En ikke-invasiv og Teknisk Non-intensiv metode for induksjon og fenotyping of Experimental bakteriell lungebetennelse hos mus

Summary

Flere metoder er blitt beskrevet i litteraturen for modellering av bakteriell lungebetennelse hos mus. Heri beskriver vi en ikke-invasiv, billig, rask fremgangsmåte for indusering av pneumoni via aspirasjon (dvs. inhalering) av et bakterielt inokulum pipettert over i oropharynx. Nedstrøms metoder for vurdering av lunge medfødte immunrespons er også detaljert.

Abstract

Selv om smittsom lungebetennelse er fortsatt et stort folkehelseproblem, har murine modeller av bakteriell lungebetennelse nylig tilrettelagt betydelige prekliniske fremskritt i vår forståelse av de underliggende cellulære og molekylære patogenesen. In vivo musemodeller fange integrert fysiologi og robusthet i vertens forsvar respons i en måte som ikke er avslørt av alternative, forenklede ex vivo tilnærminger. Flere metoder er blitt beskrevet i litteraturen for intrapulmonal inokulering av bakterier i mus, inkludert aerosolisering, intranasal levering, peroral endotrakeal kanylering under "blind" og visualisert forhold, og transkutan endotrakeal kanylering. Alle metoder har relative fordeler og begrensninger. Heri beskriver vi i detalj en ikke-invasiv, teknisk sett ikke-intensive, billig og hurtig metode for intratrakeal levering av bakterier som involverer aspirasjon (dvs. inhalering) av musenav en infeksiøs inokulum pipettert over i oropharynx mens under generell anestesi. Denne metoden kan benyttes for pulmonal avlevering av et vidt spekter av ikke-kaustiske biologiske og kjemiske midler, og er forholdsvis lett å lære, selv for laboratorier med minimal tidligere erfaring med pulmonal prosedyrer. I tillegg til å beskrive aspirasjonspneumoni metode, tilbyr vi også trinnvise prosedyrer for analysering av påfølgende in vivo lunge medfødte immunrespons av musen, spesielt metoder for å kvantifisere bakteriell klaring og den cellulære immunrespons av den infiserte luftveier. Denne integrerte og enkel tilnærming til lungebetennelse vurderings gir mulighet for hurtig og robust evaluering av effekten av genetiske og miljømessige manipulasjoner på lunge medfødt immunitet.

Introduction

Smittsom lungebetennelse er fortsatt den ledende dødsårsaken fra infeksjon i USA, med litt generell endring i dødelighet i løpet av de siste 40 årene til tross for forbedringer i vaksinering og antibiotika strategier ^1,2. Til tross for mangelen på merkbar framgang på folkehelsenivå, i de senere årene dramatiske fremskritt har blitt gjort i vår forståelse av molekylære og cellulære patogenesen av lungebetennelse, med mange av disse trinnene frem gjort mulig ved bruk av musemodeller av lungebetennelse. Den genetiske tractability av musen, har likheten av murine og humane immunforsvar, og det store utvalget av murine målrettede immunologiske reagenser som har blitt kommersielt tilgjengelig sammen tilrettelagt rask fremgang av feltet.

Musemodeller av bakteriell lungebetennelse beskrevet i litteraturen har generelt grunnlag en av fire tekniske ruter for patogen vaksinasjon: i) forstøvning; ii) intranasal levering; iii) peroral levering; og iv) kirurgisk intratrakeal injeksjon (dvs. trakeotomi) ^3. Alle rutene på infeksjon har fordeler og ulemper ^3. Spesielt relative eksponering av øvre luftveier, potensialet for innblanding av oronasal flora, krav til generell anestesi, variasjon av podestoff levert til distale lunge, lobar fordelingen av de leverte patogener, tekniske krav til kompetanse, og prosessuelle sykelighet varierer mye på tvers av disse tilnærminger.

