Summary
Aqui apresentamos um protocolo para propagar células Homalodisca vitripennis e HoCV-1 in vitro. Médio foi removido do HoCV-1 culturas positivas e RNA extraído a cada 24 horas para 168 horas. A capacidade de sobrevivência das células foi quantificada por coloração com azul de tripano. Partículas de vírus inteiros foram extraídos após a infecção. RNA extraído foi quantificada por qRT-PCR.
Abstract
O atirador vítreo-de-asa (Homalodisca vitripennis) é um inseto altamente vágil e polífagas encontrados em todo o sudoeste dos Estados Unidos. Esses insetos são os vetores predominantes de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), uma bactéria restrita ao xilema, que é o agente causal da doença de Pierce (PD) de videira. Doença de Pierce é economicamente prejudicial; assim, H. vitripennis tornaram-se um alvo para estratégias de gestão patógeno. Um dicistrovirus identificado como Homalodisca coagulata vírus-01 (HoCV-01) tem sido associado com um aumento da mortalidade em H. populações vitripennis. Por causa de uma célula hospedeira é necessária para a replicação HoCV-01, a cultura de células fornece um ambiente uniforme para a replicação que é orientada logisticamente e economicamente valiosa para a produção de biopesticida. Neste estudo, um sistema para a propagação em larga escala de H. vitripennis células através de cultura de tecidos foi desenvolvido, providing um mecanismo de replicação viral. HoCV-01 foi extraído a partir de insectos de corpo inteiro e usada para inocular H. cultivadas vitripennis células em níveis variados. O meio de cultura foi removido a cada 24 h durante 168 horas, o RNA extraído e analisado com qRT-PCR. As células foram coradas com azul de tripan e contadas para quantificar a capacidade de sobrevivência de células por microscopia de luz. Partículas de vírus inteiros foram extraídos até 96 horas após a infecção, o que foi o ponto de tempo determinado antes de ser ocorreu colapso total de cultura de células. As células também foram submetidos a coloração fluorescente e visualizadas por microscopia confocal para investigar a atividade viral na F-actina apego e núcleos integridade. A conclusão deste estudo é que H. vitripennis células são capazes de serem cultivadas e utilizadas para a produção em massa de HoCV-01 a um nível apropriado para permitir a produção de um biopesticida.
Introduction
O atirador vítreo-de-asa (Homalodisca vitripennis Germar 1821) foi identificado como o vetor predominante de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), o agente causal da doença da videira (PD) de Pierce na América do Norte 1. Gestão da população de insetos rapidamente se tornou o foco de investigação para combater este problema devastador para a indústria de viticultura na Califórnia e em todo o sul dos Estados Unidos. Um de sentido positivo, vírus de RNA de cadeia simples, que pertence à família Dicistroviridae, Homalodisca vírus-01 coagulata (HoCV-01) foi identificada em H. selvagem populações vitripennis e mostrado para aumentar a mortalidade nessas populações 2-4, enquanto diminuem a resistência do inseto aos inseticidas.
Desenvolvimento de métodos para efetivamente traseira infectado H. vitripennis à idade adulta em um ambiente de laboratório têm sido difíceis porque
O objectivo global dos processos seguintes é para produzir uma elevada concentração de HoCV-01 apropriada para utilização como um agente de controlo biológico. A replicação viral requer uma célula viva, que é por isso que cultivar com sucesso e otimizando H. vitripennis culturas é vital para o progresso de produzir níveis rentáveis de vírus.
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Protocol
Cultura 1 celular
NOTA: linhas celulares Homalodisca vitripennis estabelecidos pelo laboratório Dr. Wayne Hunter no Serviço de Pesquisa Agrícola do USDA (Ft. Pierce, FL EUA) foram utilizados para iniciar um estoque laboratório composto por estágios de células mistas, incluindo fibroblastos iniciais e monocamadas.
- Executar os seguintes procedimentos em ambiente estéril laboratório mantido a uma temperatura de 20-24 ° C de 25 cm 2 frascos de cultura.
- Cultivar e manter culturas de 25 centímetros dois frascos de cultura de tecidos, utilizando meio de H2G + Cigarrinha, uma modificação meios de abelha WH2 10 (Tabela 1).
- Incubar frascos de cultura a 24 ° C, com ~ 53% de humidade.
- Use um microscópio invertido com uma ampliação total (MT) de 100X para acompanhar o crescimento da cultura, por exemplo, verificar se há algum crescimento celular anormal, monitorização de quaisquer contaminantes potenciais, e verificar o progresso de crescimento em todo o culsuperfície tura.
- Realize uma mudança médio completo (~ 4 ml de meio de cultura por frasco) a cada 7-10 dias sem perturbar a superfície da cultura.
- Passa culturas quando a superfície da cultura é aproximadamente de 80% coberta por um crescimento celular (confluente) usando 0,25% de tripsina contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para dissociar as células. Adicionar ~ 2 - 3 ml de tripsina a cada balão de cultura e expor a cultura (s) para a enzima durante curtos períodos de tempo (5-10 min) para obter a dissociação de células completas.
