Summary
In dit werk rapporteren we een nieuwe methode om te studeren met behulp van een conductimetric biosensor gebaseerd op de technologie van de β-lactamase hybride eiwit-eiwitinteractie. Deze methode is gebaseerd op de release van protonen op hydrolyse van β-lactamen.
Abstract
Biosensoren zijn steeds belangrijk en toegepast op verschillende gebieden zoals pathogen detectie, moleculaire diagnostiek, milieumonitoring en veiligheid controle op levensmiddelen. In dit verband, we gebruikten β-lactamases als efficiënte verslaggever enzymen in verschillende eiwit-eiwit interactie studies. Bovendien is hun vermogen om te aanvaarden sterk inlassingen uit peptiden of gestructureerde eiwitten/domeinen stimuleert het gebruik van deze enzymen te genereren chimeer eiwitten. In een recente studie, wij in de Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase een enkel domein antilichamen-fragment ingevoegd. Deze kleine domeinen, een afkorting voor nanobodies, worden gedefinieerd als de antigeen-bindende domeinen van één keten antilichamen van kameelachtigen. Als gemeenschappelijke dubbele keten antilichamen tonen ze hoog affiniteiten en specifieke kenmerken van hun doelstellingen. De daaruit resulterende chimeer eiwitten tentoongesteld een hoge affiniteit tegen haar doelstelling met behoud van de β-lactamase activiteit. Dit suggereert dat de nanobody en β-lactamase wordt blijven functioneren. In het huidige werk rapporteren we een gedetailleerd protocol dat β-lactamase onze hybridesysteem aan de biosensor technologie combineert. De specifieke binding van de nanobody aan zijn doel kan worden opgespoord dankzij een conductimetric meting van de protonen uitgebracht door de katalytische activiteit van het enzym.
Introduction
Biosensoren zijn analytische apparaten die een bio-moleculaire interactie met fysische of chemische signalering apparaten die worden aangeduid als omvormers1combineren. De opgenomen signalen kunnen dan worden geïnterpreteerd en omgezet voor het controleren van de interacties tussen de geïmmobiliseerdet en gratis partners. Allermeest naar de biosensoren wordt gekenmerkt door het gebruik van een antilichaam te detecteren analyten zoals hormonen of andere ziekteverwekker markeringen2. Verschillende sensor indelingen kunnen worden gebruikt en massa-gebaseerde, magnetische, optische of elektrochemische biosensoren omvatten. De laatste behoren tot de meest gebruikte sensoren, en werkt door het omzetten van een bindende evenement in een elektrisch signaal. De voorstellingen en de gevoeligheden van alle antilichamen gebaseerde biosensoren zijn sterk afhankelijk van in wezen twee parameters: i) de kwaliteit van het antilichaam en ii) de eigenschappen van het systeem dat wordt gebruikt voor het genereren van het signaal-2.
Antilichamen zijn hoge-moleculaire massa dimeric eiwitten (150 – 160 kDa) dat uit twee zware kettingen en twee lichte kettingen bestaat. De interactie tussen de lichte en zware kettingen is meestal gestabiliseerd door hydrofobe interacties, alsmede een geconserveerde Zwavelbrug. Elke keten een variabele domein bevat dat met het antigeen in wezen via drie hypervariable regio's met de naam aanvullende bepaling van regio's (CDR1-2-3 samenwerkt). Ondanks de vele ontwikkelingen op het gebied, de grootschalige uitdrukking van full-length antilichamen met goedkope expressiesystemen (bijvoorbeeld E. coli) leidt vaak tot de productie van instabiele en geaggregeerde eiwitten. Dit is de reden waarom diverse fragmenten van antilichaam hebben ontworpen, zoals één-keten variabele fragmenten3 (ScFvs ≈ 25 kDa). Zij bestaan uit de veranderlijke domeinen van respectievelijk één zware en een lichte kettingen die covalent gekoppeld zijn door een reeks synthetische aminozuur. Echter deze fragmenten vaak weer een slechte stabiliteit en hebben de neiging om statistische, aangezien zij een groot deel van hun hydrofobe regio's het oplosmiddel4blootstellen. In dit verband één keten kameelachtige antilichaam fragmenten, hierna nanobodies of VHHs, lijken te zijn uitstekende alternatieven voor ScFvs. Deze domeinen komen overeen met de variabele domeinen van kameelachtige single-keten antilichamen. In tegenstelling tot conventionele antilichamen, kameelachtige antilichamen zijn verstoken van lichte kettingen en alleen bevatten twee zware kettingen5. Daarom zijn nanobodies de kleinste monomeer antilichaam fragmenten (12 kDa) kunnen binden aan een antigeen met een vergelijkbaar met die van conventionele antilichamen6affiniteit. Bovendien, bieden ze verbeterde stabiliteit en oplosbaarheid in vergelijking met andere full-length antilichamen of fragmenten van antilichaam. Ten slotte, hun kleine maten en hun uitgebreide CDR3 loops laten herkennen cryptische epitopes en een binding met het enzym actieve sites7,8. Tegenwoordig, deze domeinen zijn veel aandacht krijgt en aan de biosensor technologie zijn gecombineerd. Bijvoorbeeld, Huang et al.. hebben ontwikkeld een nanobody gebaseerde biosensor voor de detectie en kwantificering van menselijke prostaat-specifiek antigen (PSA)9.
