la promoción de los estudios de transmisión en describ sistemas a gran escalaed anterior es el diseño de anticuerpos. Diseño de anticuerpos se ha utilizado cada vez más en los estudios virales para enfermedades como el VIH y la hepatitis C. Si bien es un proceso largo y detallado, para HoCV-01, que permitiría la visualización de la actividad viral in vitro con microscopía confocal y podría conducir a otra áreas de investigación.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cell culture flasks | Sigma Aldrich | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Inverted microscope and camera | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049 | 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Sigma Aldrich | M8937 | 48 wells (TC treated with lid) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma Aldrich | CLS431206 | Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 ml |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Polyethylene glycol hexadecyl ether |
| Phosphate buffer solution | Sigma Aldrich | P5244 | Received as 100 mM diluted to 10 mM with sterile water |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | For electrophoresis |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, for molecular biology, powder |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Reagent grade, crystalline |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Phosphate buffered saline |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Rhodamine red-conjugated phalloidin | Life Technologies | R415 | Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Confocal System | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace’s Insect medium (supplemented, 1x) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ leafhopper medium component |
| L-histidine monohydrate | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 199 (10x) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 1066 (1x) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ leafhopper medium component |
| Hank’s Balanced Salts (1x) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ leafhopper medium component |
| L-Glutamine (100x) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ leafhopper medium component |
| MEM, amino acid mix (50x) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ leafhopper medium component |
| 1 M MgCl solution | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ leafhopper medium component |
| Pen-Strep (w/ glutamine) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ leafhopper medium component |
| Nystatin | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ leafhopper medium component |
| Gentamycin | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ leafhopper medium component |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ leafhopper medium component |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ leafhopper medium component |
References
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