Summary
Dans ce travail, nous présentons une nouvelle méthode pour étudier les interactions de protéine-protéine à l’aide d’un biocapteur conductimétrique basé sur la technologie de β-lactamase hybride. Cette méthode repose sur la libération de protons par hydrolyse des β-lactames.
Abstract
Biocapteurs deviennent de plus en plus important et mis en œuvre dans différents domaines tels que la détection des pathogènes, diagnostic moléculaire, la surveillance environnementale et contrôle de sécurité des aliments. Dans ce contexte, nous avons utilisé des β-lactamases comme enzymes journaliste efficace dans plusieurs études sur les interactions protéine-protéine. En outre, leur capacité à accepter des insertions de peptides ou de protéines/domaines structurés fortement encourage l’utilisation de ces enzymes pour produire des protéines chimériques. Dans une étude récente, nous avons inséré un fragment d’anticorps à domaine unique dans la β-lactamase de Bacillus licheniformis BlaP. Ces petits domaines, également appelés nanocorps, sont définis comme le domaine de liaison antigène anticorps seule chaîne camélidés. Comme les anticorps double chaîne commune, ils montrent des affinités élevées et les spécificités de leurs cibles. La protéine chimérique qui en résulte ont montré une grande affinité contre sa cible tout en conservant l’activité β-lactamase. Ceci suggère que les fractions nanobody et β-lactamases restent fonctionnelles. Dans le présent travail, nous présentons un protocole détaillé qui combine notre système de β-lactamase hybride à la technologie des biocapteurs. La fixation spécifique de la nanobody vers sa cible peut être détectée grâce à une mesure conductimétrique des protons libérés par l’activité catalytique de l’enzyme.
Introduction
Biocapteurs sont des dispositifs analytiques qui combinent une interaction biomoléculaire avec les dispositifs de signalisation physiques ou chimiques appelés transducteurs1. Les signaux enregistrés soient interprétés et convertis pour surveiller les interactions entre les partenaires immobilisées et libres. La plupart des biocapteurs impliquent l’utilisation d’un anticorps pour détecter les analytes tels que les hormones ou autre agent pathogène marqueurs2. Formats de capteur différent peuvent être utilisés et comprennent des biocapteurs basée sur la masse, magnétiques, optiques ou électrochimiques. Ces derniers sont parmi les plus couramment utilisé des détecteurs et fonctionnent en convertissant un événement de liaison en un signal électrique. Les interprétations et exécutions et les sensibilités de tous les dérivés des anticorps biocapteurs dépendent essentiellement de deux paramètres : i) la qualité de l’anticorps et ii) les propriétés du système utilisé pour générer le signal2.
Les anticorps sont des protéines dimères masse moléculaire élevé (150 – 160 kDa) qui sont composées de deux chaînes lourdes et deux chaînes légères. L’interaction entre les chaînes légères et lourdes est surtout stabilisée par des interactions hydrophobes, mais aussi une liaison disulfure conservée. Chaque chaîne comporte un domaine variable qui interagit avec l’antigène essentiellement par l’intermédiaire de trois régions hypervariables nommé complémentaires détermination de régions (CDR1-2-3). Malgré les nombreuses avancées dans le domaine, l’expression à grande échelle des anticorps pleine longueur avec des systèmes d’expression peu coûteux (p. ex., e. coli) mène souvent à la production de protéines instables et agrégées. C’est pourquoi divers fragments d’anticorps ont été conçus comme des fragments de chaîne unique variable3 (ScFvs ≈ 25 kDa). Ils sont constitués des domaines variables des lourds respectivement un et un seul chaînes légères qui sont liées de façon covalente par une séquence d’acides aminés synthétiques. Toutefois, ces fragments souvent affichent une faible stabilité et ont tendance à regrouper, car ils exposent une grande partie de leurs régions hydrophobes au solvant4. Dans ce contexte, camélidés fragments d’anticorps, appelés nanocorps ou HHV, semblent être d’excellentes alternatives à ScFvs. Ces domaines correspondent à des domaines variables des anticorps de chaîne unique de camélidés. Contrairement aux anticorps traditionnels, les anticorps de camélidés sont dépourvues de chaînes légères et ne contiennent que deux chaînes lourdes5. Par conséquent, les nanocorps sont les fragments anticorps monomère plus petits (12 kDa) capables de se lier à un antigène avec une affinité semblable à celle des anticorps traditionnels6. En outre, ils présentent une stabilité et une solubilité par rapport à d’autres anticorps pleine longueur ou des fragments d’anticorps. Enfin, leurs petites tailles et leurs longues boucles CDR3 laissez-les reconnaissent des épitopes cryptiques et lier à l’enzyme sites actifs7,8. De nos jours, ces domaines suscitent un intérêt considérable et ont été combinés à la technologie des biocapteurs. Par exemple, Huang et al. ont mis au point un biocapteur axée sur les nanobody pour la détection et la quantification de l’antigène prostatique spécifique (PSA) humaine9.