Vanligvis brukes perorale infeksjon teknikker inkluderer endotrakeal (translaryngeal) kanylering via enten en "blind" (non-visualisert) tilnærming, eller under direkte strupe visualisering ^3-5. Begge metodene, mens robust, krever betydelig trening og også innebære risiko for skade på øvre luftveier. I den foreliggende rapport beskriver vi en teknisk sett ikke-intensive, ikke-invasiv, billig og hurtig metode for peroral smitte, wherved bakterier (Klebsiella pneumoniae i eksempelet som er vist) pipettert over i oropharynx av en bedøvet mus leveres til lungene via aspirasjon (dvs. inhalering). Vi og andre har brukt aspirasjonslungebetennelse teknikken med hell ^6-9. Denne allsidige og lett lært lunge-leveringsmetode kan utvides til levering av mange flere ikke-kaustiske midler til lungene, inkludert cytokiner og andre proteiner, patogen-forbundet molekyler (f.eks lipopolysakkarid), celler (dvs. adoptiv overføring), og giftstoffer (for eksempel bleomycin). I tillegg til å diskutere viktige tekniske hensyn, vi beskriver også en integrert, kvantitativ tilnærming for å vurdere den påfølgende vertsrespons til lungebetennelse, inkludert nedstrøms måling av bakteriell clearance (dvs. kolonidannende enhet [CFU] kvantifisering i lunge og perifere organer) og leukocytter akkumulering i luftrommet.

Protocol

Alle forsøkene ble utført i henhold til dyrevernloven og US Public Health Service politikk på Humane Stell og bruk av forsøksdyr etter gjennomgang av Animal Care og bruk komité NIEHS.

1. Fremstilling av K. pneumoniae Culture

Advarsel: Utfør alle trinnene i et biosikkerhetsnivå 2 (BSL2) hette eller annet BSL2 angitt område og kast avfall per institutt BSL2 retningslinjer.

1. For suspensjon vekst av K. pneumoniae, tine en glyserol lager av bakterier og vaksinere en arbeidskultur ved å overføre 1 ml K. pneumoniae lager til 50 ml tryptisk soyakraft (TSB) i en 500 ml eller større kolbe.
2. Gjør glyserol aksjer ved å legge 900 mL av kultivert log-fase K. pneumoniae til 100 mikroliter sterilt glycerol og frysing ved -20 ° C eller -80 ° C. For langtidslagring, er -80 ° C anbefales.
3. Kultur bakterier fra sTEP 1,1 ved risting kolbe over natten (14-18 timer) ved 37 ° C ved 200-225 rpm.In for å fremme log-fase vekst, fortynnet 1-5 ml av denne kulturen natten over i en kolbe inneholdende 50 ml TSB i morgen og plassere tilbake ved 37 ° C med risting i ~ 2,5 timer.
4. Overføre 1 ml av K. pneumoniae kultur fra det siste trinn i et 1,5 ml rør og sentrifugering ved 7500 x g i 2 min. En hvit pellet skal være synlig. Fjern supernatanten uten å forstyrre pelleten forsiktig resuspender bakterier med pipette i 1 ml sterilt saltvann, og spinne igjen ved 7500 x g i 2 min.
   1. Utfør denne vasketrinn 2x, bringe opp den endelige, vasket pellet i 1 ml sterilt saltvann.
5. Utfør log-messig serielle fortynninger av denne ryddig podestoff. For eksempel legge 400 mL av pode inn 3,6 ml sterilt saltvann serielt å lage en 10 ^-1 -10 ^-9 fortynning serien.
6. Bestem OD ₆₀₀ av vasket K. pneumoniae ved å anbringe 1 ml av01:10 og 1: 100 fortynninger i disponibel kyvetter og måle OD _600, blind først med sterilt saltvann. Mål duplikater for å sikre nøyaktighet. En OD ₆₀₀ på 1,0 tilsvarer omtrent 4-7 x 10 ⁸ CFU / ml. Legg merke til at forholdet mellom OD og CFU / ml er ikke lineær.
   1. Bruk OD ₆₀₀ fra fortynninger å beregne konsentrasjonen av K. pneumoniae, bruk av OD: CFU / ml konvertering ovenfor, og factoring i fortynning.
7. Bruk K. pneumoniae konsentrasjon for å fremstille den ønskede inokulum CFU dose i et <100 pl volum for levering til mus (se nedenfor).
8. Også plate 100 ul av 10 ^-6 -10 ^-9 fortynninger og 100 ul sterilt saltvann ut mot de enkelte tryptisk soya-agar (TSA) -plater ved RT. Inkuber ved 37 ° C over natten og nummerere bakteriekolonier for å beregne nøyaktige konsentrasjon som ble brukt i eksperimentet og for å kontrollere for forurensning.
   MERK: Det faktiske bakteriekonsentrasjon av endelige podestoff kan være ± 500 CFU / ml som spådd av absorbans. Experimenters bør ideelt bekrefte OD _600: CFU / ml forhold i pilotstudier før bruk in vivo i mus, empirisk å justere OD _600: CFU / ml konvertering basert på sin personlig erfaring.

