Aquí se presenta un protocolo para propagar células Homalodisca vitripennis y HoCV-1 in vitro. Se retiró el medio de HoCV-1 cultivos positivos y ARN extraído cada 24 h durante 168 horas. Supervivencia celular se cuantificó mediante tinción con azul de tripano. Partículas virales enteras fueron extraídos después de la infección. ARN extraído se cuantificó por QRT-PCR.
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Resumen
Resumen
La chicharrita de alas cristalinas (Homalodisca vitripennis) es un insecto altamente vagile y polífagas encuentra en todo el suroeste de los Estados Unidos. Estos insectos son los vectores predominantes de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), una bacteria xilema limitado que es el agente causal de la enfermedad de Pierce (PD) de la vid. La enfermedad de Pierce es económicamente perjudicial; Por lo tanto, H. vitripennis se han convertido en un objetivo para las estrategias de manejo de patógenos. Un dicistrovirus identificado como Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) se ha asociado con un aumento de la mortalidad en H. poblaciones vitripennis. Debido a que se requiere una célula huésped para la replicación HoCV-01, cultivo celular proporciona un entorno uniforme para la replicación dirigida que es logísticamente y económicamente valiosa para la producción de biopesticida. En este estudio, un sistema para la propagación a gran escala de H. vitripennis células a través de cultivo de tejidos se desarrolló, providing un mecanismo de replicación viral. HoCV-01 se extrajo de insectos de todo el cuerpo y se usa para inocular H. cultivaron vitripennis células en diferentes niveles. El medio de cultivo se eliminó cada 24 h durante 168 h, ARN extraído y analizado con QRT-PCR. Las células se tiñeron con azul de tripano y se contaron para cuantificar la supervivencia celular usando microscopía de luz. Partículas de virus enteros se extrajeron hasta 96 h después de la infección, que fue el punto de tiempo determinado que antes de producirse el colapso total de cultivo celular. Las células también se sometieron a tinción fluorescente y vistos usando microscopía confocal para investigar la actividad viral en la F-actina apego y núcleos integridad. La conclusión de este estudio es que el H. vitripennis células son capaces de ser cultivadas y se utiliza para la producción en masa de HoCV-01 a un nivel adecuado para permitir la producción de un bioplaguicida.
Introducción
La chicharrita de alas cristalinas (Homalodisca vitripennis Germar 1821) ha sido identificado como el vector predominante de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), el agente causal de la enfermedad de la vid (PD) de Pierce en América del Norte 1. Gestión de la población de insectos se ha convertido rápidamente en el foco de la investigación para combatir esta devastadora problema para la industria de la viticultura en California y en todo el sur de Estados Unidos. Una de sentido positivo, el virus de ARN monocatenario perteneciente a la familia Dicistroviridae, Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) ha sido identificada en H.<....
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Protocolo
1. Cell Culture
NOTA: Las líneas celulares Homalodisca vitripennis establecidos por el laboratorio del Dr. Wayne Hunter en el Servicio de Investigación Agrícola del USDA (Ft. Pierce, FL EE.UU.) se utilizan para iniciar una acción de laboratorio compuesto por etapas de células mixtas incluyendo fibroblastos y monocapas iniciales.
- Lleve a cabo los siguientes procedimientos en un entorno de laboratorio estéril mantenido a una temperatura de 20-24 ° C con 25 frascos de cultivo cm 2.
- Cultivar y mantener culturas en 25 cm 2 frascos de cultivo de tejidos utilizando medio H2G + Saltamontes, un m....
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Resultados
La unión celular y el crecimiento se observó dentro de las 48 horas de paso en los dos frascos de cultivo de pequeños y grandes, a partir de cultivos primarios y pasajes continuos. Crecimiento y desarrollo de fibroblastos también se observó dentro de este marco de tiempo. Cuando frascos recién sembrados fueron perturbados antes de 48 horas, se produjo una disminución visible en la unión de las células, lo que lleva a las culturas de crecimiento más lento ya veces no sujeción o de crecimiento en absoluto. Las células fue.......