- Adicionar uma quantidade igual de meio fresco para o frasco de cultura (s) (~ 2 - 3 ml) para parar a actividade da enzima e transferem toda a solução para um tubo cónico de centrifugação.
- As células por centrifugação a 4 ° C durante 6 min a 350 x g.
- Retirar o sobrenadante sem perturbar o pelete de células e adicionar ~ se 8 ml de meio fresco a cada tubo. Gentilmente homogeneizar células usando uma pipeta.
- Culturas desdobramento à 1: 2 proporção de 25 centímetros 2 frascos (~ 4 ml de soluti celularem por balão) e deixam as culturas recentemente transmitidos em repouso por 48 horas para permitir que as células em suspensão para fixar firmemente à superfície do frasco.
NOTA: O cultivo de células de 48 poços em placas estéreis de cultura de tecido com uma superfície de crescimento de 1 cm 2, também é possível e que pode ser mantida na mesma forma como frascos de cultura, com uma redução do volume de meio de cultura para ~ 250 mL.
2 Extracção vírus inteiro
- Homogeneizar corpos inteiros de vírus H. positivo vitripennis em tampão fosfato, pH ~ 7,2, com tri-hidrato de dietilditiocarbamato de sódio a 0,02% (DETCA) por rotação durante ~ intervalos de 10 segundos até que não haja mais de grandes aglomerados de tecido presente. Extracto de vírus através de centrifugação a superspeed 124.500 xg durante 4 horas a 4 ° C ou 22.000 xg durante 16 horas a 4 ° C. Se se formar um precipitado na parte superior, retire-os com um cotonete estéril 11.
- Descartar o sobrenadante.
- Coletar o sedimento edissolvem-se com 5 mL de 10 mM de tampão de fosfato (sem DETCA), pH ~ 7,2, contendo 0,4% de ácido Na-desoxicólico e 4% de éter de polietileno glicol de hexadecilo (Brij 52).
- Para misturar o sedimento assim, remover o pellet a partir do lado do tubo e esmagar até que em solução, se necessário.
- Adicionar mais tampão fosfato 10 mM, em incrementos de 5 ml ~ para ajudar a pelota entrar em solução, se necessário, e combinar-se dois tubos 11.
- Centrifuga-se a solução a 300 xg durante 15 minutos 11.
- Remover o sobrenadante e passar a solução através de um filtro de 0,45 mm, e recolher o filtrado em tubo grande coleção 11.
- Transferência filtrado para uma membrana de diálise com um peso molecular de corte (MWCO) de 3,5 kD, utilizando pequenas quantidades de tampão fosfato 10 mM (pH 7) contendo nenhum DETCA 11, se necessário.
- Colocar a membrana de diálise num copo grande cheio com ddH2O a 4 ° C. Alterar o DDH 2 O a cada hora fou 5-6 horas, até que se forme um precipitado branco na membrana 11.
- Recolhe-se o vírus purificada a partir de dentro da membrana e sujeitar a solução de vírus de 100% de uma série de diluições de 10 vezes por adição de 10 ul de solução de 90 ul de ddH 2 O. Subsequentemente juntar 10 ul de uma diluição de mais 90 ul de ddH2O até atingir uma diluição de 1: 100.000.
- Solução vírus armazenar a -80 ° C.
3. replicação viral
- Células de sementes em placas de cultura de 48 poços e crescem todas as linhas até o crescimento celular é de 80% confluentes (cerca de 72 horas pós-pass se as células estão crescendo a uma taxa média).
- Inocular cada linha de células com o vírus diluído em série, uma vez o crescimento das células atinge a confluência, isto é, uma linha de uma diluição de 1:10, uma linha de uma diluição de 1: 100, etc, excepto para a linha de cima. Utilizar a linha superior como um controlo e adicionar 10 uL de ddH2O a cada poço como controlo de volume.
- A fim de estabelecer uma concentração de células a partir da linha de base para comparação com as contagens de células experimentais, dissociam-se e contam a primeira cavidade de cada fileira, antes da inoculação inicial de todos os poços das culturas com vírus.
- Monitor de placas de cultura de todas as 24 horas após a inoculação virai para qualquer alteração de cor no meio indica uma alteração do pH e de quaisquer alterações na morfologia celular.
- Imagem uma coluna da placa de teste, em cada ponto do tempo, utilizando um microscópio invertido em 100X TM.
- Remover todo o meio da coluna, que foi representada por imagem em cada ponto de tempo de 24 horas e armazená-lo a curto prazo a -20 ° C, durante a extracção de ARN viral e quantificação ou a longo prazo a -80 ° C.
- Dissociar as células dos poços, após a remoção do meio como anteriormente descrito nos passos 1,6-1,9, utilizando apenas ~ 250 uL de EDTA a 0,25% de tripsina e meio fresco para parar a actividade da enzima e ~ 250 ul de meio fresco para re-suspender a Pelle célulat.
