Farelerde Deneysel Bakteriyel Pnömoni İndüksiyonunun ve fenotipleme bir Non-invaziv ve Teknik Olmayan yoğun Yöntem

Summary

Çeşitli yöntemler, farelerde bakteriyel pnömoni modelleme için literatürde tarif edilmiştir. Bu yazıda, orofarinksin pipetle bakteriyel inokulum aspirasyonu (yani, inhalasyon) yoluyla zatürree uyarılması için bir non-invaziv, ucuz, hızlı bir yöntem açıklanmaktadır. akciğer doğal bağışıklık yanıtının değerlendirilmesi için aşağı akış yöntemleri de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Abstract

Toplum kökenli pnömoni, önemli bir halk sağlığı sorunu olmaya devam etmekle beraber, bakteriyel pnömoni fare modelleri son zamanlarda yatan hücresel ve moleküler patogenezi anlayışımızda önemli preklinik gelişmeler kolaylaştırmıştır. In vivo fare modelleri konak savunma tepkisi entegre fizyolojisini ve dayanıklılığını yakalamak bir şekilde alternatif basitleştirilmiş ex vivo yaklaşımlar ortaya değildir. Çeşitli yöntemler intrapulmoner aerosol içeren farelerde bakterilerin aşılanmasından, Burun içinden tatbikat, "kör" ve görsel koşullar altında oral endotrakeal kanülasyon ve deri endotrakeal kanülasyon için literatürde tarif edilmiştir. Tüm yöntemler göreceli yararları ve sınırlamaları vardır. Bu yazıda, detaylı fare ile aspirasyon (yani, inhalasyon) içeren bakterilerin intratrakeal teslimat için, non-invaziv teknik olarak yoğun olmayan, ucuz ve hızlı bir yöntem tarifise genel anestezi altında orofarenks pipetle bir bulaşıcı inokulum. Bu yöntem olmayan yakıcı biyolojik ve kimyasal maddeler, çok çeşitli akciğer verilmesi için kullanılan, ve hatta solunum prosedürlere az deneyimi olan Laboratuvar öğrenmek nispeten kolay olabilir. Aspirasyon pnömonisi yöntemi açıklayan ek olarak, aynı zamanda, özellikle, in vivo fare akciğer doğal immün yanıtının daha sonra analiz edilmesi için adım adım prosedürleri sağlayan bakteriyel açıklık ve enfekte solunum hücresel bağışıklık tepkisi ölçülmesi için yöntemler. pnömoni değerlendirmesine Bu entegre ve basit bir yaklaşım pulmoner doğuştan gelen bağışıklık üzerine genetik ve çevresel manipülasyon etkisi hızlı ve sağlam değerlendirme için izin verir.

Introduction

Toplum kökenli pnömoni aşılama iyileştirmeler ve antibiyotik stratejileri ^1,2 rağmen son 40 yılda ölüm oranlarında küçük genel değişiklikle, ABD'de enfeksiyon ölümlerin başta gelen nedenidir. halk sağlığı düzeyinde algılanabilir ilerleme olmamasına rağmen, son yıllarda dramatik gelişmeler öne akciğer enfeksiyonu fare modellerinin kullanımı ile mümkün bu adımların çoğu ile, pnömoni moleküler ve hücresel patogenezinin yapılmıştır. farenin genetik izlenebilir, murin ve insan bağışıklık sistemi ve ticari olarak temin edilebilir hale gelmiştir murin hedefli immünolojik reaktifler geniş bir dizi benzerliği bir araya alan hızlı bir ilerleme kolaylaştırmıştır.

literatürde tarif bakteriyel pnömoni Fare modelleri genellikle patojen aşılama için dört teknik yolları üzerine dayanıyordu: i) aerozolizasyonuna; ii) geçişsizanasal dağıtım; iii) oral doğum; ve iv) cerrahi intratrakeal enjeksiyon (yani, trakeotomi) ^3. Enfeksiyonun tüm yolları avantajları ve dezavantajları ³ var. oronazal florası, genel anestezi için gereksinimleri karışım özellikle, göreceli üst solunum yolunun maruz kalma potansiyeli distal akciğer teslim inokulum teslim patojenlerin lober dağılımı, teknik uzmanlık gereksinimleri ve prosedürel morbidite değişkenliği bu çapında büyük ölçüde değişiklik yaklaşımlar.