Zoals vermeld hierboven is een belangrijke parameter in biosensor testen de efficiëntie van het systeem gebruikt voor het genereren van het elektrische signaal. Om deze reden, enzym gebaseerde elektrochemische biosensoren steeds aandacht hebben getrokken en hebben grote schaal gebruikt voor diverse toepassingen zoals gezondheidszorg, voedselveiligheid en milieubewaking. Deze biosensoren vertrouwen op de katalytische hydrolyse van een substraat door een enzym voor het genereren van het elektrische signaal. In dit verband werden β-lactamases meer specifieke, gevoeliger en gemakkelijker te implementeren dan vele andere enzymen zoals alkalisch fosfatase of horseradish peroxidase10experimenteel aangetoond. Β-lactamases zijn enzymen die verantwoordelijk voor bacteriële resistentie tegen β-lactam antibiotica zijn door hydrolyseerd hen. Ze zijn monomeer, zeer stabiel, efficiënt, en van klein formaat. Domein/peptide invoegingen in β-lactamases genereren bovendien, bi-functionele chimeer eiwitten die te zien waren als efficiënte tools aan studie eiwit-ligand interacties. Inderdaad, recente studies hebben aangetoond dat het invoegen van variabele fragmenten van antilichaam in de TEM1 β-lactamase resultaten in een chimeer eiwit dat blijft kunnen binden met hoge affiniteit aan haar doel-antigeen. Interessant, bleek de antigeen-bindende ertoe allosteric verordening van11,12van de katalytische activiteit van de TEM1. Bovendien toonden we in verschillende studies dat eiwit domein inbrengen in een tolerante lus van de Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase functionele chimeer proteïnen toe die geschikt zijn produceert voor het controleren van de eiwit-ligand interacties13 ,14. We onlangs een nanobody, met de naam cAb-Lys3, in deze site tolerante invoeging van BlaP15ingevoegd. Deze nanobody werd getoond om te binden aan de kip-ei-wit lysozym (HEWL) en voor de remming van de enzymatische activiteit16. We toonden dat de gegenereerde hybride eiwit, genaamd BlaP-cAb-Lys3, een hoge specificiteit behouden / affiniteit tegen HEWL terwijl de β-lactamase activiteit bleef ongewijzigd. Dan zijn we met succes de hybride β-lactamase technologie om een elektrochemische biosensor gecombineerd en toonde aan dat de hoeveelheid gegenereerde elektrische signaal afhankelijk van de interactie tussen BlaP-cAb-Lys3 en HEWL op een elektrode geïmmobiliseerd was. Inderdaad, hydrolyse van β-lactam antibiotica door BlaP induceert een proton-release die kan worden omgezet in een kwantitatieve elektrisch signaal. Deze combinatie van de hybride β-lactamase technologie met een elektrochemische biosensor is snel, gevoelige, kwantitatieve en kunt real-time meting van het gegenereerde signaal. Deze methodologie wordt hierin beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van de monsters eiwitten
- Produceren en te zuiveren van de hybride proteïne BlaP-cAb-Lys3 zoals gemeld in onze vorige studie15. Bewaar het eiwit in 50 mM fosfaatbuffer pH 7.4 met de volgende samenstelling: 8 g NaCl, KCl 0.2 g, 1,44 g nb2HPO4 en 0,24 g. van KH2PO4 opgelost in 800 mL gedestilleerd water Fix de pH van de oplossing aan 7.4 vóór aanpassing van het uiteindelijke volume van de oplossing op 1 steriliseren L. Filter de eiwit-oplossing.