Comme mentionné ci-dessus, un paramètre important dans les essais de biocapteur est l’efficacité du système utilisé pour générer le signal électrique. Pour cette raison, les biocapteurs électrochimiques à base d’enzymes ont attiré une attention croissante et ont été largement utilisés pour diverses applications telles que les soins de santé, la sécurité alimentaire et surveillance de l’environnement. Ces biocapteurs s’appuient sur l’hydrolyse catalytique d’un substrat par une enzyme pour générer le signal électrique. Dans ce contexte, β-lactamases se sont révélés être plus précis, plus sensible et plus facile à mettre en œuvre expérimentalement que beaucoup d’autres enzymes comme la phosphatase alcaline ou la peroxydase de raifort10. Β-lactamases sont des enzymes qui sont responsables de la résistance bactérienne aux antibiotiques β-lactamines par hydrolyse d’eux. Ils sont des monomères, très stable, efficace et de petite taille. En outre, insertions de domaine/peptide dans les β-lactamases génèrent bifonctionnel protéines chimériques qui se sont avérés être des outils efficaces pour étudier les interactions de protéine-ligand. En effet, les études récentes ont montré qu’insertion de fragments d’anticorps variable dans les résultats de β-lactamase TEM1 dans une protéine chimérique qui reste capable de se lier avec une haute affinité pour l’antigène cible. Fait intéressant, la liaison de l’antigène a été montrée pour induire la régulation allostérique de TEM1 activité catalytique11,12. En outre, nous avons montré dans plusieurs études que l’insertion de domaine protéine dans une boucle permissive de la β-lactamase de BlaP Bacillus licheniformis génère fonctionnelles protéines chimériques qui conviennent bien à surveiller les interactions protéine-ligand13 ,,14. Nous avons récemment inséré un nanobody, nommé cAb-Lys3, dans ce site d’insertion permissive de BlaP15. Cette nanobody a été montré pour lier au lysozyme de blanc d’oeuf-poule (lysozyme) et d’inhiber son activité enzymatique16. Nous avons montré que la protéine hybride généré, nommée BlaP-cAb-Lys3, conservé une grande spécificité / affinité contre lysozyme tandis que l’activité de la β-lactamase est restée inchangée. Ensuite, nous avons réussi combinée à la technologie hybride de β-lactamase à un Biocapteur électrochimique et a montré que la quantité de signal électrique généré dépendait de l’interaction entre BlaP-cAb-Lys3 et lysozyme immobilisée sur une électrode. En effet, l’hydrolyse des β-lactamines par BlaP induit une libération de protons qui peut être convertie en un signal électrique quantitatif. Cette combinaison de la technologie hybride de β-lactamase avec un Biocapteur électrochimique est quantitative, sensible et rapide et permet de mesurer en temps réel du signal généré. Cette méthode est décrite dans les présentes.
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Protocol
1. protein préparation des échantillons
- Produire et purifier la protéine hybride BlaP-cAb-Lys3 comme indiqué dans notre précédente étude15. Stocker la protéine en 50 mM tampon phosphate pH 7.4 composée comme suit : 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 et 0,24 g de KH2PO4 dissous dans 800 mL d’eau distillée Difficulté le pH de la solution à 7,4 avant réglage du volume final de la solution à 1 L. filtre stériliser la solution protéique.
- Préparer une solution-mère poule blanc d’oeuf lysozyme (lysozyme). Dissoudre 100 mg (40 000 unités/mg) de lysozyme acheté dans le commerce dans 10 mL de solution saline le tampon au phosphate (PBS voir étape 2.1.1). Stériliser la solution protéique en filtrant à l’aide de filtres avec un seuil de 0,22 μm.