Yaygın kullanılan oral enfeksiyon teknikleri veya doğrudan laringeal görselleştirme ^3-5 altında bir 'kör' (non-görüntülenmiştir) yaklaşımı ya vasıtasıyla endotrakeal (translaryngeal) kanül içerir. Her iki yöntem de, sağlam iken, önemli eğitim gerektiren ve aynı zamanda üst solunum travma riski taşımaktadır. Mevcut raporda, w, oral enfeksiyon teknik, yoğun olmayan non-invaziv, ucuz ve hızlı bir yöntem tarifburada bakteriler (verilen örnekte Klebsiella pneumoniae) aspirasyon (yani, inhalasyon) yoluyla akciğerlere iletilir bir anestezi fare orofarenks pipetlenir. Biz ve diğerleri başarıyla ^6-9 aspirasyon pnömonisi tekniği kullandık. Bu çok yönlü ve kolayca öğrenilebilir akciğer dağıtım yöntemi, sitokinlere ve başka proteinlere, patojenle ilişkili moleküller (örneğin lipopolisakkarid), hücrelerin (örneğin, adoptif transfer) da dahil olmak üzere akciğer, pek çok ek olmayan kostik maddelerin iletimi için uzatılabilir ve toksinler (örneğin, bleomisin). Önemli bir teknik konuları ele ek olarak, aynı zamanda alt-bakteriyel açıklık ölçümünde (yani, koloni oluşturan birim [CFU] akciğer ve periferik organlarda miktar tayini), lökosit gibi pnömoni sonraki ana cevabın değerlendirilmesi için entegre, kantitatif bir yaklaşım tarif hava sahasında birikimi.

Protocol

Bütün deneyler Hayvan Bakımı ve NIEHS Kullanımı Komitesi tarafından incelendikten sonra Hayvan Refahı Yasası ve İnsani Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımına İlişkin ABD Kamu Sağlığı Hizmetleri Politikası'na uygun olarak yapıldı.

K. 1. Hazırlık pneumoniae Kültür

Dikkat: Bir biyogüvenlik düzeyi 2 (BSL2) başlık veya başka bir BSL2 belirlenmiş alandaki tüm adımları uygulayın ve enstitü BSL2 kurallarına göre atık atmak.

1. K. süspansiyon büyümesi için pneumoniae, bakteri, bir gliserol stokundan çözülmesi ve K. 1 ml aktarılarak bir çalışma kültürünün aşılanması 500 ml'lik bir ya da daha büyük bir şişe içinde triptik soya suyu (TSB) içinde, 50 ml pneumoniae stok.
2. Kültürlü log-faz K. 900 ul ekleyerek gliserol stokları yapmak pneumoniae steril gliserol, 100 ul -20 ° C veya -80 ° C donma. Uzun süreli depolama için, -80 ° C tavsiye edilir.
3. s 'den bir bakterigece boyunca balon çalkalanarak 1.1 TEP -, 200-225 rpm.In log fazı büyümesini teşvik etmek için 37 ° C'de (14 ila 18 saat) sabah 50 ml TSB içeren bir şişeye, bu gece boyunca kültürün 1-5 ml seyreltik ~ 2.5 saat boyunca çalkalanarak 37 ° C'de geri koyun.
4. K. 1 ml aktarın 2 dakika süreyle 7500 xg'de 1.5 ml tüp ve spin içine son adımından pneumoniae kültürü. Beyaz pelet görünür olmalıdır. yavaşça steril tuzlu su, 1 ml pipet ile bakteri tekrar süspansiyon, pelet bozmadan süpernatantı ve 2 dakika boyunca 7500 x g hızında tekrar döndürür.
   1. Bu yıkama adımı 2x gerçekleştirmek steril tuzlu su, 1 ml nihai, yıkanır ve yetiştirme.
5. Bu temiz inokulum log-bilge seri dilüsyonları gerçekleştirin. Örneğin, seri 10 ^-1 -10 ^-9 seyreltme dizi yapmak için steril serum fizyolojik 3.6 ml inokulum 400 ul ekleyin.
6. Yıkanmış K. OD ₆₀₀ belirleyin pneumoniae 1 ml koyarak1:10 ve 1: steril tuzlu su ile ilk kesme tek kullanımlık küvetler ve OD ₆₀₀ ölçmek içine 100 dilüsyonları. doğruluğunu sağlamak için çiftleri ölçün. 1.0 bir OD ₆₀₀ 4-7 x 10 ⁸ CFU / ml eşdeğerdir. OD CFU ilişkisi / ml doğrusal unutmayın.
   1. K. konsantrasyonunu hesaplamak için dilüsyonları gelen OD ₆₀₀ kullanın pneumoniae, OD uygulayarak: CFU / ml üzerinde dönüşüm ve faktoring seyreltme.
7. K. kullanın pneumoniae konsantrasyonu (aşağıya bakınız) farelere dağıtımı için bir <100 ul hacim içinde, istenen aşı CFU doz hazırlanması için.
8. Ayrıca 10 ^-6 -10 ^-9 seyreltileri, 100 ul ve oda sıcaklığında tek tek triptik soya ağarı (TSA) plakaları üzerine steril tuzlu su, 100 ul plaka. 37 ° C'de gece boyunca inkübe edildi ve deneyde kullanıldı ve kirlenme kontrol etmek için tam konsantrasyonu hesaplamak için bakteri kolonileri numaralandırmak.
   NOT: Son inokulum Gerçek bakteri konsantrasyonu 500 CFU / absorbans tahmin ml ± olabilir. Kendi kişisel deneyime dayalı CFU / ml dönüşüm: ampirik OD ₆₀₀ tekrar ayarlanmasına, farelerde in vivo kullanımdan önce pilot çalışmalarda CFU / ml ilişki: deneyci ideal OD ₆₀₀ teyit etmelidir.