- Voorbereiden van een stamoplossing van kip ei wit lysozym (HEWL). Los 100 mg (40.000 eenheden/mg) commercieel gekochte HEWL in 10 mL fosfaat buffer zoutoplossing (PBS Zie stap 2.1.1). De eiwit-oplossing steriliseren door filtratie met behulp van filters met een 0,22 μm cutoff.
2. biosensor Assays
-
Bereiding van de oplossing en buffer
- 50 mM PBS voor te bereiden door het oplossen van 8 g NaCl, KCl 0.2 g, 1,44 g nb2HPO4en 0,24 g van KH2PO4 in 800 mL gedestilleerd water. Op een pH van 7,4 met 1 N HCl of 1 N NaOH aanpassen vooraleer u het volume van de oplossing op 1 L. Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C.
- Bereid een oplossing van verzadiging/blokkeren door ontbinding van de 3 g van caseïne hydrolysaat in 100 mL PBS bereid zoals hierboven beschreven (zie stap 2.1.1). Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C.
- Bereid een bindende oplossing door ontbinding van 1 g van caseïne hydrolysaat in 100 mL PBS bereid zoals hierboven beschreven (zie stap 2.1.1). Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C.
- Bereid een wassen-oplossing (0,1% Tween - PBS) door toevoeging van 100 μl van tween-20 (100%) in 100 mL PBS bereid zoals hierboven beschreven (zie stap 2.1.1). Bewaren bij 4 ° C.
- Bereid de oplossing van een elektrode voorbereiding (1% Triton X-100-PBS) door toevoeging van 1 mL van Triton X-100 (100%) in 100 mL PBS bereid zoals hierboven beschreven (zie stap 2.1.1). Bewaren bij 4 ° C.
- Bereid een elektrode regeneratie-oplossing (3.5 M KCl) door ontbinding van 26 g van KCl in gedestilleerd water tot een eindvolume 100 mL. Filter gesteriliseerd en winkel bij 4 ° C.
- Bereid een 5 mM NaCl oplossing door ontbinding 0.29 g NaCl in gedestilleerd water tot een eindvolume van 1 L. Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C. Vervolgens bereid een detectie-oplossing (4 mM Benzylpenicilline) door ontbinding 26.7 mg Benzylpenicilline in 20 mL 5 mM NaCl-oplossing. Filter steriliseren en opgeslagen bij-20 ° C.
-
Voorbereiding van de sensor en regeneratie
Opmerking: De polyaniline bekleed sensor chips werden ontwikkeld en vriendelijk geleverd door Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus en Prof. Y. Glupczynski (Katholieke Universiteit van Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). De beschrijving van de sensor, alsmede de polyaniline electro-polymerisatie protocollen die worden gebruikt voor het synthetiseren van deze sensoren worden gedetailleerd beschreven in hun eerdere werk17. Kortom, dit systeem maakt gebruik van herbruikbare sensoren van acht afzonderlijke chips die werden vervaardigd door klassieke printed circuit board (PCB) technieken. Individuele fiches zijn samengesteld uit drie elektrode ronde vlekken. De bovenste is de elektrode werken op welke polyaniline was electro-gesynthetiseerd. De middelste is de referentie-elektrode en de elektrode van de bodem vormt de teller-elektrode. Zowel de verwijzing als de elektroden van de teller zijn matiemaatschappij met behulp van solide Ag/AgCl amalgaam bovenop de koolstof laag.- Voeren 3 wasbeurten van de elektroden door dompelen de tips in wells van een 96-wells-plaat met 300 µL per putje van elektrode voorbereiding oplossing (1% Triton X-100-PBS, zie stap 2.1.5.). Voer elke wassen voor 2 min met zacht mengen bij kamertemperatuur.
- Spoel de elektroden door dompelen de tips in wells van een 96-wells-plaat met 300 µL per putje gedestilleerd water gedurende 2 minuten met zacht mengen bij kamertemperatuur.
- Het regenereren van de elektroden door dompelen de tips in wells van een 96-wells-plaat met 300 µL per putje van regeneratie oplossing (3.5 M KCl, zie stap 2.1.6) overnachting bij 4 ° C of 1 uur bij kamertemperatuur.