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Discusión
El aumento de las preocupaciones en cuanto a la afluencia de especies agrícolas invasivas han llevado a una mayor demanda de nuevas metodologías para la defensa frente a plagas y patógenos emergentes. Un enfoque de la prevención y manejo de la enfermedad consiste en la gestión de vectores de patógenos y era el objetivo principal de este estudio. Economía desempeñan un papel vital en la decisión de producir este tipo de bioplaguicida para manejar vectores de patógenos en la agricultura debido a la aplicación práctica tie.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer al Programa de Investigación y Educación sobre la Enfermedad de Texas Pierce y al USDA-APHIS por su apoyo financiero para este proyecto. También nos gustaría agradecer a Hema Kothari del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en Tyler por su ayuda con la microscopía confocal.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Matraces de cultivo celular Corning | Sigma Aldrich | CLS430168 | Superficie 25 cm2, cuello inclinado, tapón (junta de tapón) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Microscopio invertido y cámara | |
| Trypsin-EDTA solución | Sigma Aldrich | T4049 | 0,25%, filtrado estéril, BioReactivo, apto para cultivo celular, 2,5 g de tripsina porcina y 0,2 g de EDTA y toro; 4Na por litro de Hanks′ Solución salina equilibrada con rojo fenol |
| Greiner CELLSTAR placas de cultivo multipocillos | Sigma Aldrich | M8937 | 48 pocillos (TC tratado con tapa) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | dietilditiocarbamato de sodio trihidrato |
| Sistema de filtro de vacío con tapa de botella Corning | Sigma Aldrich | CLS431206 | Membrana de acetato de celulosa, tamaño de poro 0,45 μ m, área de membrana 54,5 cm2, capacidad de filtro 500 ml |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Éter de hexadecil de polietilenglicol |
| Solución tampón de fosfato | Sigma Aldrich | P5244 | Recibido como 100 mM diluido a 10 mM con agua estéril |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarosa | Sigma Aldrich | A5304 | Para electroforesis |
| Bromuro de etidio | Sigma Aldrich | E7637 | BioReactivo, para biología molecular, en polvo |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR | kit Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldehído | Sigma Aldrich | P6148 | Grado reactivo, cristalino |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Fosfato solución salina tamponada |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Faloidina conjugada roja con rodamina | Life Technologies | R415 | La faloidina de rodamina es una sonda de F-actina de alta afinidad conjugada con el colorante fluorescente rojo-naranja, tetrametilrodamina |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Reactivo antidecoloración | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Sistema Confocal | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace' s Medio para insectos (suplementado, 1x) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ componente medio de saltahojas |
| L-histidina monohidrato | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ componente medio de saltahojas |
| Medio 199 (10x) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ componente medio de saltahojas |
| Medio 1066 (1x) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ componente |
| medio de saltahojasHank' s Sales equilibradas (1x) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ componente medio del saltahojas |
| L-glutamina (100x) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ componente medio del saltahojas |
| MEM, mezcla de aminoácidos (50x) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ componente medio del saltahojas |
| 1 M MgCl solución | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ componente del medio del saltahojas |
| Pen-Strep (con glutamina) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ saltahojas componente medio |
| Nistatina | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ saltahojas componente medio |
| Gentamicina | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ saltahojas componente medio |
| Dextrosa | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ saltahojas componente medio |
| Suero fetal bovino | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ componente medio de la tolva |
Referencias
- Takiya, D. M., McKamey, S. H., Cavichioli, R. R. Validity of Homalodisca and of H. vitripennis as the Name for Glassy-winged Sharpshooter (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99 (4), 648-655 (2006).
- Hunter, W. B., Katsar, C. S., Chaparro, J. X.
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Reimpresiones y permisos