K. 2. Fare intratrakeal (it) Aspirasyon orofarenksten pneumoniae

1. Bu fareler sağlamak benzersiz kuyruk işareti, dövme veya onaylanmış diğer tanımlayıcı ile tanımlanır.
2. prosedürünü hızlandırmak için izofluran fareleri çıkarmadan önce P200 pipet kullanarak bakteri inokulum dozaj hazırlayın. o aspirasyon ile en iyi sonuçları elde etmek için, taşmasını önlemek için <100 ul bir hacme kullanın. Burada K. 2000 CFU / 50 ul kullanın pneumoniae.
3. Izofluran gaz (1 L / dakika akış hızında, örneğin,% 2 izofluran) açık bir oda içinde veya enstitüsü göre fareler anesteziutional kurallar. Birlikte anestezi farelerin sayısı deneyci konfor düzeyi, aynı anda tipik olarak 1-2 ile tespit edilir. nefes gözlemleyin ve derin nefes görülebilir ve 2-3 sn nefesler arasında sayılabilir kez anestezi seviyesini onaylamak.
   NOT: Uçucu (inhalasyon) anestezik olası karıştırıcı etkileri hakkında endişe varsa, anestezi ketamin / xylazine intraperitoneal enjeksiyonu ile yerine elde edilebilir. Yukarıda tarif edilen yöntemle, Derin anestezi sadece birkaç dakika sürer. daha uzun süreli anestezinin ise, göz merhemi okular kuruma önlemek için kullanılmalıdır.
4. Fare uyuşturulduktan sonra, bir eğimli pleksiglas gemide mandal (Şekil 1) arasında gerilmiş bir lastik bant gelen maksiller kesici tarafından askıya bir semirecumbent yatar pozisyonda, içinde konumlandırmak.
5. Yavaşça P200 pipett ile ağız boşluğuna künt bir olmayan çıkıntılı forseps çifti ve mevduat dozu ile yan fare dilini çekine. dil ya da orofarenks ya travmayı uyaran önlemek için büyük özen.
6. geri dil tutarken fare nefes kadar hafifçe eldivenli parmak ile burun tıkamak. Fare iki veya daha fazla inhalasyonları almıştır ve hiçbir sıvı ağız boşluğunda görünür oluncaya kadar burun kapsayacak şekilde devam ediyor. burun kapsayan fareler zorunlu burun solunumu bağımlısı olarak fare, akciğerlere bakterileri nefes sağlamaya yardımcı olur.
7. aşılama kurulu fareyi çıkarın ve fare anestezi sonrası iyileşme ise burun deliğine engelleme yatak veya enkaz önlemek için sırtında fare koyarak, kendi kafesine geri dönün.
8. Bir kez tüm fareler dozda edilmiş ve anestezi uyandı, K. ile dozlanmış olan tek fareler içeren bir hücre / odasında ev fareleri 48 saat sonrası enfeksiyon ötesinde eğer pneumoniae. vücut ağırlıkları da dahil olmak üzere, günlük fareler izleyin.
9. fareler 48 ötesine gitmek için izin eğer günlük püre ve / veya tamamlayıcı ısı kullanınhr.