2. Murine intratrakeal (det) Aspirasjon av K. pneumoniae fra orofarynx

1. Sørg for at mus er entydig identifisert ved hale mark, tatovering, eller annen godkjent ID.
2. Utarbeide dosering inokulum av bakterier ved hjelp av P200 pipette før fjerning av mus fra isofluran for å påskynde prosessen. For best resultat med det aspirasjon, må du bruke et volum på <100 ul for å hindre overløp. Heri bruke 2000 CFU / 50 ul K. pneumoniae.
3. Bedøve mus i en klar kammer med isofluran gass (for eksempel 2% isofluran ved strømningshastighet på 1 l / min), eller i henhold til Institutional retningslinjer. Antall mus for å bedøve sammen er bestemt av komfortnivå av experimenter, typisk 1-2 på en gang. Observer pust og bekrefte nivået av anestesi gang dype åndedrag er synlige og 2-3 sek kan telles mellom åndedrag.
   MERK: Hvis det er bekymring for mulige konfunderende effekter av flyktige (inhalert) bedøvelsesmidler, kan anestesi oppnås i stedet med intraperitoneal injeksjon av ketamin / xylazin. Med den ovenfor beskrevne fremgangsmåte, dyp anestesi varer bare noen få minutter. Ved mer langvarig anestesi induseres, bør øyesalve brukes til å hindre okulær uttørking.
4. Når musen er bedøvet, plassere den i en semirecumbent liggende stilling, suspendert av overkjevens fortenner fra en gummistrikk strukket mellom pinnene på en skråstilt pleksiglass bord (figur 1).
5. Trekk mus tungen til siden forsiktig med et par butte ikke-ribbe pinsett og innskudd dose inn i munnhulen med en P200 pipette. Utvis stor forsiktighet for å unngå å fremkalle traumer til enten tungen eller orofarynx.
6. Mens du holder tungen tilbaketrukket, forsiktig tilstoppe nesen med en hansker finger før musen inhalerer. Fortsett å dekke nesen til mus har tatt to eller flere inhalasjoner, og ingen væske er synlig i munnhulen. Dekker nesen bidrar til å sikre at musen skal inhalere bakterier i lungene, som mus er obligate nese breathers.
7. Fjern musen fra inokulering brettet og gå tilbake til buret, å plassere mus på ryggen for å forhindre sengetøy eller rusk fra å blokkere svelget mens musen er utvinne fra anestesi.
8. Når alle mus har blitt dosert og har vekket fra anestesi, huset mus i en bås / rom som inneholder bare mus som er dosert med K. pneumoniae. Monitor mus daglig, inkludert kroppsvekt hvis du går utover 48 timer etter infeksjon.
9. Bruk daglig mos og / eller supplerende varme hvis slik at musene å gå utover 48hr.