- Adicionam-se 10 ul de 0,4% de azul tripano mancha para cada tubo contendo as células para realizar a contagem de células após a dissociação das células por cada período de 24 horas durante uma semana. Permitir mancha para descansar por 10 min antes de realizar a contagem de células.
- Efectuar a contagem de células no espaço de 1 hora de exposição à mancha ou células viáveis irão começar a absorção de manchas, bem como as células não viáveis.
- Lentamente, adicionar 10 ml da solução de células coradas para cada lado de um hemocitómetro padrão utilizando uma micropipeta. Permitir que a solução a adoptar-se por acção capilar, para evitar bolhas de ar.
- Conte o número de células viáveis (não-coradas) em ambos os lados do hemocitómetro (o equivalente a quatro contagens dos 16 quadrados no hemocitómetro). Efectuar a contagem de células para cada poço da coluna que foi removida.
- Calcular a média das contagens das células de cada coluna usando a seguinte fórmula para se obter o número total da contagem de células: (média do número de células / 4) x factor de diluição = número de células 10 x
4 Extração Vírus de Cultura de Células
- Remover tratado H. vitripennis células de balões de cultura como anteriormente descrito nos passos 1,6-1,8, utilizando apenas ~ 250 uL de EDTA a 0,25% de tripsina e meio fresco para parar a actividade da enzima.
- Descartar o sobrenadante.
- Extracto de vírus a partir de células de cultura de acordo com o protocolo anteriormente descrito nos passos 2,3-2,8.
Extração de RNA 5.
- Extrair RNA de amostras de meio colhidas durante cada ensaio de vírus de uma semana, utilizando uma extracção de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidina concebido para amostras líquidas por protocolo do fabricante.
- Loja extraiu amostras a -80 ° C.
6. RT-PCR
- Estabelecer padrões virais para RT-PCR, executando PCR tradicional usando opar de iniciadores HoCV RT-PCR o iniciador 1 (5'-frente GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 ', reverso 5'-ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3') com o vírus isolado a partir de todo o corpo H. vitripennis.
- Produto de PCR sujeita a electroforese em gel, durante 60 minutos a 120 V num gel de agarose a 2% contendo 0,1% de brometo de etídio.
- Excisar as bandas do gel e purifica-se utilizando um kit de extracção de gel, conforme o protocolo do fabricante.
- Piscina tudo excisadas e produto gel purificado e ainda purificar por precipitação básica etanol. Eluir o produto a precipitação em cerca de 30 ul de Tris EDTA (TE) para aumentar a concentração total da amostra.
- Quantificar o nível de cDNA em amostras combinadas através de espectrofotometria utilizando 260/230 configurações de comprimento de onda para a detecção de ácido nucleico.
- Executar uma série de diluição em série de dez vezes da amostra purificada variando de 57 ng / mL a 57 ag / mL (10 -18). Realizar a diluição em série semelhante à descrita in 2.8 com os ajustes feitos para a diferença de requisitos de concentração.
- Determinar os limites de detecção da série de diluição através da realização de qRT-PCR, utilizando um kit de qRT-PCR com quantificação fiável de transcritos de baixa abundância.
NOTA: As concentrações virais inferior a 5 x 10 -3 cópias não são detectáveis. - Extrair RNA de amostras experimentais como descrito anteriormente no passo 5.1 e utilizando espectrofotometria de quantificar.
- Normalizar todas as amostras extraídas de 5 ng / mL, utilizando água livre de nuclease.
- Realizar qRT-PCR em todas as amostras, em duplicado, como reacções de 25 ul usando um kit de um único passo de qRT-PCR, com a capacidade para detectar números de cópias baixo como se segue: 50 ° C para manter 10 min; 95 ° C espera por 5 min; 30 ciclos de 95 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 30 seg; derreter 50-99 ° C durante 5 segundos em cada passo.
- Faça a mistura principal para que cada mistura de reação contém 12,5 mL de maste 1xmistura r, 1,0 ul (0,3 mM) de iniciador para a frente, 1,0 ul (0,3 mM) de iniciador reverso, 0,25 ul de transcriptase reversa e de quantidades variáveis de modelo com base em valores de normalização.
- Levar o volume total de reacção de 25 ul com RNase isenta de água.
- Incluir cinco concentrações padrão em cada PCR executado com os seguintes números de cópias: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4, e 5 x 10 -2 cópias. Definir o limite para cada corrida até um pouco abaixo uma fluorescência de 10x -2.5 para reduzir o ruído durante a aquisição precoce no início de cada execução.
7. microscopia confocal
- Cultivar células Homalodisca vitripennis em um doze poços contendo lamínulas de vidro com 18 mm de diâmetro em cada poço.
- Inocule uma coluna na placa de cada 24 h durante um período de quatro dias, uma vez que uma monocamada é alcançado. Assegurar que cada column contém também um controle, uma diluição baixa viral (1:10) bem e uma diluição viral alta (1: 100.000) também. Utilizar soluções de vírus obtidas a partir do passo 2.8.