3. Bronkoalveolar Lavaj Sıvısı (BALS) Toplama ve Analizi

1. kurumsal kurallarına göre fareler Euthanize. Bu _CO2 inhalasyonu ve servikal dislokasyon ile ilişkili akciğer mümkün komplikasyonları önler olarak burada, 150 mg / kg sodyum pentobarbital ya kansız bırakılarak ardından ticari bir ötanazi çözeltisinin eşdeğer doz öldürücü bir enjeksiyon kullanımı.
2. sırtında pozisyon fare ve özellikle göğüs ve boyun bölgesinde üzerinde% 70 etanol ile kürk püskürtülerek fare sterilize edin.
3. daha sonra forseps ile sternum tutarak, sadece sternum altında uzunlamasına kesim olun, nick akciğer sağlayan diyafram, göğüs boşluğuna geri düşmek. trakea açığa damarsal her iki tarafındaki göğüs boşluğu yoluyla kesilmekte ve sonra boynundan yukarı.
4. trakea iki tarafında boyuna kasların tarafından çevrelenmiş olarak, dikkatle, ortasından kesilmiş ve yanlara doku itmekBu trakea içine kan getirebilir çevreleyen damarsal, kesme önler. damar nicked ise, önce trakea lümeni erişim için gazlı bez ile çevredeki temizleyin.
5. nick trakea baş aşağı yolda yaklaşık ¼ cerrahi makas veya bir iğne kullanın ve kaudal trakea içine 1x fosfat tamponlu salin (PBS) 1 ml önceden yüklenmiş bir 1 ml şırınga bağlı bir kanül yerleştirin. kullanarak fareler ya da kadınların 8 hafta <Eğer 600-800 ul lavaging hacmini azaltmak.
6. tüm loblar şişirmek ve sonra 3x tekrarlayarak, şırınga ile geri dışarı hacmi çekmeye izin yavaşça akciğer içine hacmi itin. PBS burun deliklerinin çıkan ise kanül trakea içine yeterince itti edilmemiştir ya da enflasyon çok hızlı gerçekleşiyor. akciğerleri iyi şişirme değil Alternatif olarak, kanül çok itti olmuştur, bu yüzden biraz geri çekin.
7. Buz üzerinde 15 ml bir tüp içinde havuzlanmış yıkama toplayın.
8. Çevirmek5 dakika boyunca 1200 x g'de hava boşluğu lavaj sıvısı, 1.5 ml tüp içine süpernatan toplamak ve -80 ° C'de dondurun. Daha sonra, protein, sitokinler ve çeşitli diğer biyokimyasal tahlillerde ölçülmesi için supernatant (yani, BALF) kullanın. Pelet bronkoalveoler boşluktan hücreleri temsil eder.
9. Kırmızı kan hücreleri (RBC) rengine göre hücre peleti belirgin ise, 1 x PBS, 5 ml ilave edilir, 1 dakika boyunca ACK lisiz tamponu 1 ml lize parçalama reaksiyonu durdurun ve tampon sulandırmak için. ACK lisiz tamponu ile muamele edilmiş olsun veya olmasın, aynı Tüm örnekler ele alın.
10. Sıkma hücreler 5 dakika süreyle 1.200 xg, süpernatant süzün ve 1 x PBS, 1 ml hücre getir.
11. Toplam hava sahası hücrelerinin sayımı için bir hemasitometre Vortex ve sayım hücreleri.
12. hücrelerin yoğunluğuna dayalı (80 virüslü bir fare için ul ve naif bir fare için ~ 150 ~) bir sitospin santrifüj slayt odasına yaklaşık 80-150 ul ekleyin. Spin hücremikroskop üzerine s hücre ayırıcı nüfusu belirlemek sonraki boyama kayar.
13. Hücreler gecede slaytlar üzerinde kurumaya bırakın. Leke leke 2 slaytlar sabitleştirici 7 kez, leke 1 9 kez, ve 7 kez batırarak tri-leke (örneğin, Hema 3 [tabloya bakınız]) ile hücreleri (lekeleri arasında durulama), ve kurumasını bekleyin. leke kuruduktan sonra, elle lamel slaytlar ve mikroskopta farklılıkları saymak. Genel olarak, nötrofiller ve monosit / makrofajlar kolayca boyutu ve çekirdek morfolojisine ile ayırt edilir.