2. tests de biocapteur
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Préparation de solution et tampon
- Préparer 50 mM PBS en dissolvant les 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4et 0,24 g de KH2PO4 dans 800 mL d’eau distillée. Ajuster le pH 7,4 avec 1 N HCl ou NaOH N 1 avant d’ajuster le volume de la solution à 1 L. filtre stériliser et stocker à 4 ° C.
- Préparer une solution de saturation/blocage en dissoudre 3 g d’hydrolysat de caséine dans 100 mL de PBS préparé comme indiqué ci-dessus (voir étape 2.1.1). Filtre à stériliser et stocker à 4 ° C.
- Préparer une solution de liaison en dissolvant 1 g d’hydrolysat de caséine dans 100 mL de PBS préparé comme indiqué ci-dessus (voir étape 2.1.1). Filtre à stériliser et stocker à 4 ° C.
- Préparer une solution de lavage (0,1 % Tween - PBS) en ajoutant 100 μL de Tween 20 (100 %) dans 100 mL de PBS préparé comme indiqué ci-dessus (voir étape 2.1.1). Conserver à 4 ° C.
- Préparer une solution de préparation des électrodes (1 % Triton X-100-PBS) en ajoutant 1 mL de Triton X-100 (100 %) dans 100 mL de PBS préparé comme indiqué ci-dessus (voir étape 2.1.1). Conserver à 4 ° C.
- Préparer une solution de régénération de l’électrode (KCl 3,5 M) en 26 g de KCl dans l’eau distillée pour un volume final de dissolvant 100 mL. Filtre stérilisé et conserver à 4 ° C.
- Préparer une solution de NaCl de 5 mM en dissolvant 0,29 g de NaCl dans l’eau distillée pour un volume final de 1 L. filtre stériliser et stocker à 4 ° C. Ensuite, préparer une solution de détection (4 mM benzylpénicilline) en dissolvant 26,7 mg de benzylpénicilline dans 20 mL de 5 mM NaCl solution. Filtre à stériliser et conserver à-20 ° C.
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Régénération et préparation de capteur
Remarque : La polyaniline enduit capteur puces ont été élaborées et aimablement fournis par le Dr P. Bogaerts, Dr S. Yunus et Prof. Y. Glupczynski (catholique Université de Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). La description de la sonde ainsi que les protocoles d’electro-polymérisation de polyaniline utilisés pour synthétiser ces capteurs sont détaillées dans leurs précédents travaux17. En bref, ce système utilise des capteurs réutilisables de huit jetons individuels qui ont été fabriqués par des techniques classiques de circuits imprimés Conseil (PCB). Puces individuelles sont composées de trois électrodes ronds points. Celui du haut est l’électrode de travail sur lequel polyaniline a été synthétisé electro. Celle du milieu est l’électrode de référence et l’électrode inférieure constitue la contre-électrode. La référence et les électrodes de compteur sont fonctionnalisés en utilisant des amalgames Ag/AgCl solide sur le dessus de la couche de carbone.- Effectuer 3 lavages des électrodes en plongeant les pointes dans des puits d’une plaque à 96 puits contenant 300 µL/puits d’une solution de préparation des électrodes (voir Triton X-100-PBS, 1 % étape 2.1.5.). Effectuer chaque lavage pendant 2 min avec un mélange doux à température ambiante.
- Rincer les électrodes en plongeant les pointes dans des puits d’une plaque à 96 puits contenant 300 µL/puits d’eau distillée pendant 2 min avec un mélange doux à température ambiante.
- Régénérer les électrodes en plongeant les pointes dans des puits d’une plaque à 96 puits contenant 300 µL/puits de la solution de régénération (3,5 M KCl, reportez-vous à l’étape 2.1.6) durant la nuit à 4 ° C ou 1 h à température ambiante.
- Effectuer 3 lavages des électrodes en plongeant les pointes dans des puits d’une plaque à 96 puits contenant 300 µL/puits d’une solution saline de tampon phosphate (voir étape 2.1.1.). Effectuer chaque lavage pendant 2 minutes avec un mélange doux à température ambiante.
-
Liaison test effectué sur le capteur
- Couche lysozyme sur PANI (polyaniline) la surface de l’électrode en déposant une goutte de 15 µL de 40 µg/mL lysozyme préparé dans du PBS sur la surface de l’électrode. Incuber une nuit à 4 ° C ou 1 heure à température ambiante.