- Voeren 3 wasbeurten van de elektroden door dompelen de tips in wells van een 96-wells-plaat met 300 µL per putje fosfaat buffer zoutoplossing (zie stap 2.1.1.). Voer elke wassen voor 2 minuten met zacht mengen bij kamertemperatuur.
-
Bindende bepaling uitgevoerd op de sensor
- Jas HEWL op het oppervlak van de PANI (polyaniline) van de elektrode door nederlegging van een daling van de 15 µL van 40 µg/mL HEWL bereid in PBS op het oppervlak van de elektrode. Na een nacht bebroeden bij 4 ° C of 1 uur bij kamertemperatuur.
- Uitvoeren van drie wasbeurten van de elektroden met fosfaat buffer saline (zie stap 2.1.1) door dompelen de delen van de elektrode van de sensor chips in wells van een 96-wells-plaat met 300 µL per putje fosfaat buffer zoutoplossing. Voer elke wassen voor 2 min met zacht mengen bij kamertemperatuur.
- Verzadigen de elektroden door het toevoegen van een daling van de 50 µL van de blokkerende oplossing (zie stap 2.1.2) op het oppervlak van de elektrode. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Vervolgens wassen drie keer zoals beschreven in de vorige stap (zie stap 2.3.2).
- Verdun de oplossing BlaP-cAb-Lys3 naar 20 µg/mL in bindende oplossing (zie stap 2.1.3) en een daling van de 15 µL van deze verdunde oplossing op de elektroden van toepassing. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na de antigeen-nanobody reactie, wassen drie keer zoals beschreven in de vorige stap met behulp van de wash-oplossing (zie stap 2.1.4). Spoel de elektrode keer met PBS (zie stap 2.1.1).
- Sluit voor de detectie, de spaander van de sensor via het koper-circuit deel aan een digitale multimeter. Vervolgens, het starten van de reactie van de sensor door een daling van de 50 µL van detectie oplossing toe te passen (zie stap 2.1.7) op de positieve elektroden en een daling van de 50 µL van NaCl 5 mM oplossing op de negatieve elektroden (zie stap 2.1.7) toe te passen. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De huidgeleiding controleren met een digitale multimeter.
Opmerking: De multimeter werd verzorgd door Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus en Prof. Y. Glupczynski (Katholieke Universiteit van Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. Deze potentiostaat is computergestuurde via een USB-poort en analyseert de acht verschillende chips van de sensor tegelijk. De software gemaakt door Yunus en collega's17 creëert een real-time plot die de metingen van het geleidingsvermogen verschil tussen de elektroden van de referentie- en monster tegen de klok vertegenwoordigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Design en engineering van het chimeer eiwit BlaP-cAb-Lys3
Figuur 1 geeft het inbrengen van cAb-Lys3 in een tolerante lus van de BalP klasse A β-lactamase van Bacillus licheniformis. De invoegpositie werd uitgevoerd tussen residuen van Asp198 en Lys199. Een trombine breukzijde geïntroduceerd aan weerskanten van cAb-Lys3. Cellen getransformeerd met een constitutief expressie plasmide codering het chimeer BlaP-cAb-Lys3-eiwit waren in staat om te groeien in aanwezigheid van een kleine concentratie van ampicilline. Dit resultaat geeft aan dat de hybride β-lactamase oplosbaar, correct gevouwen en met succes kan worden uitgescheiden in de periplasmatische ruimte van de bacteriën waar het efficiënt voor resistentie tegen ampicilline zorgen kan. We verder de bifunctionality van onze chimeer eiwit geanalyseerd. Zoals gemeld in onze vorige studies, onze gegevens is gebleken dat de β-lactamase evenals de cAb-Lys3 wordt van het chimeer eiwit hun biologische activiteit15 behouden.
Conductimetric biosensor assay
De sensor chips gebruikt voor deze test is afgebeeld in figuur 2. De sensoren gebruikt voor deze experimenten bevatten 8 chips. Elke chip bevat drie elektroden: één werkende elektrode, één contra elektrode en een referentie-elektrode. Deze 8 chips worden georganiseerd als 4 paren in de sensor. Voor elk paar, een van de chips aangeduid met "-" komt overeen met een negatieve controle, overwegende dat de chip met het label "+" komt met het onderzochte monster overeen.