4. Akciğer ve periferik dokularda Bakteriyel Yük belirlenmesi

1. Başlamadan önce: akciğer ve dalak için 1x PBS 900 ul ve kan 1x PBS 90 ul seyreltme tüpler hazırlamak. bakteri kültürü için ve oda sıcaklığında ayarlanmış etiket plakaları; Bu yüzden, doku toplandığında zaman bakteri büyümesi için homojenizasyon ve kaplama arasındaki en aza indirilmiş olacaktır.
   Not: nedeniyle heterojen deposi içinaspirasyon ile oluşabilir akciğerlerde bakterilerin tion, bireysel fareler toplam havayolu selülaritede veya toplam (iki taraflı) akciğer bakteriyel yükü ya analizinde kullanılması tavsiye edilir.
2. Adım 3.1 göre fare Euthanize ve daha sonra pıhtılaşmayı önlemek için bir heparinli tüpe koyarak, sol karıncıktan kan toplamak. 1x PBS 2 ml dalak ve yerleştirme uzaklaştırılarak elde edilmiş 1 x 5 ml PBS içeren 15 ml'lik bir tüp içinde akciğer lobları yer çıkarın. buz üzerinde tüpler yerleştirin. Her doku / fare arasında etanol ile aletleri temizlemek için özen gösterin.
3. tercihen her bir numune arasında değiştirilebilir tek homojenizatör ile buz üzerinde doku homojenize edilir. Tek kullanımlık homojenleştirici ipuçları deneyler arasında yeniden kullanım için otoklava sokulabilir.
4. dokusu homojenize edildikten sonra, seri dilüsyonları ve plakayı gerçekleştirin. plastik üzerine bir ayrım çizgi çizerek, tek bir TSA plaka üzerinde nüsha olarak verilen bir doku / seyreltme plaka örnekleri. Kaplama ve didökülmesinden önerileri aşağıda gösterilmiştir (her durumda, örneğin 10 ul plaka üzerine yayılır) ve 24 saat sonra, enfeksiyon otopsi dayanmaktadır. 48-72 saat örnekleri analiz için, dilüsyonları daha çok sayıda daha sonraki zaman noktalarında artan bakteri yükü nedeniyle kaplama gerekebilir.
   1. Kan - steril 1x PBS 90 ul içine kan 10 ul ekleyerek 1:10 sulandırmak. Plaka temiz ve iki nüsha halinde 01:10 seyreltilmiş numuneler. Kan kaplama sonra 10 dakika sitokinler ve kemokinlerin ölçümü için plazma elde etmek için, 9,300 xg, artık kan dönerler.
   2. seri steril 1x PBS 900 ul içine homojenize akciğer 100 ul ekleyerek 100: Akciğer İçin - 1 - 1:10 sulandırmak. Plaka düzgün homojenat ve iki nüsha halinde tüm dilüsyonlar.
   3. Dalak için 1 - sulandırmak: 10-1: 100 seri steril 1x PBS 900 ul içine homojenize dalak 100 ul ekleyerek. Plaka düzgün homojenat ve iki nüsha halinde, her iki dilüsyonlar.
5. yayılmış örnekler kısaca kurumaya bırakın. Gecede bir statik 37 ° C inkübatör TSA plakaları ve yeri ters çevirin.
6. levhasının her iki tarafından ve her çözücüden bakteri kolonileri ortalayarak kolonize bakteri sayısını belirler. akciğer için 5 ml ve dalak için 2 ml başlangıç ​​dilüsyonları faktör toplam doku CFU belirlemek için.

Representative Results

C57BL / 6 fareleri K. 2000 CFU ile enfekte edilmiştir akciğerlere orofaringeal aspirasyon yoluyla pneumoniae 43816 (serotip 2). Bu dozda, fareler genelde klinik belirtiler uyuşukluk, karıştırdı kürk ve% 5-10 (Şekil 2A) kilo kaybı da dahil olmak üzere 12-24 saat sonrası enfeksiyon göstermeye başlar. 48-72 saat sonrası enfeksiyon içinde, farelerin birçok tipik azalmış aktivite ile hunched duruşlar% 20 kilo kaybı ve sonuçların ortalama öncesinde ve uyarılmaya yanıt azalır hastalık ve morbidite belirtileri göstermektedir. Daha uzun süreli çalışmaları K. daha düşük bir doz gerektirebilir pneumoniae. K. 500 CFU enfeksiyonu pneumoniae kurtarma ve kilo alımı günde 5-6 (Şekil 2B) tarafından başlayan ile% 10-15 bir ağırlık kaybı ile karakterize edilir 3-5 d-sonrası enfeksiyon pik hafif hastalık ile sonuçlanır. Vücut ağırlığı az% 20 bir ağırlık kaybı ile, hayatta kalma genellikle prediktif olanly kurtarma ile ilgili.

konak yanıtının nihai başarı iyi fareler gibi dokunsal uyarılması ve / veya kilo kaybı minimal yanıt olarak can çekişme belirtileri, 10-14 gün süreyle izlenir ve (kurumsal olarak onaylanmış kurallarına göre) ötenazi burada hayatta kalma çalışmaları ile belirtilebilir >% 20. Bir kontrol grubu (Şekil 2C)% 50 ölümcül (yani, LD50 dozu) yaklaşan bir enfekte inokulum hedefliyorsa Survival çalışmalar genellikle en etkili olanlardır. LD50 dozu göreli olarak yüksek tespiti sağlar ve deney grubunda sağkalımı azalmıştır. Diferansiyel hayatta bu kadar çok sayıda enfeksiyon dozları bazen değişmiş bir konak savunma fenotip tespit etmek için gerekli olabilir, aşı-bağımlı olabilir.

K. ile alt solunum yolu enfeksiyonu pneumoniae Leuk sağlam bir akışı ile karakterize edilirsolunum yoluna ocytes. BAL hücre pelletinin boyama ile bağışıklık hücresi sayımı ve farklılaşma 6H enfeksiyondan (Şekil 3A) içindeki hava yolu bağışıklık hücrelerinde bir artış göstermektedir. Nötrofiller hava yolunun (Şekil 3A-B) ağırlıklı immün hücre olmak üzere 24 saat ile sellüler pik. C57BL / 6 farelerinin her iki cinsiyet K. yanıt olarak eşdeğer bir hava yolu lökositoz göstermektedir 24 saat ve 48 saat sonrası enfeksiyon (Şekil 3C-D) pneumoniae.