3. Bronchoalveolar Lavage Fluid (Balf) Innsamling og analyse

1. Avlive mus per institusjonelle retningslinjer. Her bruker en dødelig injeksjon av 150 mg / kg natriumpentobarbital eller tilsvarende dose av kommersiell eutanasi-løsning, etterfulgt av blodtapping, da dette unngår mulige komplikasjoner til lungene og er forbundet med CO ₂ innånding og cervikal dislokasjon.
2. Posisjon mus på ryggen og sterilisere mus ved å spraye pelsen med 70% etanol særlig over brystet og nakken.
3. Lag en langsgående kutt like under brystbenet, og deretter holder sternum med pinsett, nick membranen, slik at lungen til å falle tilbake i brysthulen. Kuttet opp gjennom brysthulen på hver side av vaskulaturen og deretter opp gjennom halsen, eksponere trakea.
4. Da trakea er omgitt av langsgående muskler på hver side, forsiktig skjære gjennom midten og presse vev til sidene, såDette unngår å kutte den omgivende blodkar, noe som kan innføre blod inn i luftrøret. Hvis blodkar er bretter, rengjør området med gasbind før du får tilgang til tracheal lumen.
5. Bruk kirurgisk saks eller en nål for å nick luftrøret ca ¼ av veien ned fra hodet og sette inn en kanyle festet til en 1 ml sprøyte forhåndslastet med 1 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS) caudally inn i luftrøret. Hvis du bruker mus <8 ukers alder eller kvinner, redusere lavaging volum til 600-800 mL.
6. Skyv volumet i lungene sakte, slik at alle lappene for å blåse opp og trekk deretter volumet ut igjen med sprøyten, gjenta 3x. Hvis PBS kommer ut av neseborene kanylen ikke er blitt skjøvet langt nok inn i luftrøret eller inflasjon skjer for raskt. Alternativt, hvis lungene ikke blåse godt, kanylen har blitt skjøvet for langt inn, så ta ut litt.
7. Samle samlede vasker i en 15 ml tube på is.
8. Snurre rundtluftrom vaskevæske ved 1200 xg i 5 minutter, samle supernatanten til et 1,5 ml rør og fryse ved -80 ° C. Deretter bruker supernatanten (dvs. Balf) for måling av protein, cytokiner, og for forskjellige andre biokjemiske analyser. Pelleten representerer celler fra den bronkoalveolare plass.
9. Hvis røde blodceller (RBC) er tydelig i cellepelleten på grunnlag av farge, for å lyse med 1 ml lyseringsbuffer for ACK 1 min, etterfulgt av tilsetning av 5 ml 1 x PBS stanse reaksjonen lysis og fortynne buffer. Håndter alle prøver likt, enten behandlet eller ikke med ACK lysis buffer.
10. Spin cellene ved 1200 xg i 5 min, dekanter supernatanten, og bringe cellene opp i 1 ml av 1 x PBS.
11. Vortex og telle celler på et hemocytometer for telling av totale luftrommet celler.
12. Basert på tetthet av celler legge ca 80-150 mikroliter (~ 80 mL for en infisert mus og ~ 150 for en naiv mus) til et lysbilde kammer på en cytospin sentrifuge. spin celles på objektglass for påfølgende flekker å bestemme celledifferensial populasjoner.
13. Tillat celler til tørk på lysbilder over natten. Flekke celler med tri-flekken (f.eks Hema 3 [se tabell]) ved å dyppe lysbildene 7 ganger i fiksativ, 9 ganger i flekken 1 og 7 ganger i flekken 2 (ingen skyllinger mellom flekker), og la den tørke. Etter flekken har tørket, dekkglass og manuelt telle differensialer av mikroskop. Vanligvis er nøytrofile granulocytter og monocytter / makrofager lett preges av deres størrelse og kjernefysisk morfologi.