- Remova toda a mídia no quinto dia e lavar as células duas vezes com 1x PBS (pH 7,4).
- Fixar as células com paraformaldeído a 4% frio, a 4 ° C durante 30 min.
- Adicionar 500 ul de 1x tampão de fosfato salino (PBS) para as células e lava-las durante 10 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo a baixa velocidade. Lavam-se as células três vezes.
- Adicionar 500 ul de 0,1% de Triton X-100 às células para permeabilizar eles. Deixar assentar durante 10 min à temperatura ambiente.
- Lave as células uma vez, como descrito anteriormente no passo 7.5.
- Adicionar 500 ul de uma solução a 5% de albumina de soro bovino (BSA) para bloquear as células à temperatura ambiente. Deixe descansar por 2 horas e depois retire.
- Diluir estoque rodamina faloidina vermelho-conjugado (RCP) 1: 250 em 1x PBS contendo 5% BSA e adicionar 250 ul da diluição a cada poço a mancha de F-actina.
- Placa de cobertura em alumínio fóleo para evitar que o corante de branqueamento e incubar as células a 4 ° CO / N.
- Retirar a RCP após 12 h de incubação e substituí-la com 250 ul de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (250 ug / ml) diluídas em PBS 1x contendo 5% de BSA, para corar os núcleos das células .
- Incubar as células contendo DAPI, à TA durante 1 hora.
- Lave as células três vezes com PBS 1x, como descrito anteriormente no passo 7.5.
- Remova cuidadosamente as lamelas dos poços e montar a lâminas de microscópio utilizando um meio de montagem com um reagente anti-fade.
- Permitir que os slides para secar lightproof caixas até visto sob o microscópio confocal. Ver de lâminas preparadas para, logo que possível, como corantes podem desaparecer rapidamente.
- Imagem de células marcadas, utilizando um sistema confocal equipado com um microscópio que contém uma lente de 63X (óleo)-apochromate plano.
- Defina os comprimentos de onda do laser para 543 ± 10 nm de excitação e 575 ± 10 nm de emissão para Rhoadmine phalloidin vermelho-conjucated, E 369 ± 10 nm de excitação e de emissão de 450 ± 30 nm para DAPI.
- Use ganho idêntico e partiu-configurações para o detector de obter todas as imagens.
- Processar imagens usando o software apropriado para o processamento de imagem e de triagem e de importação desejada imagens em um software gestão de imagem.
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Representative Results
A adesão celular e crescimento ocorreu dentro de 48 horas de passagem em ambos os pequenos e grandes frascos de cultura, a partir de culturas primárias e passagens contínuas. Crescimento de fibroblastos e desenvolvimento também foi observada dentro deste prazo. Quando frascos recém semeadas foram perturbados antes de 48 horas, houve um declínio visível na fixação das células, levando a culturas de crescimento lento e às vezes nenhum apego ou de crescimento em tudo. As células foram de aproximadamente 80% confluente dentro de uma semana de passagem e formou uma monocamada em 10-14 dias (Figura 1). As culturas primárias que foram cultivadas no início deste estudo, ter sobrevivido mais de 30 passagens celulares sem qualquer deterioração morfológica ou declínio geral viabilidade celular.
A adesão celular e crescimento ocorreu dentro de 48 horas de passagem de frascos para placas. Formação de monocamada foi conseguida em um período de tempo mais curto, cerca de 5-6 dias, pois é uma superfície de crescimento menor. Culturas infectadas fotografou umt 100X sob microscopia de luz mostrou sinais de declínio integridade forma da célula. Em 48 horas após a infecção, o que parece ser grandes buracos estavam presentes na superfície das células. Através frascos de cultura, as células encolhido e isolada a partir da superfície da cultura de cerca de 72-96 horas após a infecção com o não-diluída HoCV-01 (Figura 2).
A contagem média de células vivas para controle e amostras experimentais foram calculados e plotados para descrever diferenças na abundância de células vivas entre carga viral ao longo do tempo (Figura 3). Um aumento consistente em células vivas para o grupo controle está presente, indicando as células saudáveis. Comparativamente, todos os grupos de tratamento tiveram um declínio acentuado no número de células vivas presentes ao longo do tempo. Os grupos de tratamento virais mais altas indicam um declínio muito mais acentuado na cultura de saúde, com uma grande queda em células vivas entre 48-72 horas, enquanto os grupos virais mais baixas declinar lentamente até cair fora em torno de 144 horas. A ANOVA de duas vias wianálise th Bonferroni post-hoc foi utilizada para testar as diferenças nas taxas de matança de cultura de células por HoCV-01 com base na contagem de células vivas em cada grupo de tratamento, em comparação com cada ponto de tempo do estudo, bem como entre os grupos. A análise bidireccional de variância teve um efeito principal significativo do factor tempo, F (7, 432) = 82,5, p <0,0001, o que sugere que o comprimento de tempo de culturas foram expostas a um tratamento afectado cultura longevidade. O efeito do tipo de tratamento de culturas receberam foi significativa, bem como, F (5, 432) = 170,6, p <0,0001, indicando que a quantidade de carga viral de uma cultura recebe inicialmente afecta a sobrevivência da cultura. Um efeito significativo na interacção entre o factor tempo e o factor de tratamento está também presente, F (35, 432) = 17,63, p <0,0001, sublinhando que quanto maior for a carga viral recebeu o curto período de tempo necessário para reduzir a aptidão da cultura e, inversamente quanto menor for a carga viral, olongo período de tempo necessário para o mesmo efeito. Testes post-hoc de Bonferroni ilustrar uma diferença significativa entre os grupos de tratamento e controle, indicando uma resposta à dose notável.