Bakteriyel pnömoni yerel (intrapulmoner) ve sitokinler ve kemokinlerin dahil sistemik pro-enflamatuar sitokinlerin neden olur. Yerel sitokin / kemokin düzeyleri geleneksel bir ELISA BAL'da veya çok katlı bir sitokin sistemi kullanılarak tespit edilebilir. IL-6, RANTES, TNFa, G-CSF, ve diğerleri de dahil olmak üzere sitokinler K. hem 24 saat ve 48 saat sonrası enfeksiyon görülebildiği pneumoniae ve lun'a fikir verirg mikroçevresinin ve bağışıklık hücrelerinin işe alma (Şekil 4).

akciğer, kan ve dalak gibi periferal doku (lar) toplanması iki mikrop lokal pulmoner temizliği hem de bakteri ekstrapulmoner yayılması fikir veren doku bakteri yükünün kantitatif sağlar. Seri Seyreltme ve akciğer kültür 24 saat ve 48 saat sonrası enfeksiyon (Şekil 5A) arasındaki mikrobiyal yükün artmasına göstermektedir. Benzer bulgular, kan ve dalak (- C Şekil 5B) belirtilmiştir. Dikkat çekici bir bimodal bakteriyel yük hayır göstererek, hatta akciğerde yüksek dereceli bakteriyel yükü karşısında, bazı yüksek dereceli bakteriyel yayılmasını olan fareler, ve diğerleri ile, 24 saat sonrası enfeksiyon, kan ve dalak yazabilir kan ya da dalak saptanabilir bakteriler. K. C57BL / 6 farelerinde pneumoniae bakteri yükü Gend değildirer-özel erkek ve dişileri çeşitli dokular sonrası aşılama (Şekil 5D-F) eşdeğer yükünü gösterdiği gibi.

Şekil 1:. Fare aspirasyon pnömonisi için prosedür Kurulu fareler Eğitim iki mandal bir pleksiglas veya benzeri kuruluna monte arasında bir lastik bant gergin dan kesici tarafından askıya, baş yukarı ve geri yönetim kurulu (yani, semirecumbent) için konumlandırılmış.

Şekil 2: Kilo kaybı ve değerlendirilmesi Morbidite K. pulmoner aspirasyon ardından pneumoniae. C57BL / 6 fareleri (n = durumda 10-20) K. aspirasyon ile enfekte edildi pneumoniae 43.816 (serotip 2). (A) 2000 CFU ile enfekte farelerden alınan günlük ağırlıklar, endeksli öncesi enfeksiyon ağırlığı. Bu çalışmada, hiçbir fareler, 500 CFU 150 gün 5. (C) Yaşam eğrileri başlayan kilo doğru geçiş ile günde 4 sonrası enfeksiyon yoluyla günlük kilo kaybı 500 CFU sonuçları ile geçmiş gün 6. (B) Enfeksiyon hayatta CFU, 2000 koloni oluşturan birim (CFU) enfeksiyonları, 500 CFU LD50 yakın olduğunu göstermektedir. Paneller A ve B Veriler ortalama ± SEM vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: K ile enfeksiyon pneumoniae Zaman bağımlı Havayolu Lökositoz içinde bulundu. C57BL / 6 fareler K. 2000 CFU ile intrapulmoner enfeksiyonu verildi zatürreeÇeşitli zamanda hava sahası sıvısında toplam lökositlerin (WBC), nötrofil (PMN), ve makrofajlar (Mφ) e. (A) Sayım sonrası enfeksiyon işaret ediyor. Boyama, PMN ve makrofajlar üzerine (B) kolayca Cytospin alanlarda nükleer morfoloji ve büyüklüğü ile tanımlanır ve sayılabilir. (C - D) erkek ve kadınlarda enfeksiyon 24 saat ve 48 saat sonrası enfeksiyon işe inflamatuar hücrelerin benzer sayıda sonuçlanır. Veriler ortalama ± SEM durum başına 6-25 / farelerin türeyen ve vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4:., Sitokinlerin ve kemokinlerin bakteriyel enfeksiyona yanıt olarak Havasahasında indüklenir C57BL / 6 fareleri intrapulmon verildiK. 2000 CFU ile ary enfeksiyon pneumoniae. BALS sitokin ve kemokin 24 saat ve 48 saat sonrası enfeksiyon multipleks tahlili ile ölçüldü. Veriler 5-15 fare / durum türetmek ve ± SEM. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5:. Pnömoni C57BL sırasında Akciğer ve periferik dokularda Bakteriyel Yükü zamana bağlı Genişleme / 6 fareleri K. 2000 CFU ile intrapulmoner enfeksiyonu verildi pneumoniae. (A) Akciğer parankimal bakteriyel yük TSA 24 saat ve 48 saat sonrası enfeksiyon akciğer Homojenat seri dilüsyonları kaplama ile ölçüldü. (B), kan dolaşımı ve (C) dalak bakteriyel yükü Benzer ölçüldü. ( F) çeşitli dokularda bakteriyel yük pnömoni indüksiyonu sonrası erkek ve dişi farelerde eşdeğerdir. Veriler 10 fare / durum türetmek ve SEM ± ortalamasıdır. Paneller B, C, E, ve F sıfır değerleri bir günlük ölçekte grafiklerini izin 0.1 değerini ayrıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Bakteriyel pnömoni Murin modelleri, pulmoner konak savunma tepkisi içine kritik anlayışlar sağladı, gen hedefleme ve in vivo biyolojik ve farmakolojik girişimlerin ortak oldular. Büyük gelişmeler enfekte hava sahasında ^10,11 nötrofillerin işe yöneten kemokinler ve adezyon moleküllerinin anlayışımızda özellikle yapılmıştır. Pnömoni in vivo modelleri, hücre bazlı veya alternatif yaklaşımlar aksine, aynı zamanda endokrin içine anahtar anlayışlar sağladı enfekte akciğer ve karaciğer (akut faz yanıtı) gibi diğer organlarda, arasında gerçekleşen iletişimi ¹² ve böbreküstü bezleri (stres glukokortikoidler) ^13. Son olarak, in vivo pnömoni modelleri ile ortaya kritik ve klinik son derece alakalı nokta başarılı patojen temizleme konağın başarısı için eşit olmamasıdır. Bir çok durumda, bir overexuberant bağışıklık tepkisi ana ölümüne yol açabilirnedeniyle bile başarılı patojen temizlenmesi ^8,14 karşısında aşırı seyirci akciğer hasarı, için. Bu göz önüne alındığında, patojen açıklık ve immün yanıtın paralel ölçümleri genellikle en bilgilendirici ve hayatta kalma çalışmaları sonunda konağın entegre dayanıklılığını ortaya çıkarmak için gerekli olabilir.