- Effectuer trois lavages des électrodes avec une solution saline de tampon phosphate (voir étape 2.1.1) en plongeant les pièces de l’électrode des puces capteur dans puits d’une plaque de 96 puits contenant 300 µL/puits d’une solution saline de tampon phosphate. Effectuer chaque lavage pendant 2 min avec un mélange doux à température ambiante.
- Saturer les électrodes en ajoutant une goutte de 50 µL de la solution de saturation (voir étape 2.1.2) sur la surface de l’électrode. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Puis laver trois fois comme décrit dans la précédente étape (voir étape 2.3.2).
- Diluer la solution BlaP-cAb-Lys3 à 20 µg/mL en solution de liaison (voir étape 2.1.3) et appliquez une goutte de 15 µL de cette solution diluée sur les électrodes. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Après la réaction antigène-nanobody, se laver trois fois comme décrit à l’étape précédente à l’aide de la solution de lavage (voir étape 2.1.4). Ensuite, rincez l’électrode une fois avec du PBS (voir étape 2.1.1).
- Pour la détection, branchez la puce du capteur via la partie cuivre-circuits à un multimètre numérique. Puis, lancer la réponse du capteur en appliquant une goutte de 50 µL de solution de détection (voir étape 2.1.7) sur les électrodes positives et en appliquant une goutte de 50 µL de solution de NaCl 5 mM sur les électrodes négatives (voir étape 2.1.7). Incuber 30 min à température ambiante. Surveiller la conductance avec un multimètre numérique.
Remarque : Le multimètre a été fourni par le Dr P. Bogaerts, Dr S. Yunus et Prof. Y. Glupczynski (catholique Université de Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. Cette potentiostat est contrôlé par l’ordinateur via un port USB et analyse les huit différentes puces du capteur en même temps. Le logiciel créé par Yunus et collègues17 crée un tracé en temps réel qui représente la mesure de la différence de conductivité entre les électrodes de référence et l’échantillon contre la montre.
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Representative Results
Conception et l’ingénierie des protéines chimériques BlaP-cAb-Lys3
La figure 1 représente l’insertion du cAb-Lys3 dans une boucle permissive de la β-lactamases de classe A BalP Bacilluslicheniformis. L’insertion a été effectuée entre les résidus Asp198 et Lys199. Un site de clivage de la thrombine a été introduit sur chaque côté du cAb-Lys3. Cellules transformés avec un expression constitutive de plasmide codant la protéine chimérique BlaP-cAb-Lys3 étaient capables de croître en présence d’une faible concentration d’ampicilline. Ce résultat indique que l’hybride de β-lactamase est soluble, correctement plié et peut être éliminée avec succès dans l’espace périplasmique des bactéries où il peut fournir efficacement de résistance à l’ampicilline. Nous avons analysé plus loin la bifunctionality de notre protéine chimérique. Comme indiqué dans nos études précédentes, nos résultats montrent que la β-lactamase ainsi que les fractions de l’ACR-Lys3 de la protéine chimérique conservé leurs activités biologiques15.
Dosage conductimétrique biocapteur
Le capteur de puces utilisées pour ce test est illustré à la Figure 2. Les capteurs utilisés pour ces expériences contiennent 8 jetons. Chaque puce comprend trois électrodes : une électrode de travail, une contre-électrode et électrode d’un référence. Ces 8 puces sont organisés sous forme de 4 paires dans le capteur. Pour chaque paire, l’un des jetons marqués «- » correspond à un témoin négatif, tandis que la puce étiqueté « + » correspond à l’échantillon testé.
La figure 3 représente la description schématique du montage expérimental utilisé dans ce travail qui combine la technologie de β-lactamase hybride d’un biocapteur potentiométrique. Dans cette configuration, les deux électrodes sont utilisés : i) une électrode de référence et ii) une électrode enrobée de polyaniline (PANI). LYSOZYME est adsorbé sur l’électrode enrobée de PANI, tel que rapporté dans d’autres études18,19. Après lavages adéquates, BlaP-cAb-Lys3 (pour « + » étiqueté puces) ou BlaP sans nanobody inséré (pour «- » étiqueté puces) sont appliquées sur les électrodes. Après l’ajout du β-lactame (benzylpénicilline) sur les électrodes, les variations de la conductance électrode sont mesurées. En effet, l’hydrolyse de β-lactame par β-lactamases génère une libération de protons ; qui a été montré pour créer des changements significatifs dans la conductance électrode avec un temps de réponse très court. Les dosages de biocapteur présentés dans la Figure 4 indiquent que la liaison du BlaP-cAb-lys3 au lysozyme immobilisé sur l’électrode PANI peut être détectée et surveillée en mesurant la libération de protons résultant de l’activité de la β-lactamase immobilisée. En revanche, aucune différence de conductance a été détectée lors de l’expérience a été réalisée avec BlaP sans n’importe quel nanobody inséré.