Survival probabilidade de células inoculadas com tratamentos virais mais elevadas foram inferiores, como testado por curvas de Kaplan-Meier (Figura 4), correlacionando-se com as conclusões das análises a contagem média de células vivas. Houve uma taxa de sobrevivência de 100% para controlo ou células não infectadas. Células expostas aos tratamentos virais elevadas tiveram um declínio acentuado na probabilidade de sobrevivência ao longo do tempo, enquanto os tratamentos virais mais baixas têm uma maior probabilidade de sobrevivência até a 144 horas, em seguida, um declínio na probabilidade de sobrevivência está presente. Cox de riscos proporcionais de análise do modelo não foi significativa, o tratamento (IC 95% [0,76, 1,02]) Coef = 0,8812, p> 0,05. Apesar de não significativo, os dados sugerem que as células expostas ao vírus são 88% mais propensos a apresentar menores taxas de sobrevivência ao longo do tempo.
Para cada corrida qRT-PCR, as normas mais elevadas virais ramp up mais cedo do que os padrões virais mais baixas e amostras experimentais. A partir de cada corrida, replicar valores Ct foram analisados utilizando um ANOVA de duas vias para testar as diferenças na abundância de HoCV-01 ARN presente nas amostras experimentais e para comparar os valores de vários valores de controlo. A análise de duas vias de variância não mostrou efeito significativo principal do fator tempo, F (7, 289) = 0,38, p> 0,05, ou na interação entre os grupos de tratamento e do tempo, F (63, 289) = 0,14, p > 0,05. Um efeito principal significativo entre os grupos de tratamento, F (9, 289) = 135,7, p <0,0001, indicando que a quantidade de vírus inicialmente introduzido a cultura celular afecta a quantidade de ARN virai detectado foi observada. Testes post-hoc de Bonferroni foram executados e mostrar as interações significativas entre os grupos de tratamento e medidas de controle, mas sem interações significativas entre o tratamento grupos sozinho, indicando que não há dose resposta mensurável.
Diferenças na morfologia celular de saudável e HoCV-01 infectados H. vitripennis células em 24 e 72 horas foram vistos sob fluorescência. A diminuição do número de núcleos presentes, bem como a aparência disforme de F-actina em células expostas a HoCV-01, em comparação com os controlos indicam que o vírus tem um grande impacto na cultura de saúde. As células expostas à maior carga viral 01:10 mostraram maior dificuldade do que as células expostas ao tratamento viral mais baixa. As células de controlo aparecem mais abundante e ter morfologia normal entre os dois pontos de tempo (Figura 5).
| Meio Insect de Grace (complementado, 1x) | 210 ml |
| 0,06 M solução de mono-hidrato de L-histidina (pH = 6.5) | 290 ml |
| Meio 199 (10x) | 10 ml |
| Meio 1066 (1x) | 17 ml |
| Sais de Hank equilibrada (1x) | 33 ml |
| L-Glutamina (100x) | 1,5 ml |
| MEM, mix de aminoácidos (50x) | 1,5 ml |
| Solução 1 M MgCl | 6 ml |
| Pen-Strep (w / Glutamina) | 2,5 ml / 500 ml |
| Nistatina | 1,0 ml / 500 ml |
| Gentamycin | 1,5 ml / 500 ml |
| Dextrose | 1,8 g |
| De soro fetal bovino | 10% do volume final |
Tabela 1 + H2G componentes do meio cigarrinha.