4. Fastsettelse bakteriemengde i lunge og perifert vev

1. Før du begynner: forberede fortynningsrør med 900 mL av 1x PBS for lunge og milt og 90 mL av 1x PBS for blod. Merk plater for dyrking bakterier og satt ved romtemperatur; Derfor vil når vev er samlet tid minimaliseres mellom homogenisering og platekledning for bakterievekst.
   Merk: På grunn av den heterogene deponeressjon av bakterier i lungene som kan oppstå med aspirasjon, anbefales det at de enkelte mus anvendes for analyse av enten total luftvei cellularitet eller total (bi) lunge bakteriebelastningen.
2. Avlive musen som per trinn 3,1 og deretter samle blod fra venstre hjertekammer, plassere i en heparinisert rør for å unngå blodpropp. Fjern alle lungelapper og plasseres i et 15 ml rør inneholdende 5 ml av 1 x PBS, etterfulgt av fjerning av milten og plassering i 2 ml av 1 x PBS. Plasser rørene på is. Vær nøye med å rengjøre instrumenter med etanol mellom hver vev / mus.
3. Homogenisere vev på is, helst med engangs homogenizers som kan endres mellom hver prøve. Engangs homogenisator tips kan autoklaveres for gjenbruk mellom eksperimenter.
4. Når vevet har blitt homogenisert, utføre serielle fortynninger og plate. Plate prøver av et gitt vev / fortynning i duplikat på en enkelt plate TSA ved å tegne en delelinje på plast. Plating og dining forslag er vist nedenfor (i alle tilfeller er 10 ul prøve spredt på plate) og er basert på en 24 timer etter infeksjon obduksjon. Ved analyse av 48-72 timers prøver, kan ha behov for et større antall fortynninger som skal bli belagt på grunn av økt bakteriebelastning ved senere tidspunkter.
   1. For Blood - fortynn 1:10 ved tilsetning av 10 ul blod inn i 90 ul steril 1 x PBS. Plate ryddig og 1:10 fortynnede prøver i duplikat. Når blodet har blitt belagt, spinne gjenværende blod ved 9300 xg i 10 min for å hente ut plasma for måling av cytokiner og chemokiner.
   2. For Lung - fortynn 1:10 - 1: 100 ved tilsetning av 100 ul av homogeniserte lunge inn i 900 ul steril 1 x PBS serielt. Plate ryddig homogenat og alle fortynninger i duplikat.
   3. For Spleen - fortynne 1: 10-1: 100 ved tilsetning av 100 ul av homogenisert milt inn i 900 ul steril 1 x PBS serielt. Plate ryddig homogenat og begge fortynninger i duplikat.
5. Tillat spredt prøver å tørke raskt. Snu TSA plater og plasser i en statisk 37 ° C inkubator over natten.
6. Bestem antall koloniserende bakterier ved å ta gjennomsnittet av bakterielle kolonier fra begge sider av platen, og fra hver fortynning. Faktor i de innledende fortynninger av 5 ml for lunge og 2 ml for milten for å bestemme de totale vev CFU.

Representative Results

C57BL / 6-mus ble infisert med 2000 CFU av K. pneumoniae 43816 (serotype 2) via orofaryngeal aspirasjonsfaren. Ved denne dosen musene begynner vanligvis å vise kliniske symptomer 12-24 timer etter infeksjon, inkludert letargi, rusket pels, og vekttap på 5-10% (figur 2A). Innen 48-72 timer etter infeksjon, mange av mus viser symptomer på sykdom og sykelighet som vanligvis innledes med et gjennomsnitt på 20% vekttap og resultater i hunched stillinger med redusert aktivitet og redusert respons på stimulering. Studier av en lengre varighet kan kreve en lavere dose av K. pneumoniae. Infeksjon med 500 CFU av K. pneumoniae resulterer i mildere sykdom topp 3-5 d post-infeksjon som kjennetegnes ved et vekttap på 10-15% med utvinning og vektøkning som begynner ved dag 5-6 (figur 2B). Kroppsvekt er ofte forutsigbar for å overleve, med et vekttap på 20% sjeldnely i forbindelse med utvinning.

Den ultimate suksess for vertsrespons kan best indikert av overlevelse studier, hvor mus er overvåket i 10-14 dager, og avlives (per institusjonelt vedtatte retningslinjer) for tegn på moribundity, for eksempel minimal respons på taktil stimulering og / eller vekttap > 20%. Overlevelses studier er ofte mest effektiv hvis man retter seg mot en infiserer inokulum som er tilnærmet 50% dødelighet (dvs. LD50 dose) i kontrollgruppen (figur 2C). En LD50 dose muliggjør påvisning av både forholdsvis øket og minsket overlevelse i forsøksgruppen. Differensial overlevelse kan være inokulum-avhengig, så mange infeksjoner doser kan noen ganger være nødvendig for å detektere en endret fenotype vertens forsvar.

Nedre luftveisinfeksjon med K. pneumoniae er preget av en robust tilstrømningen av leukocytes inn i luftveiene. Immunceller opplisting og differensiering ved farging av BAL cellepellet viser en økning i luftveisimmunceller i løpet av 6 timer etter infeksjon (figur 3A). Cellularitet topper etter 24 timer, med nøytrofiler som den dominerende immunceller i luftveiene (figur 3A-B). Begge kjønn av C57BL / 6 mus viser tilsvarende luftveis leukocytose i respons til K. pneumoniae på 24 timer og 48 timer etter infeksjon (Tall 3C-D).