Figure 1 : schéma représentant les protéines chimériques BlaP-cAb-Lys3 interagissant avec lysozyme. BlaP apparaît en cyan, cAb-Lys3 orange et lysozyme en bleu. Ce chiffre a été obtenu en combinant les structures tridimensionnelles de BlaP (PDB ID : 4BLM) et le complexe Lys3/cAb-lysozyme (PDB ID : 1MEL). La β-lactamase contient 2 domaines : le domaine α/β et le α, le site catalytique est situé à l’interface entre les deux domaines. La boucle utilisée pour l’insertion est surlignée en jaune et située dans une boucle exposés au solvant dans le domaine α. Les parties de N - et C-terminale du cAb-Lys3 figurent en rouge. La boucle CDR3 du cAb-Lys3 rend la plupart des contacts avec le site catalytique de lysozyme. La liaison du cAB-Lys3 au lysozyme inhibe son activité enzymatique. Ce chiffre et les résultats présentés ci-après ont été publiés dans nos précédents travaux15. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : photo du capteur utilisé dans l’expérience de. Chaque capteur comprend un groupe de 8 jetons individuels. Sur chaque morceau, il y a trois électrodes : une électrode de travail, une électrode de référence et une contre-électrode ion. La partie recouverte de cuivre est branchée à un multimètre numérique connecté à un ordinateur. Les puces individuelles sont organisées en 4 paires où le «- » jetons marqués sont des électrodes de contrôle négatif et le « + » jetons marqués sont les électrodes de l’échantillon. Cette configuration permet aux différentes répliques expérimentales ou lysozyme / concentration de β-lactamase à être testées simultanément. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : représentation schématique de la montage expérimental utilisé dans notre test de biocapteur. LYSOZYME a été immobilisé sur une électrode enrobée de PANI (polyaniline). La protéine chimérique BlaP-cAb-Lys3 a ensuite été appliquée sur l’électrode. L’activité de β-lactamase immobilisé, qui est déterminée en mesurant la libération de protons induits par l’hydrolyse de la benzylpénicilline, est directement proportionnelle à l’interaction entre la protéine chimérique et le lysozyme. La libération de protons induit des changements de la conductance électrique qui sont convertis en un signal qui peut être interprété par l’utilisateur. Évolution de la conductance de différence observée entre le PANI enduit et l’électrode de référence en fonction du temps. Ce chiffre et les résultats présentés ci-après ont été publiés dans nos précédents travaux15. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : représentation graphique de la conductimétrie mesures montrant l’interaction spécifique du BlaP-cAb-Lys3 au lysozyme. L’ajout de benzylpénicilline est indiqué par une flèche. Cette différence de potentiel résulte de la libération de protons qui se produisent après hydrolyse antibiotique. Les mesures ont été effectuées avec la protéine hybride BlaP-cAb-Lys3 (rouge) et du BlaP natif de β-lactamase sans n’importe quel nanobody inséré (bleu), comme un contrôle négatif. Les différentes courbes représentent des mesures indépendantes effectuées sur les différentes puces. Ce chiffre et les résultats présentés ci-après ont été publiés dans nos précédents travaux15. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans ce travail, nous présentons une méthode pour fonctionnaliser un nanobody à l’aide de la β-lactamase BlaP comme protéine porteuse et nous montrons que nous pouvons implémenter avec succès la protéine hybride résultant dans un essai de capteur potentiométrique. La principale innovation de notre travail par rapport aux autres tests biocapteur est le couplage covalent de la partie de l’anticorps à l’activité enzymatique qui génère le signal électrique. Cette technologie d’insertion dite protéine présente des avantages et des limitations qui seront l’objectif principal de cette section.
Avantages de la technologie de β-lactamase hybride.
