基于β-酶的电导生物传感器检测技术在分子间相互作用中的应用

Summary

在这项工作中, 我们报告了一个新的方法来研究蛋白质-蛋白质相互作用的电导生物传感器的基础上的混合β-酶技术。这种方法依赖于质子在β-内酰胺水解时的释放。

Abstract

生物传感器在病原检测、分子诊断、环境监测、食品安全控制等各个领域的应用越来越重要。在这方面, 我们使用β-酶作为有效的报告酶在几个蛋白质-蛋白质相互作用研究。此外, 他们接受多肽或结构蛋白/域插入的能力强烈鼓励使用这些酶产生嵌合蛋白。在最近的一项研究中, 我们在芽孢杆菌地衣BlaP β-酶中插入了一个单域抗体片段。这些小的域, 也称为 nanobodies, 被定义为骆驼单链抗体的抗原结合域。就像常见的双链抗体一样, 它们具有很高的亲和力和特异的靶向。所产生的嵌合蛋白在保持β-酶活性的同时, 对其靶向性具有较高的亲和力。这表明, nanobody 和β-酶基保持功能。在目前的工作中, 我们报告了一个详细的协议, 结合我们的混合β-酶系统的生物传感器技术。由于酶的催化活性释放出的质子的电导测量, 可以检测到 nanobody 对其目标的特定约束力。

Introduction

生物传感器是一种与物理或化学信号装置相结合的分析设备, 称为传感器¹。然后, 可以对记录的信号进行解释和转换, 以监测固定和自由伙伴之间的相互作用。大多数的生物传感器涉及使用抗体来检测分析如激素或不同的病原体标记物²。可以使用不同的传感器格式, 包括基于质量的、磁的、光学的或电化学的生物传感器。后者是最常用的传感器之一, 通过将绑定事件转换为电信号来发挥作用。所有基于抗体的生物传感器的性能和灵敏度主要取决于两个参数: i) 抗体的质量和 ii) 用于生成信号²的系统的属性。

抗体是由两个重链和两个光链组成的高分子质量二蛋白 (150–160 kDa)。光与重链之间的相互作用主要通过疏水相互作用以及一个守恒的二硫化键稳定。每个链包括一个变量域, 它通过三变区域 (CDR1-2-3) 来与抗原相互作用。尽管在该领域取得了许多进展, 但具有低成本表达系统 (例如、大肠杆菌) 的全长抗体的大规模表达往往导致不稳定和聚合蛋白的产生。这就是为什么各种各样的抗体片段被设计了例如单链可变片段³ (ScFvs ≈ 25 kDa)。它们由一个重和一个轻链的可变域组成, 由一个合成氨基酸序列共价键连接。然而, 这些碎片往往表现出很差的稳定性, 并有聚合的倾向, 因为它们将其....

Protocol

1. 蛋白质样品制备

1. 生产和纯化杂交蛋白 BlaP-cAb-Lys3 如我们以前的研究报告¹⁵。将蛋白质储存在50毫米磷酸盐缓冲液 pH 值7.4 以下组成: 8 克氯化钠, 0.2 克氯化钾, 1.44 克 Na₂HPO₄和 0.24 g 的下一₂PO₄溶解在800毫升蒸馏水中修复溶液的 pH 值为7。4将溶液的最终体积调整到 1 l. 过滤器对蛋白质溶液进行杀菌。
2. 准备一个母鸡卵白溶菌酶 (HEWL) 库存解决方案。溶解100毫克 (4万单位/毫克) 的商业购买 HEWL 在10毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS 见步骤 2.1.1)。用0.22 μ m 截止过滤器对蛋白质溶液进行消毒。

2. 生物传感器检测

1. 解决方案和缓冲准备
   1. 准备50毫米 PBS 通过溶解 8 g 氯化钠, 0.2 克氯化钾, 1.44 g Na₂HPO₄, 和 0.24 g 的, 在2毫升的蒸馏水₄PO₈₀₀ 。调整到 pH 值7.4 与 1 n HCl 或 1 n 氢氧化钠, 然后调整解决方案的体积到 1 l. 过滤消毒和存储在4° c。

Results

嵌合蛋白 BlaP-cAb-Lys3 的设计与工程

图1表示将 cAb-Lys3 插入到 BalP 类的一个允许循环中, 从地衣芽孢杆菌中的β-酶。在残余 Asp198 和 Lys199 之间进行插入。在 cAb-Lys3 的两侧引入了凝血酶劈裂部位。用本构表达质粒对 BlaP-cAb-Lys3 嵌合蛋白进行转化的细胞能够在氨苄青霉素的小浓度下生长。这一结果表明, 杂交β-酶是可溶性的, 正确折叠, 可以成功地排泄到细菌的周空间, 它可以有效地提供抗氨苄西林。我们进一步分析了嵌合蛋白的 bifunctionality。正如我们以前的研究报告, 我们的数据表明, β-酶以及嵌合蛋白的 cAb-Lys3 基保留了他们的生物活动¹⁵。

电导生物传感器检测

Discussion

在这项工作中, 我们提出了一种方法来化 nanobody 使用 BlaP β-酶作为载体蛋白, 我们表明, 我们可以成功地实现的结果混合蛋白的电位传感器检测。我们工作的主要创新方面与其他生物传感器的检测相比, 是抗体部分与产生电信号的酶活性的共价耦合。这种所谓的蛋白质插入技术带来的优势和局限性, 将是本节的主要重点。

混合β-酶技术的优势。

β-酶是高效酶
影响生物传感器灵敏度和信噪比的最重要参数之一是用于生成信号的酶活性。在这种情况下, β-酶有几个优点: 它们是小 (≈29 kDa), 单体, 非常稳定, 更重要的是, 表现出高的具体活动和高营业额相比, 其他酶用于电位传感器的检测, 如葡萄糖氧化酶, 脲酶, 脂肪酶, 过氧化物或碱性磷酸酶²⁰。由于这些原因, β-酶是各种生物传感器检测的首选酶。

直接插入β-酶可以提高插入蛋白质/域的产量和稳定性。
许多免疫传感器检测的限制性因.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂
KH2PO4	Sigma-Aldricht	V000225
K2HPO4	Sigma-Aldricht	1551128
NaCl	Sigma-Aldricht	S7653
Tris–盐酸	罗氏	10812846001
EDTA	Sigma-Aldricht	E9884
KCl	Sigma-Aldricht	P9541
Na2HPO4	Sigma-Aldricht	NIST2186II
2-巯基乙醇	Sigma-Aldricht	M6250
丙氨酸	Sigma-Aldricht	A7627
HClO4	Fluka	34288	1M HClO4 溶液，经销商 ： Sigma-Aldricht
酪蛋白水解物	Sigma-Aldricht	22090
苄基青霉素钠	Sigma-Aldricht B0900000
鸡蛋清溶菌酶	罗氏	10837059001
庚烷	Sigma-Aldricht	246654
甲醇	Sigma-Aldricht	322415
氢氧化铵溶液	Sigma-Aldricht	380539	28% NH3 在 H 2 O 中，通过双重蒸馏（浓缩？
实验室耗材
6孔板	Greiner Bio-One	657165	CELLSTAR 6 孔板
设备
pH 计	WTW	1AA110	实验室 pH 计 inoLab pH 7110
真空和过滤系统	Nalgene	NALG300-4100	带接收器的过滤器支架，分配器：
电位传感器芯片			和同事（参考文献 16）
PGSTAT30 Autolab	瑞士万通 Autolab		停产，继任者 Autolab PGSTAT302N
数字万用表，METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		停产，继任者 Metrahit Base