Bakteriell lungebetennelse induserer lokal (intrapulmonal) og systemiske proinflammatoriske mediatorer inkludert cytokiner og chemokiner. Lokale cytokin / kjemokin nivåer kan påvises i Balf med en konvensjonell ELISA eller ved hjelp av et multipleks-system cytokin. Cytokiner, inkludert IL-6, RANTES, TNFa, G-CSF, og andre er detekterbar ved både 24 timer og 48 timer etter infeksjon med K. pneumoniae og gi innsikt i LUNg mikromiljøet og rekruttering av immunceller (figur 4).

Innsamling av lunge, blod, og perifert vev (er), slik som milt muliggjør kvantifisering av vev bakteriemengde, gir innsikt i både lokale lunge klarering fra mikrober, så vel som ekstrapulmonær spredning av bakterier. Seriell fortynning og dyrkning av lungen viser utvidelsen av mikrobiell belastning mellom 24 timer og 48 timer etter infeksjon (figur 5A). Lignende funn er kjent i blodet og milt (Figur 5B - C). Av notatet, kan en bimodal bakteriemengden noteres i blod og milt på 24 timer etter infeksjon, med noen mus har høy grad av bakteriespredning, og andre, selv i ansiktet av høyverdig bakteriemengden i lungene, viser ingen detekterbare bakterier i blod eller milt. K. pneumoniae bakteriemengde i C57BL / 6 mus ikke gender-spesifikke, som menn og kvinner viser tilsvarende byrde i ulike vev etter vaksinasjon (figur 5D-F).

Figur 1:. Prosedyre Board for aspirasjonspneumoni i Mus studere mus er plassert, hodet opp og tilbake til styret (dvs. semirecumbent), suspendert av fortenner fra en gummistrikk strukket mellom to knagger montert på en pleksiglass eller lignende bord.

Figur 2: Vurdering av Vekttap og sykelighet Etter aspirasjon av K. pneumoniae. C57BL / 6 mus (N = 10-20 per tilstand) ble smittet av aspirasjon av K. pneumoniae 43816 (serotype 2). (En) Daglig vekter, indeksert til pre-infeksjon vekt, fra mus infisert med 2000 CFU. I denne studien, ingen mus overlevde forbi dag 6. (B) Infeksjon med 500 CFU resulterer i daglige vekttapet gjennom dag 4 etter infeksjon med en overgang mot vektøkning som begynner ved dag 5. (C) Overlevelseskurver fra 150 CFU, 500 CFU, og 2000 kolonidannende enhet (CFU) infeksjoner, noe som indikerer at 500 CFU tilnærmet LD50. Dataene i paneler A og B er gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Infeksjon med K. pneumoniae Resultater i Tidsavhengig Airway Leukocytose. C57BL / 6 mus ble gitt intrapulmonal infeksjon med 2000 CFU av K. lungebetennelsee. (A) Bestemmelse av totale leukocytter (WBC), nøytrofile celler (PMN) og makrofager (Mii) i luftrommet fluid ved forskjellige tidspunkter etter infeksjon. (B) Ved farging, PMN og makrofager kan lett identifiseres ved kjerne morfologi og størrelse i Cytospin felt og telles. (C - D) infeksjon hos menn og kvinner resulterer i tilsvarende antall rekrutterte betennelsesceller på 24 timer og 48 timer etter infeksjon. Data utlede 6-25 / mus per tilstand og er gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Cytokiner og Kjemokiner blir indusert i luftrommet i Response til bakteriell infeksjon C57BL / 6 mus ble gitt intrapulmon.ær infeksjon med 2000 CFU av K. pneumoniae. Balf cytokiner og chemokiner ble kvantifisert ved multiplex analyse på 24 timer og 48 timer etter infeksjon. Data utlede 5-15 mus / tilstand og er gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5:. Tidsavhengig Utvidelse av bakteriemengden i lunge og perifere vev under Lungebetennelse C57BL / 6 mus ble gitt intrapulmonal infeksjon med 2000 CFU av K. pneumoniae. (A) Lunge parenchymal bakteriemengden ble målt ved utsåing av seriefortynninger av lungehomogenat på TSA 24 timer og 48 timer etter infeksjon. (B) blodbanen og (C) miltbakteriemengden ble lignende kvantifisert. ( F) Bakteriell byrde i ulike vev er tilsvarende i mannlige og kvinnelige mus etter induksjon av lungebetennelse. Data stammer fra 10 mus / tilstand og er gjennomsnitt ± SEM. Null verdier i paneler B, C, E og F ble tildelt en verdi på 0,1 for å tillate graf på en log skala. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Murine modeller av bakteriell lungebetennelse, inngått samarbeid med genet targeting og in vivo biologiske og farmakologiske intervensjoner, har gitt kritisk innsikt i lunge vertens forsvar respons. Store fremskritt er gjort spesielt i vår forståelse av kjemokiner og adhesjonsmolekyler som styrer rekruttering av nøytrofile til den infiserte luftrom ^10,11. In vivo modeller av lungebetennelse, i motsetning til cellebaserte eller alternative tilnærminger, har også gitt viktige innsikt i endokrine kommunikasjon som skjer mellom den infiserte lunger og andre organer, slik som leveren (akutt fase respons) ¹² og binyrene (spennings glukokortikoider) ^13. Til slutt, en kritisk og klinisk svært relevant punkt som er vist ved in vivo-pneumoni modeller er at vellykket patogen clearance er ikke ensbetydende med å lykkes i verten. I mange tilfeller kan en overexuberant immunrespons føre til døden av vertenpå grunn av overdreven bystander lungeskade, selv i møte med vellykket patogen clearance ^8,14. Gitt dette, parallelle målinger av patogen clearance og av immunresponsen er generelt mest informative, og overlevelses studier kan til slutt være nødvendig for å vise den integrerte elastisiteten av verten.