Figuur 3 de schematische beschrijving vertegenwoordigt van de experimentele opstelling gebruikt in dit werk, dat de hybride β-lactamase technologie om een potentiometrische biosensor combineert. In deze opstelling twee elektroden worden gebruikt: i) een referentie-elektrode en ii) een polyaniline (PANI) beklede elektrode. HEWL is aan de PANI beklede elektrode geadsorbeerde zoals gemeld in andere studies18,19. Na voldoende wasbeurten, BlaP-cAb-Lys3 (voor "+" aangeduid chips) of BlaP zonder ingevoegde nanobody (voor "-" aangeduid chips) worden toegepast op de elektroden. Na de toevoeging van β-lactam-antibioticum (Benzylpenicilline) op de elektroden, veranderingen in de geleidbaarheid van de elektrode worden gemeten. Inderdaad, β-lactam-antibioticum hydrolyse door β-lactamases genereert een release van protonen; waarvan werd aangetoond dat het maken van belangrijke veranderingen in het geleidingsvermogen van de elektrode met een zeer korte responstijd. Het testen van de biosensor gepresenteerd in figuur 4 blijkt dat de binding van BlaP-cAb-lys3 te HEWL geïmmobiliseerd op de elektrode PANI kan worden gedetecteerd en gecontroleerd door het meten van de proton-release die voortvloeien uit de activiteit van geïmmobiliseerdet β-lactamase. Daarentegen werd geen huidgeleiding verschil gedetecteerd toen het experiment werd uitgevoerd met BlaP zonder alle ingevoegde nanobody.
Figuur 1: schema vertegenwoordigt het chimeer eiwit BlaP-cAb-Lys3 interactie met HEWL. BlaP wordt in cyaan, cAb-Lys3 in oranje en HEWL in het blauw weergegeven. Dit cijfer is verkregen door het combineren van de driedimensionele structuur van BlaP (VOB-ID: 4BLM) en het complex van de cAb-Lys3/HEWL (VOB-ID: 1MEL). De β-lactamase bevat 2 domeinen: de α/β-domein en het domein van de α, de katalytische site ligt op het raakvlak tussen beide domeinen. De lus gebruikt voor het inbrengen geel gemarkeerd en gelegen in een oplosmiddel-blootgesteld lus in de α-domein. De N - en C-terminaal delen van cAb-Lys3 worden in rood weergegeven. De lus van de CDR3 van cAb-Lys3 maakt de meeste van de contacten met de katalytische site van HEWL. De binding van cAB-Lys3 te HEWL remt de enzymatische activiteit. In onze eerdere werk15zijn dit cijfer en de hier vermelde resultaten bekendgemaakt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: foto van de sensor gebruikt in de experiment. Elke sensor omvat een groep van 8 individuele fiches. Op elke chip, er zijn drie elektroden: één werkende elektrode, een referentie-elektrode en een counter ion elektrode. Het laagje koper deel is aangesloten op een digitale multimeter aangesloten op een computer. De individuele fiches worden georganiseerd als 4 paren waar de "-" gelabelde chips zijn negatieve controle elektroden en de "+" gelabelde chips zijn de elektroden van de steekproef. Deze instelling maakt het mogelijk verschillende experimentele replicatieonderzoeken of HEWL / β-lactamase concentraties aan gelijktijdig worden beproefd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: schematische weergave van de experimentele opstelling gebruikt in onze biosensor assay. HEWL werd geïmmobiliseerd op een beklede elektrode PANI (polyaniline). Het chimeer eiwit BlaP-cAb-Lys3 werd vervolgens toegepast op de elektrode. De geïmmobiliseerdet β-lactamase activiteit, die wordt bepaald door het meten van de release van protonen geïnduceerd door de hydrolyse van Benzylpenicilline, is recht evenredig met de interactie tussen HEWL en het chimeer eiwit. De proton-release induceert elektrische geleidbaarheid wijzigingen die worden geconverteerd naar een signaal dat kan worden geïnterpreteerd door de gebruiker. Evolutie van het geleidingsvermogen verschil waargenomen tussen de PANI bekleed en de referentie-elektrode als functie van de tijd. In onze eerdere werk15zijn dit cijfer en de hier vermelde resultaten bekendgemaakt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: grafische weergave van de conductimetric metingen tonen de specifieke interactie van BlaP-cAb-Lys3 aan HEWL. De toevoeging van Benzylpenicilline wordt aangegeven door een pijl. Dit potentiële verschil vloeit voort uit de proton-release die zich voordoen bij antibiotica hydrolyse. De metingen werden uitgevoerd met het hybride eiwit BlaP-cAb-Lys3 (rood) en de inheemse β-lactamase BlaP zonder alle ingevoegde nanobody (blauw), als een negatieve controle. De verschillende krommen vertegenwoordigen onafhankelijke metingen op verschillende chips. In onze eerdere werk15zijn dit cijfer en de hier vermelde resultaten bekendgemaakt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hierbij presenteren we een methode om functionalize van een nanobody met behulp van de β-lactamase BlaP als een drager-eiwit en we laten zien dat we de daaruit resulterende eiwitten hybride met succes in een potentiometrische sensor assay implementeren kunt. De belangrijkste vernieuwing aspect van ons werk in vergelijking met andere biosensor testen is de covalente koppeling van het antilichaam deel naar de enzymatische activiteit het elektrische signaal genereert. Deze zogenaamde eiwit invoeging technology presenteert voordelen en beperkingen die de belangrijkste focus van deze sectie worden zal.