Figura 1 Imagens de H. vitripennis cell crescimento in vitro capturado em 100X TM. (A) Células dois dias (48 horas) pós-passagem exibindo fixação e desenvolvimento de fibroblastos. (BE) Células quatro, seis, oito e dez dias após a passagem continua a crescer em toda a superfície da cultura. Formação (F) Monolayer ocorrendo de 10 ~ 14 dias. Barras de escala:. 100 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Infected H. vitripennis células fotografada em 100X TM para capturar alterações morfológicas. (A) o crescimento de fibroblastos antes da inoculação. (B) As células 24 h pós-infecção. (C) As células 48 h pós infecção. (D) 96 h após a infecção as células têmdestacada principalmente a partir da superfície da cultura e meio tornou-se nublado. Barras de escala:. 100 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 Bar gráfico mostrando a contagem de células vivas médios para amostras experimentais. Média a contagem de células vivas foram calculadas para amostras experimentais por carga viral recebida para cada dia durante o período experimental e são mostrados aqui com barras de desvio padrão. A contagem média de células mostram uma diminuição significativa em células vivas ~ 72 h pós-infecção com elevadas cargas virais e reduções significativas nas contagens de células vivas em ~ 144 horas pós-infecção com baixas cargas virais. favorclique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 Kaplan-Meier análise de sobrevivência de cinco diferentes HoCV-01 tratamentos em comparação com um controle não infectado em H. culturas de células vitripennis. culturas Controle manteve uma taxa de sobrevivência de 100% em comparação com os cinco grupos de tratamento. A menor probabilidade de sobrevida foi observada no grupo de tratamento de alta e todos os grupos de tratamento cabeça para zero a probabilidade de sobrevida em 168 horas quando n = 10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figu. re 5. imagens confocal de controle e células infectadas H.vitripennis Homalodisca vitripennis células foram infectadas com série diluído HoCV-01 em 1:10 e 1: 100.000 concentrações em intervalos de 24 horas. As células foram tratadas com rodamina faloidina e manchas DAPI para visualização de F-actina e núcleos dentro das culturas. Imagens confocal foram capturados em 63X e mostram uma quebra na morfologia celular em 72 horas em ambas as diluições virais baixas e altas. Barras de escala:. 1 mícron por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Crescentes preocupações em relação à entrada de espécies invasoras agrícolas têm levado a um aumento da procura de novas metodologias para se defender contra pragas e patógenos emergentes. Um foco de prevenção e gestão de doenças envolve a gestão de vetores de patógenos e era o alvo principal deste estudo. Economia desempenhar um papel vital na decisão de produzir este tipo de biopesticida para gerenciar vetores de patógenos na agricultura porque a aplicação prática precisa ser de grandes quantidades em grandes áreas, mas a um baixo custo 12. A prática de utilização de cultura de células para pesquisa e desenvolvimento tem se tornado cada vez mais comum e, como tal, os impactos deste estudo são significativos. Identificar estratégias economicamente viáveis manejo integrado de pragas (MIP) é fundamental para a continuidade da produção agrícola de sucesso em todo o mundo e os achados deste estudo contribuir para o progresso em melhorar as estratégias de MIP e reduzir a ocorrência de PD de videira.
H. culturas de células vitripennis foram propagadas e mantida por mais de um ano, sem qualquer deterioração morfológica visível. Números de passagem pode afetar drasticamente os resultados de estudos in vitro em células de mamíferos, alterando o metabolismo celular e características de crescimento 13. Como as células replicam in vivo e in vitro, os telómeros encurtam com cada ciclo de replicação das células e, eventualmente, atinge um limite crítico onde telómeros se tornar demasiado curto e induzir a senescência celular 14. Quando grave encurtamento dos telômeros ocorre, instabilidade genética e, finalmente, crise, ou morte celular maciça ocorre 15. Devido a esse fenômeno, as culturas raramente sobrevivem além dos 50 subcultivations ou um ano, considerado o limite de Hayflick, com base nos seguintes critérios: retenção de cromatina sexual, diferenciação histotypical, inadaptação suspender cultura, características não-malignas in vivo, limite finito de cultivo, Morfologia celular semelhante ao tecido primário, o aumento da produção de ácido em relação a linhas de células, a retenção de substância receptor Coxsackie A9 e facilidade com que as estirpes poderia ser desenvolvido 16. As potenciais complicações de números de passagem não foram observados durante o período do estudo, indicando que este método de propagação linha celular é capaz de produção contínua durante longos períodos de tempo. Porque a utilização da cultura de células sobre a criação de insectos vivos ou outros métodos de produção caro e complicado torna-se rapidamente comum em muitas disciplinas, a longevidade deste tipo de linha celular tem muitas aplicações práticas. Se mantida adequadamente, uma única linha de células primárias podem ser usadas para vários ciclos de produção de vírus.
Os dois principais fatores na manutenção de sucesso a longo prazo destas células foram o tempo de perturbação para as culturas recém-semeadas e preparo do meio adequado. As culturas que permaneceram intocados pela primeira 48 horas depois da passagem mostrou um aumento acentuado do crescimento-balão transversal em comparação com aqueles que foram movidos dentro dessa janela inicial. Quando deixado em repouso, a rápida replicação de células monocamadas alcançado em menos de 10 dias de pós-passagem em frascos de cultura. Preparação Médio era tão vital durante o estudo como o tempo perturbação, tanto quanto saúde cultura geral estava preocupado. Mesmo com antibióticos presentes no meio, a contaminação bacteriana ainda era um fator importante a considerar quando se prepara médio. Ao permitir que as alíquotas de forma a permanecer à temperatura ambiente durante vários dias antes da sua utilização em culturas, a probabilidade de uma série devastadora de cultura colapsa devido a contaminação bacteriana foi reduzida a um factor de quase inexistente. Antibióticos, tais como a gentamicina e a estreptomicina, são comumente utilizados em meio de cultura de células para combater bactérias encontradas no interior das células e qualquer contaminação exterior. Ambos estes antibióticos têm sido associados a uma depressão do crescimento de células de mamíferos em cultura de umd para uma redução na utilização de técnicas assépticas e preocupação com o aumento da probabilidade de desenvolvimento de estirpes resistentes aos antibióticos de bactérias 17,18. Os antibióticos não deverá ser usado em excesso; no entanto, a sua utilização é necessária para evitar problemas de contaminação de culturas de células.