Heri har vi beskrevet en enkel og ikke-invasiv metode for levering av bakterier til den murine lunge via aspirasjon. Sammenlignet med forstøvning, bærer denne metoden lavere potensiell risiko for luftveis eksponering av studie personell, sørger for høyere konsentrert podestoff levering til den dype lungen, og unngår potensielle konfunderende av okulære og øvre luftveisimmunresponser. Intranasal inokulering bærer også potensielt samvirkende opptatt av øvre luftveisinfeksjon, inkludert muligheten for lokalt invasive infeksjoner i sentralnervesystemet ^4, og har også blitt rapportert å resultere i svært variabel inokula i lungen^5. Sammenlignet med endotracheal intubasjon via enten peroral eller transkutan vei, krever denne metoden minimal opplæring, er hurtigere (ca. 1 min per mus), og, i det minste i forhold til den sistnevnte metode, har lavere morbiditet. Mulige ulemper ved i munnhule og svelg aspirasjon metode - noen som deles av andre metoder - omfatter behovet for generell anestesi, er sannsynligheten for usammenhengende (dvs. asymmetrisk og heterogen) patogen levering, overveiende infeksjon av de nedre fliker ^15, og manglende evne til direkte patogen ensidig til en enkelt lunge. På grunn av usammenhengende distribusjon i lungene etter aspirasjon (data ikke vist) - et resultat som er oppstått med alle andre enn forstøvning ¹⁵ lungeinfeksjon metoder - vi vanligvis ikke utfører ensidig lunge analyser på infiserte mus. Begge lungene er enten lavaged sammen for å vurdere immunresponsen, eller obdusert sammen for sammenslått bakteriell Quant-utfelling og / eller molekylær analyse (f.eks genekspresjon, myeloperoksidase assay, ELISA cytokin). Spesielt kritiske trinn i protokollen er steg 1,8 -confirming OD _600: CFU / ml forhold før in vivo infeksjon og også bekrefter pode konsentrasjonen gjennom platekledning i hvert eksperiment; så vel som i trinn 3,6 - å sikre en ikke-traumatisk lavage av luftveiene med gode volumet tilbake inn i sprøyten.

Selv om co-infeksjon med oral flora (dvs. blandingsflora bestående lungebetennelse) er en teoretisk mulighet, har vi ikke møtt polymorfe bakteriekolonier i lungehomogenater av mus infisert med K. pneumoniae eller S. pneumoniae. For søkere opptatt av denne mulighet, men kontrollmusene kan bli utsatt for suget av kjøretøy (dvs. buffer), om ønskelig. Selv om noen forurensning av magen lumen (gjennom svelging av rest uaspirerte bakterier) er mulig viddh metoden vi beskriver, har vi aldri møtt gastrointestinale kliniske tegn eller endringer på brutto patologi. Dessuten er denne mulighet felles for aerosoliserings og intranasale metoder, og kan til og med forekomme etter hoste i intratrakeal inokulasjon metoden.