Voordelen van de hybride β-lactamase technologie.
Β-lactamases zijn efficiënte enzymen
Een van de belangrijkste parameters die van invloed op de gevoeligheid en de signal-to-noise verhouding voor een biosensor is de enzymatische activiteit gebruikt voor het genereren van het signaal. In dit verband, β-lactamases presenteren verschillende voordelen: ze zijn klein (≈29 kDa), monomeer, zeer stabiel, en meer nog belangrijker is, vertonen specifieke hoogactieve en hoge omzet in vergelijking met andere enzymen worden gebruikt in potentiometrische sensor assays zoals glucose oxidase, urease, lipase, peroxydase of alkalisch fosfatase20. Om al deze redenen zijn β-lactamases enzymen van keuze voor verschillende biosensor testen.
Directe plaatsing in de β-lactamase kunt verbeteren de opbrengst van de productie en de stabiliteit van de ingevoegde eiwit en/of domein.
Een van de beperkende aspecten van vele immunosensor tests is de kwaliteit (bv. stabiliteit, zuiverheid) van de antilichaam gebruikt voor het opsporen van de analyt2. Momenteel, low-cost productiesystemen van antilichamen of fragmenten van antilichaam (bijvoorbeeld E. coli) blijven uitdagende en vaak leiden tot geaggregeerde eiwitten met slechte oplosbaarheid en stabiliteit21. Onze hybride β-lactamase technologie lijkt te zijn van een goede aanpak van deze moeilijkheden omdat we eerder toonden dat deze strategie het rendement van de expressie en de stabiliteit van de ingevoegde eiwit domeinen14 verbetert. In het bijzonder in de huidige studie, met behulp van onze hybride β-lactamase systeem, het chimeer eiwit genaamd BlaP-cAb-Lys3 werd met succes uitgedrukt in E. coli met een zeer goed rendement (≈10 mg puur eiwit per liter voor cultuur) en gezuiverd tot homogeniteit.
Covalente koppeling tussen het antilichaam en enzymatische wordt maakt sneller en goedkoper sensor testen
In conventionele immunosensors vereist de detectie van de analyt het gebruik van primaire antilichamen die zijn geïmmobiliseerd op de chip van de sensor. Vervolgens is een secundair antilichaam dat is gekoppeld aan een enzym of een sonde met gelabelde ook vereist voor het genereren van een meetbare signaal. Deze aanpak omvat verschillende incubations en wassen stappen en daarom kan tijdrovend. Dit protocol is bovendien duur, aangezien verschillende antilichamen nodig zijn en covalente koppeling tussen het secundaire antilichaam en een enzym/sonde ook nodig is. In tegenstelling, ons systeem alleen maakt gebruik van een hybride eiwit voor het detecteren en kwantificeren van de analyt, en daarom kunt real-time toezicht zonder het gebruik van secundaire antilichamen.
Bovendien is het belangrijk op te merken dat domein inbrengen in klasse die een β-lactamases bleek voor het genereren van hybride eiwitten2322,allosteric switch-achtig gedrag vertonen. Deze schakelopties kon vinden tal van toepassingen in biosensor gebaseerde testen.