Burada, aspirasyonla murin akciğer, bakterilerin verilmesi için basit ve invazif olmayan bir yöntem tanımlanmıştır. aerosol ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, çalışma personeli solunum maruz düşük potansiyel riski taşıyan akciğerin derinliklerine daha yüksek konsantre edilmiş aşı teslim sağlar ve göz ve üst hava yolu immün tepkileri potansiyel karıştırıcı önler. İntranazal aşı, aynı zamanda merkezi sinir sistemi ⁴ lokal invaziv enfeksiyon olasılığını da dahil olmak üzere, üst solunum yolu enfeksiyonu, potansiyel olarak karıştırıcı bir endişe taşımaktadır ve aynı zamanda akciğer yüksek oranda değişken aşı ile sonuçlandığı bildirilmiştir^5. Peroral veya transkutan rota ya vasıtasıyla entübasyon ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, en az eğitim gerektirir (~ 1 fare başına dakika) en azından ikinci yönteme göre ve, alt morbiditesi daha hızlıdır. Diğer yöntemlerle tarafından paylaşılan bunlardan bazıları - - orofaringeal aspirasyon yönteminin potansiyel dezavantajları doğrudan genel anestezi gereksinimini, (yani, asimetrik ve heterojen) patojen teslim yamalı olasılığını, alt loblarda ¹⁵ baskın enfeksiyon ve yetersizlik dahil tek bir akciğere tek taraflı olarak patojen. Nedeniyle aspirasyon (veriler gösterilmemiştir) sonra akciğerlerde yamalı dağılımı - aerosolleştirme ¹⁵ dışındaki tüm akciğer enfeksiyonu yöntemleri ile karşılaşıldığında bir sonuç - genellikle enfekte olmuş fareler üzerinde tek taraflı akciğer deneyleri yapmazlar. Her iki akciğer ya immün yanıtı değerlendirmek için bir araya lavaj veya toplanmış bakteri kant birlikte nekropsi uygulanırvb.'yi kapsar ve / veya moleküler analizi (örn, gen ifadesi, miyeloperoksidaz deney, sitokin ELISA). Protokol özellikle kritik adımlar adım 1.8 OD ₆₀₀ -confirming şunlardır: in vivo enfeksiyon öncesinde CFU / ml ilişki ve aynı zamanda her deneyde kaplama sayesinde aşı konsantrasyonu teyit; yanı adım 3.6 olarak - şırıngaya iyi hacim getirileri ile hava yolu olmayan bir travmatik lavaj sağlanması.