As implicações desses fatores são tais que up-scaling produção de células é uma opção viável para a produção em massa rápida de materiais biopesticida com passos menores para garantir a qualidade de culturas de células. Biorreatores surgiu na década de 1950 e 1960, e, desde então, evoluiu para fornecer meios eficientes de produzir bilhões de células em uma quantidade excepcionalmente curto de tempo 19. Existem muitos tipos de bioreactores que poderia ser utilizado para aumentar significativamente o número de H. vitripennis células produzidas de uma só vez e o processo de desenvolvimento desse tipo de sistema de produção que requer o desenvolvimento de um método para tratar as células para evitar a tosquia from crescimento superfícies em biorreatores.
Continuação do crescimento das linhas de células bem sucedido é essencial para a replicação HoCV-01 e uma vez alcançada, pode ser utilizada para resolver o problema da quantidade de vírus é necessária para a replicação em quantificável vitro e quanto tempo o vírus deve ser permitido permanecer dentro das culturas. Foi encontrada uma correlação clara entre a quantidade de carga viral inicial recebida pelas células ea duração de partículas do vírus tempo foram autorizados a incubar dentro das células. Quanto maior for a carga viral recebido, quanto menor for o tempo requerido para a morte celular, indicando a replicação viral rápida. No entanto, em todos os tratamentos número de células diminuiu para valores inferiores ao valor limite de 25 x 10 4 células / ml em cerca de 144 horas após a infecção, o que demonstra a capacidade de sobrevivência de um limiar de cultura celular global. Os resultados ilustram que grandes quantidades de vírus pode ser produzida rapidamente, se grandes quantidades de vírus estão prontamente disponíveis para a infecção inicial, ou que increASED quantidades de vírus pode ser produzida ao longo de um longo período de tempo com a dose inicial mais baixa. Variabilidade na relação entre os fatores concentração e tempo permite alguma flexibilidade nas opções de produção para estudos de larga escala com um tempo de extração viral ideal de 72-96 horas pós-infecção.
Utilizando culturas de células para estudos virais depende da capacidade para detectar o vírus alvo e quantificar os resultados do estudo. Um método fiável para isso é a utilização de PCR para verificar a presença de sequências virais de ARN nas amostras experimentais. A análise dos valores de Ct a partir de dados da PCR neste estudo não dá uma resposta clara para que o tempo de extração ideal de vírus seria; no entanto, a falta de um tempo de extração definitivo não é indicativo de uma incapacidade de replicar HoCV-01 in vitro, mas a natureza sensível dos estudos virais. Contagem de células utilizando azul de tripan se prestam a uma visão mais clara dos tempos ideais de extração, mas não são de forma a definitive resposta. Dados de morte celular que ilustra elevadas cargas virais bastante reduzida para provocar a sobrevivência de células após 72 horas, indicando que a extracção viral entre 48 horas e 72 horas pós-infecção pode ser ideal para reduzir a degradação celular de partículas virais como as células na cultura começam a morrer exponencialmente. Tempos de extracção em cargas virais iniciais mais baixas são mais ambíguas, mas com diminuições dramáticas na capacidade de sobrevivência das células depois de 144 horas, que pode ser especulado que o tempo de extracção óptima seria 24-48 horas antes que o ponto de tempo. Determinação do tempo ideal de extração viral é vital para a produção eficaz de biopesticidas para uso contra H. vitripennis infestações e este estudo tomou um passo importante para a determinação desses momentos.
Microscopia é uma ferramenta fundamental para a análise de cultura de células e este estudo é o primeiro a usar microscopia confocal com H. vitripennis células. Aumento apego proteína de imagem ou de declínio e abundância denúcleos de célula é o primeiro passo para estudos mais detalhados sobre a atividade intracelular de HoCV-01 in vitro. Ao longo deste estudo, as culturas de células foram mantidas sem deterioração morfológicos visíveis. Depois de cada passagem celular subsequente, foi observado o crescimento normal de fibroblastos, seguido da formação de uma monocamada. As células se manteve uniforme em forma e tamanho. No entanto, quando as culturas infectadas foram fotografadas por microscopia confocal, foram observadas diminuições da morfologia celular, em especial no ponto de tempo de 72 horas, com ambas as cargas virais iniciais elevadas e baixas. Estruturas semelhantes a pequenos buracos pode ser vista na superfície das células, possivelmente devido a morte celular e de expulsão do material intracelular. As células em toda a superfície do balão e, eventualmente enrugado começou a separar a partir da superfície. As implicações desta primeira utilização de microscopia de alta resolução se correlacionam com os resultados observados na análise de sobrevivência da célula e dá origem a outros usos possíveis para estudos virais aumentados. Avançado mitécnicas croscopy poderia ser utilizado para sua capacidade máxima, se o desenvolvimento de anticorpos para HoCV-01 foi realizado. Anticorpos para o vírus não só permitir a visualização do funcionamento intercelulares das partículas virais, mas também pode ajudar a determinar as taxas de proliferação e até extrações mais precisos vezes.