Beperkingen van de technologie van de β-lactamase hybride.
Beperkingen geïnduceerd door Eiwittechnologie.
In dit systeem is het grootste probleem om te ontwerpen en het verkrijgen van een hybride-eiwit door het invoegen van de antilichaam-groep in de β-lactamase. Dit resulterende chimeer eiwit moet bifunctionele: de enzymatische deel moet blijven te efficiënt hydrolyseren β-lactam antibiotica voor het genereren van het elektrische signaal, overwegende dat het deel van het antilichaam aan de gerichte analyt met hoge affiniteit binden moet en specificiteit. Voor het verkrijgen van bifunctionele chimeer eiwitten, diverse parameters moeten worden overwogen teneinde sterische beperkingen. Het eerste kritieke punt is de positie van de plaats van de invoegpositie. Hoewel het heeft aangetoond dat meerdere invoegpunten mogelijk24,25,blootgesteld26, invoeging posities vaak in oplosmiddel gelegen zijn lussen ver weg van de actieve site van het drager-eiwit. Dit minimaliseert de potentiële conformationele wijzigingen of sterische hinder veroorzaakt door het ingevoegde eiwit. Om dezelfde redenen, wordt het eveneens aanbevolen dat de actieve site van het ingevoegde eiwit ligt ver weg van de invoegpositie site om te voorkomen dat wijzigingen van haar activiteiten. Ten slotte, de invoeging van eiwitten die flexibele of van het naburige N - en C-terminaal extremiteiten presenteren zal beter worden getolereerd. Inderdaad, verre en stijve ledematen kunnen opleggen sterische beperkingen op beide partners van het chimeer eiwit, en dus het veranderen van hun biologische activiteiten. Daarom is het belangrijk te vermelden dat de grootte van de ingevoegde proteïne slechts weinig invloed op de daaruit resulterende chimeer eiwitten heeft. Inderdaad, het is gebleken dat grote gestructureerde domeinen kunnen worden met succes ingevoegd in β-lactamases, zolang hun N - en C-terminaal extremiteiten flexibel zijn of dicht bij elkaar13,14,2, 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29. in de huidige studie, de plaats van de invoegpositie in BlaP ligt ver weg van haar actieve site en de ingevoegde nanobody heeft relatief lange en flexibele extremiteiten (niet zichtbaar in de X-ray-structuur) die zich ver weg van de paratope bevinden. Deze specifieke functies zorgen ervoor dat minimaal sterische beperkingen worden opgelegd aan de biologisch actieve oppervlakken van beide partners van het hybride-eiwit. Wanneer de ingevoegde proteïne de aanbevolen criteria voor optimale plaatsing in een drager-eiwit niet aanwezig, is het echter mogelijk om ingenieur linker regio's om lagere potentiële sterische beperkingen. Inderdaad, de aanwezigheid van een flexibele linker (bijvoorbeeld Glycine-Ser herhalingen) om verbinding te maken met de vervoerder en de ingevoegde proteïne bleek te drastisch verhogen de tolerantie ten opzichte van het inbrengen van grote en gestructureerde eiwitten in een carrier een30 ,12.
Beperkingen die inherent zijn aan elektrochemische biosensoren.
Hoewel de ontwikkeling van elektrochemische/potentiometrische biosensoren is geworden een steeds groter wordende veld, hebben deze tests belangrijke beperkingen die worden overwogen moeten bij het ontwerpen van de biosensor experiment. Eerste, alle biosensoren, waarbij H+ release of opname vereisen het gebruik van zeer zwak gebufferd oplossingen (d.w.z. < 5 mM)31 om te meten belangrijke potentiaalverschillen. De pH-variatie geïnduceerde bij H+ uitgave kan invloed hebben op de eigenschappen van de eiwitten en de enzymatische activiteit gebruikt voor het genereren van het signaal. In de tweede plaats pH en Ionische sterkte in biofluids kunnen aanzienlijk verschillen en bijgevolg leiden tot belangrijke verschillen in de reactie en verhogen de achtergrondgeluiden van de biosensoren32. Dit is de reden waarom, verschillende onderzoeksgroepen hebben geprobeerd te ontwikkelen van nanotechnologieën te verminderen van de grootte van de elementen van de elektrochemische sensor worden voorzien teneinde de signal-to-noise verhouding voor de processen die zich bij de interface van het apparaat33, voordoen 34 , 35. Dientengevolge is het ook mogelijk om ontwikkelen antilichamenmolecules aangeduid met verschillende moleculen van het zelfde enzym te verhogen van het signaal die voortvloeien uit de afhankelijkheid van één molecuul aan haar doel-32. Echter, ondanks deze beperkingen, conductometric/biosensoren blijven zeer efficiënte en gevoelige apparaten met geschatte grenzen van detectie (LODs) in het bereik van 10-8 tot en met 10-11 M36.