Noen metodiske bekymringer er universelle for alle lungebetennelse modeller. Kontroll og eksperimentell mus grupper bør være alderstilpasset helst innen 2-3 uker etter hverandre. Selv om vi ikke har funnet åpenbare kjønnsforskjeller i patogen clearance eller luftveisbetennelse i K. pneumoniae modell, bør mus være kjønns matchet, som signifikante forskjeller mellom kjønnene i det medfødte immunrespons er rapportert ^16. Nøye hensyn til opprinnelsen til kontroll mus bør gis. Kull kontrollene er generelt å foretrekke fremfor kommersielt kjøpt kontroller som ufullstendig tilbakekryssing, mikrobiomer relaterte forskjeller i immuncellepopulasjoner, og andre epigenetic forskjeller er alle mulige confounders som kan påvirke immunresponsen ^17,18. Nøye oppmerksomhet bør gis til de spesifikke serotype og dyrkning av historien til den infiserende bakterie som betydelige forskjeller i virulens kan sees. Basert på vår erfaring med K. pneumoniae, anbefaler vi å utføre innledende pilotstudier ved hjelp av en rekke infiserer podestoffer (f.eks 500-2,000 CFU) som sykelighet / dødelighet av spesifikke bakterie doser er rapportert i litteraturen - selv med den samme bakterie serotype og mus belastning - kan ikke oversette godt til ens eget laboratorium, trolig på grunn av en rekke tekniske avvik. Inter-gruppeforskjeller mellom kontroll og eksperimentelle mus i inflammatorisk og vertsforsvars utfall kan være podestoff avhengig. På grunn av logistiske realitetene i husdyravl og bemanning, vi gjennomfører ofte eksperimenter med 5-6 mus per forsøksgruppe. Selv om dette av og til gir tilstrekkelig statistisk styrke for CFU og celler utfall, finner vi at vi ofte må gjenta en studie av denne størrelsen en eller flere ganger for å oppnå tilstrekkelig effekt.

For enkelte mus i en gitt eksperiment, kan ingen påvisbar bakterievekst i blod og milt være oppstått 24 timer etter infeksjon (figur 5). Vi tolker dette som tyder på at 24-timers kan være nær den kinetiske terskelen for påviselig ekstrapulmonær formidling. Hvis lav / ikke-detekterbar vekst i blod / milt observeres, bør lunge CFU fra den samme mus alltid bli undersøkt for å undersøke muligheten av en teknisk feil (dvs. meget lav / ikke-detekterbar lungeinfeksjon muligens indikerer en feil i dosering av mus).

Til slutt, er det orofaryngeal aspirasjon leveringsmåte for bakteriell lungebetennelse hos mus en robust teknikk som er relativt lett å skaffe fra en kostnad, trening og utstyr ståsted, og er realistisk selv for laboratorier uten omfattende kompetansei lunge prosedyrer. Fremgangsmåten er lett koplet til nedstrømsmikrobiologiske og immunologiske analyser av vertens forsvar respons, og kan dessuten brukes som en lunge leveringsmåte for et vidt spekter av ikke-kaustiske eksponeringer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Klebsiella pneumoniae, serotype 2	ATCC	43816
Tryptic soy broth	Becton Dickenson	211825
Excel Safelet IV Catheters, 18 G x 1 1/4"	Claflin Medical Equipment	MEDC-031122
Hema 3 Solution 1	Fisher	23-122-937
Hema 3 Solution 2	Fisher	23-122-952
Hema 3 Fixative	Fisher	23-122-929
27½ gauge tuberculin syringes	Fisher	14-826-87
Lithium heparin plasma collectors	Fisher	2675187
L-shaped disposable spreaders	Lab Scientific	DSC
1x PBS, pH 7.4	prepared in-house	n/a	Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)
ACK lysis buffer	prepared in-house	n/a	NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4