Β-lactamases sont des enzymes efficaces
Un des paramètres plus importants qui influencent la sensibilité et le rapport signal sur bruit d’un biocapteur est l’activité enzymatique utilisée pour générer le signal. Dans ce contexte, les β-lactamases présentent plusieurs avantages : ils sont petits (≈29 kDa), monomère, très stable et bien plus important, présentent une activité spécifique élevée et un roulement élevé par rapport aux autres enzymes utilisées dans les essais de capteur potentiométrique tels que le glucose oxydase, l’uréase, lipase, peroxydase ou20de la phosphatase alcaline. Pour toutes ces raisons, β-lactamases sont des enzymes de choix pour divers essais de biocapteur.
Insertion directe dans la β-lactamase peut améliorer le rendement de production et de la stabilité de la protéine/domaine inséré.
Un des aspects limitants de nombreux tests d’immunosensor est la qualité (stabilité, pureté) de l’anticorps utilisé pour détecter l' analyte2. Actuellement, les systèmes de faible coût de production des anticorps ou des fragments d’anticorps (p. ex. e. coli) restent difficiles et conduisent souvent à des protéines agrégées avec faible solubilité et stabilité21. Notre technologie de β-lactamase hybride semble être une bonne approche pour surmonter ces difficultés, puisque nous avons montré précédemment que cette stratégie améliore le rendement de l’expression et la stabilité de la protéine insérée domaines14. En particulier, dans la présente étude, à l’aide de notre système de β-lactamase hybride, la protéine chimérique nommée BlaP-cAb-Lys3 a été correctement exprimée chez e. coli avec un très bon rendement (≈10 mg de protéine pur par litre de culture) et purifiée jusqu'à homogénéité.
Couplage covalent entre les anticorps et les moitiés enzymatiques rend capteur moins cher et plus rapide des essais
Dans les immunosensors classiques, la détection de l’analyte nécessite l’utilisation d’anticorps primaires qui sont immobilisées sur la puce du capteur. Par la suite, un anticorps secondaire est couplé à une enzyme ou une sonde marquée est également requis pour générer un signal mesurable. Cette approche implique plusieurs incubations et étapes de lavage et peut donc beaucoup de temps. En outre, ce protocole est coûteux, puisque plusieurs anticorps sont nécessaires et le couplage covalent entre l’anticorps secondaire et une enzyme/sonde est également nécessaire. En revanche, notre système utilise uniquement une protéine hybride pour la détection et la quantification de l’analyte et permet donc de surveillance sans l’utilisation d’anticorps secondaires en temps réel.
En outre, il est important de noter cette insertion de domaine dans la classe qu'un β-lactamases a été montré pour générer des protéines hybrides présentant allostérique interrupteur-comme le comportement22,23. Ces commutateurs pourraient trouver des applications nombreuses dans des essais de biocapteurs.
Limitations de la technologie de β-lactamase hybride.
Limitations induites par l’ingénierie des protéines.
Dans ce système, la principale difficulté est de concevoir et d’obtenir une protéine hybride en y insérant la portion d’anticorps de la β-lactamase. Cette protéine chimérique qui en résulte doit être bifonctionnelle : la fraction enzymatique doit rester capable d’hydrolyser efficacement β-lactamines pour générer le signal électrique, tandis que la portion d’anticorps doit être affecté à l’analyte ciblée avec une haute affinité et spécificité. Pour obtenir des protéines chimériques bifonctionnels, différents paramètres doivent considérer afin d’éviter les contraintes stériques. Le premier point critique est la position du site d’insertion. Bien qu’il a été démontré que plusieurs points d’insertion sont possibles24,25,26, d’insertion, les postes sont souvent situés dans le solvant exposés boucles loin du site actif de la protéine porteuse. Cela minimise les éventuels changements de conformation ou empêchement stérique induite par la protéine insérée. Pour les mêmes raisons, il est également recommandé que le site actif de la protéine insérée être situé loin du site d’insertion afin de prévenir les altérations de son activité. Enfin, l’insertion des protéines qui présentent des extrémités du flexible ou voisin N - et C-terminal est mieux tolérée. En effet, extrémités lointaines et rigides peuvent imposer de contraintes stériques les deux partenaires de la protéine chimérique et altèrent ainsi leurs activités biologiques respectifs. Par conséquent, il est important de mentionner que la taille de la protéine insérée a peu d’impact sur la protéine chimérique qui en résulte. En effet, il a été démontré que vastes domaines structurés peuvent être correctement insérés dans β-lactamases, aussi longtemps que leurs extrémités N - et C-terminaux sont souples ou près de l’autre13,14,2, 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29. dans la présente étude, le site d’insertion au BlaP se trouve loin de son site actif et le nanobody inséré est relativement longues et flexibles extrémités (non visibles dans la structure des rayons x) qui situent trouve loin du paratope. Ces caractéristiques s’assurer qu’un minimum de contraintes stérique est imposé sur les surfaces biologiquement actifs des deux partenaires de la protéine hybride. Toutefois, lorsque la protéine insérée ne présente pas les critères recommandés pour une insertion optimale dans une protéine porteuse, il est possible d’ingénieur linker régions afin de réduire les éventuelles contraintes stériques. En effet, la présence d’un linker flexible (par exemple Gly-Ser les répétitions) pour connecter le transporteur et la protéine insérée s’est avérée considérablement augmenter la tolérance à l’égard de l’insertion des protéines importantes et structurées dans un transporteur un30 ,,12.