O processo de intensificação de produção de métodos desenvolvidos neste estudo para produzir um agente de controlo biológico eficazes para um ponto onde a biomassas de células são colhidas por vírus e, em seguida, aplicado a campos é principalmente uma questão de custo. Os custos iniciais de construção de sistemas de grande escala é alta e muitos fatores devem ser considerados, tais como: rentabilidade, celular e produtividade vírus, os custos de meio de cultura celular, taxa de aplicação, escala de produção e os custos de produção do lote 12. Apesar de o custo inicial, os potenciais pagar offs valem a pena o investimento. Através da utilização de técnicas de cultura de células, até questões de purificação de transmissão são muito reduzidas sejafazer com que a possibilidade de micróbio do intestino e outros vírus encontrados dentro de um corpo de inseto inteiro são muito reduzido, bem como os custos de instalações para manutenção de inseto ao vivo e criação.
Com cultura de células já estão sendo utilizados para a produção de proteínas, biopesticidas e outros produtos farmacêuticos, o valor econômico para esta área de investigação está a aumentar. Para produção em larga escala de biopesticidas em agricultura, seria benéfico para tentar um estudo semelhante ao completada aqui, mas utilizando um sistema de crescimento de células maior. Biorreatores e da nova metodologia de sistemas de cultivo de células da matriz 3D permitem maior volume de produção de células e, no mesmo sentido, maiores volumes de produção viral 20. Embora o custo inicial da construção de sistemas de grande escala é alta, o retorno da quantidade de produto pode ser produzido tem o potencial para ser ainda maior. Uma área de estudo que daria muito para promover estudos de transmissão em sistemas de larga escala described é acima de criação de anticorpos. Projeto anticorpo tem sido usado cada vez mais em estudos virais para doenças como HIV e hepatite C. Embora seja um processo demorado e detalhado, para HoCV-01, que permitiria a visualização de atividade viral in vitro com microscopia confocal e poderia levar a outro áreas de investigação.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning cell culture flasks | Sigma Aldrich | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71 | Olympus | Inverted microscope and camera | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049 | 0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA • 4Na per liter of Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Sigma Aldrich | M8937 | 48 wells (TC treated with lid) |
| DETCA | Sigma Aldrich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma Aldrich | CLS431206 | Cellulose acetate membrane, pore size 0.45 μm, membrane area 54.5 cm2, filter capacity 500 ml |
| Brij 52 | Sigma Aldrich | 388831 | Polyethylene glycol hexadecyl ether |
| Phosphate buffer solution | Sigma Aldrich | P5244 | Received as 100 mM diluted to 10 mM with sterile water |
| TRIzol LS | Life Technologies | 10296-028 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A5304 | For electrophoresis |
| Ethidium bromide | Sigma Aldrich | E7637 | BioReagent, for molecular biology, powder |
| QIAquick | Qiagen | 28704 | |
| QuantiTect qRT-PCR kit | Qiagen | 204243 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | Reagent grade, crystalline |
| PBS | Sigma Aldrich | P5368 | Phosphate buffered saline |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Rhodamine red-conjugated phalloidin | Life Technologies | R415 | Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36934 | |
| LSM510 Meta Confocal System | Carl Zeiss | ||
| LSM Zen 2007 Software | Carl Zeiss | ||
| Grace’s Insect medium (supplemented, 1x) | Sigma Aldrich | G8142 | H2G+ leafhopper medium component |
| L-histidine monohydrate | Sigma Aldrich | H8125 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 199 (10x) | Sigma Aldrich | M4530 | H2G+ leafhopper medium component |
| Medium 1066 (1x) | Sigma Aldrich | C0422 | H2G+ leafhopper medium component |
| Hank’s Balanced Salts (1x) | Sigma Aldrich | 51322C | H2G+ leafhopper medium component |
| L-Glutamine (100x) | Sigma Aldrich | G3126 | H2G+ leafhopper medium component |
| MEM, amino acid mix (50x) | Sigma Aldrich | 56419C | H2G+ leafhopper medium component |
| 1 M MgCl solution | Sigma Aldrich | M8266 | H2G+ leafhopper medium component |
| Pen-Strep (w/ glutamine) | Sigma Aldrich | G6784 | H2G+ leafhopper medium component |
| Nystatin | Sigma Aldrich | N6261 | H2G+ leafhopper medium component |
| Gentamycin | Sigma Aldrich | 46305 | H2G+ leafhopper medium component |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | H2G+ leafhopper medium component |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | H2G+ leafhopper medium component |
References
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