Oral bitki (yani, polimikrobiyal pnömoni) ile ko-enfeksiyon teorik sorun olmasına rağmen, K ile enfekte edilen farelerin akciğer homojenatlarında polimorfik bakteri kolonileri rastlamadık pneumoniae veya S. pneumoniae. İstenirse bu olasılığı hakkında endişe araştırmacılar için ise, kontrol fareleri, aspire aracın (yani, tampon) maruz kalabilir. (Kalan unaspirated bakterilerin yutma yoluyla) ve mide duvarı bazı kirlenme mümkündür wit olmasına rağmenh biz tarif yöntemi, gastrointestinal klinik belirti veya brüt patoloji üzerinde değişiklik hiç karşılaşmadım. Üstelik bu olasılık aerosol ve burun yöntemleri yaygındır ve hatta intratrakeal aşılama yönteminde öksürük aşağıdaki oluşabilir.

Bazı metodolojik endişeler tüm pnömoni modelleri evrenseldir. Kontrol ve deney fare grupları yaş olarak eşleştirilmiş birbirinden 2-3 hafta içinde ideal olmalıdır. Biz K. patojen temizlenmesi veya hava yolu inflamasyonu olarak açık cinsiyet farklılıkları bulamadı rağmen doğuştan gelen bağışıklık yanıtının cinsiyetler arasında önemli farklar ¹⁶ rapor edilmiştir olarak pneumoniae modeli, fareler, cinsiyet uyumlu olmalıdır. kontrol farelerinin kökeni dikkatli göz önüne alınmalı. Yavru kontroller tam olmayan geri-melezleme, immün hücre popülasyonlarında mikrobiyomları ilgili farklılıklar ve diğer epigenet ticari olarak satın alınan kontroller üzerinde, genel olarak tercih ediliric farklılıklar bağışıklık yanıtını ^17,18 etkileyebilecek tüm olası etmenler vardır. Dikkatli dikkat özgü serotipi verilmelidir ve virülans önemli farklılıklar gibi enfekte bakterinin kültüre öyküsü görülebilir. K. ile deneyimimize dayanarak pneumoniae, biz inokulum bulaşmasını bir dizi kullanarak ilk pilot çalışmalar yapmanızı öneririz (örn yani 500-2.000 CFU) literatürde bildirilen belirli bakteri dozlarda morbidite / mortalite - hatta aynı bakteri serotip ve fare suşu ile - iyi tercüme olmayabilir kişinin kendi laboratuvarında, olası nedeniyle teknik tutarsızlıkların çeşitli. enflamatuar ve konakçı savunma sonuçları kontrol ve deney fareler arasında gruplar arası farklılıkları inokulum bağımlı olabilir. Nedeniyle hayvancılık ve personel lojistik gerçeklerine, sık sık deney grubu başına 5-6 fare ile deneyler. Bu arada CF için yeterli istatistiksel güce sağlamasına rağmenU ve hücre sayımı sonuçları, biz genellikle yeterli güç elde etmek için bu büyüklükte bir veya birkaç kez bir çalışma tekrarlamanız gerekebilir bulabilirsiniz.

Belirli bir deneyde bazı farelerde, kan ve dalak saptanabilir bakteri üremesi 24 saat sonrası enfeksiyon (Şekil 5) karşılaşılabilir. Biz 24 saat saptanabilir ekstrapulmoner yayılması için kinetik eşik yakın olabileceğini göstermek için bu yorumlamak. Kan / dalakta düşük / saptanamaz büyüme görülürse, aynı fare akciğer CFU her zaman teknik hata olasılığını ele muayene edilmelidir (yani, muhtemelen fare doz bir hata gösteren çok düşük / saptanamaz akciğer enfeksiyonu).

Son olarak, farelerde bakteriyel pnömoni orofaringeal aspirasyon dağıtım yöntemi maliyet, eğitim ve ekipman açısından elde etmek nispeten kolaydır sağlam bir tekniktir ve hatta geniş uzmanlık olmadan laboratuarlar için gerçekçidirPulmoner prosedürlerde. Yöntem kolayca konak savunma cevabı alt baş mikrobiyolojik ve immünolojik tahlillere bağlanır ve ayrıca olmayan kostik maruz geniş bir aralığı için, bir akciğer dağıtım yöntemi olarak kullanılabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Klebsiella pneumoniae, serotype 2	ATCC	43816
Tryptic soy broth	Becton Dickenson	211825
Excel Safelet IV Catheters, 18 G x 1 1/4"	Claflin Medical Equipment	MEDC-031122
Hema 3 Solution 1	Fisher	23-122-937
Hema 3 Solution 2	Fisher	23-122-952
Hema 3 Fixative	Fisher	23-122-929
27½ gauge tuberculin syringes	Fisher	14-826-87
Lithium heparin plasma collectors	Fisher	2675187
L-shaped disposable spreaders	Lab Scientific	DSC
1x PBS, pH 7.4	prepared in-house	n/a	Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)
ACK lysis buffer	prepared in-house	n/a	NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4