In deze studie, we hebben aangetoond dat we met succes een nanobody die zich richt op HEWL in een klasse A β-lactamase genaamd BlaP kunt invoegen, en dat de gegenereerde hybride proteïne behoudt beide biologische activiteit: i) strak binden van HEWL en ii) de capaciteit te hydrolyseren Β-lactam-antibiotica. Deze studie vormt een proof of concept voor het inbrengen van diverse nanobodies of antilichaam fragmenten in BlaP en de uitvoering van deze hybride eiwit technologie in potentiometrische sensor testen. Deze technologie kan potentieel worden gebruikt voor het opsporen van verschillende eiwitten epitopes en geïmplementeerd in talrijke diagnostische hulpprogramma's. Inderdaad, de ontwikkeling en het doeltreffend gebruik van deze gehaltebepalingen geworden in onze samenleving van cruciaal belang en zijn vooral gedreven door sociale en economische behoeften voor lage kosten en eenvoudig te bedienen technologieën op verschillende gebieden zoals levensmiddelen en gezondheid systemen, met name in ontwikkelingslan den. Bovendien, nanotechnologieën spelen een steeds grotere rol in de ontwikkeling van dergelijke sensoren. Tegenwoordig, signaal processing technologie kan worden gebruikt op draagbare apparaten zoals smartphones en tablets en verschillende smartphone toepassingen bestaat voor signaalverwerking37. Bijvoorbeeld, onlangs, is een potentiometrische sensor apparaat geïntegreerd in een smartphone om de concentratie van glucose monitoring van38. De gezondheidsdeskundigen zijn ervan overtuigd dat deze soort van innovatieve apparaten belangrijker gezondheid oplossingen in de komende jaren39,40 wordt.
Kortom, vertegenwoordigt dit werk een voorbeeld dat laat zien van de mogelijkheden en voordelen van onze eiwitten invoeging technologie. Wij hopen dat dit werk zal bijdragen tot het ontwikkelen van innovatieve en nuttige technologieën voor onderzoek en medische doeleinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen het Waals Gewest in het kader van de onderzoeksprojecten SENSOTEM en NANOTIC alsmede de nationale middelen voor het wetenschappelijk onderzoek (FRS-F.N.R.S) voor hun financiële steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
- Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
- Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O'Kennedy, R. Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).
- Huston, J. S., et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).
- Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores. Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Sheriff, S., Constantine, K. L.
- Stijlemans, B., et al. Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm. J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).
- Thanongsaksrikul, J., et al. A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A. J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).
- Huang, L., et al. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).
- Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens. J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).
- Kojima, M., et al. Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules. Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).
- Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains. Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).
- Vandevenne, M., et al. The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments. Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).
- Vandevenne, M., et al. Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions. Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).
- Crasson, O., et al. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).
- Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications. Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).
- Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).
- Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline. Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).
- Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).
- Khatkhatay, M. I., Desai, M. A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).
- Worn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).
- Ostermeier, M. Engineering allosteric protein switches by domain insertion. Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).
- Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. Design of protein switches based on an ensemble model of allostery. Nat Commun. 6, 6968 (2015).
- Collinet, B., et al. Functionally accepted insertions of proteins within protein domains. J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).
- Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein. Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).
- Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).
- Ruth, N., et al. DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli. Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).
- Zervosen, A., et al. Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI). FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).
- Chevigne, A., et al. Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development. J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).
- Ke, W., et al. Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation. PloS One. 7, 39168 (2012).
- Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate. Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).
- D'Orazio, P. Biosensors in clinical chemistry. Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).
- Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection. Analyst. 134, 1601-1607 (2009).
- Ding, J., Wang, X., Qin, W. Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).
- Wang, X., et al. A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing. Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).
- Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures. Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).
- Bakker, E., Pretsch, E.
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).
- Nemiroski, A., et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).
- Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , Price Waterhouse Coopers. Commission, T.E (2013).