Limitations inhérentes aux électrochimique biocapteurs.
Bien que le développement de biocapteurs électrochimiques/potentiométrique est devenu un champ croissant, ces tests ont des limitations importantes qui doivent être examinées lors de la conception de l’expérience du biocapteur. Tout d’abord, tous les biocapteurs impliquant la libération de H+ ou absorption nécessitent l’utilisation de solutions très faiblement tamponnées (i.e. < 5 mM)31 afin de mesurer les différences de potentiel significatifs. La variation de pH induite par leur libération H+ peut influer sur les propriétés des protéines et l’activité enzymatique utilisé pour générer le signal. Deuxièmement, pH et la concentration ionique en liquides peuvent varient considérablement et par conséquent entraîner des variations importantes dans la réponse et augmenter le bruit de fond des biocapteurs32. C’est pourquoi, plusieurs groupes de recherche ont essayé de développer des nanotechnologies pour diminuer la taille de capteur électrochimique éléments afin d’augmenter le rapport signal à bruit pour les processus qui se produisent à l’interface de l’appareil33, 34 , 35. en conséquence, il est également possible de développer des molécules d’anticorps marqués avec plusieurs molécules de la même enzyme pour augmenter le signal résultant de la liaison d’une molécule à sa cible32. Cependant, malgré ces limites, conductimétrique/biocapteurs restent des appareils hautement efficaces et sensibles avec estimé limites de détection (LOD) de l’ordre de 10-8 à 10-11 M36.
Dans cette étude, nous avons montré que nous pouvons insérer avec succès une nanobody qui cible le lysozyme dans une β-lactamases de classe A nommé BlaP, et que la protéine hybride généré conserve les deux activités biologiques : la liaison i) serré de lysozyme et ii) la capacité d’hydrolyser Β-lactamines. Cette étude constitue une preuve de concept pour une insertion de divers fragments nanocorps ou anticorps dans BlaP et la mise en œuvre de cette technologie de protéine hybride lors d’essais de capteur potentiométrique. Cette technologie pourrait potentiellement être utilisée pour détecter différents épitopes de protéine et mis en œuvre dans nombreux outils de diagnostic. En effet, le développement et l’utilisation efficace de ces tests sont devenus essentiels dans notre société et sont essentiellement tirée par les besoins sociaux et économiques à faible coût et facile à utiliser des technologies dans divers domaines tels que les systèmes alimentaires et sanitaires, notamment dans pays en développement. En outre, nanotechnologies jouent un rôle croissant dans le développement de ces capteurs. Aujourd'hui, les technologies de traitement de signal sont disponibles sur des appareils portables tels que les smartphones et tablettes et smartphone différente applications existent déjà pour le traitement du signal,37. Par exemple, récemment, un dispositif capteur potentiométrique a été intégré dans un smartphone afin de permettre la concentration de glucose monitoring38. Les experts de la santé sont confiants que ces dispositifs peu innovants deviendront des solutions de santé plus importantes dans les prochaines années39,40.
En conclusion, ce travail représente un exemple qui montre le potentiel et les avantages de notre technologie d’insertion de protéine. Nous espérons que cet ouvrage va contribuer à développer des technologies novatrices et utiles pour la recherche et à des fins médicales.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent la région wallonne dans le cadre des projets de recherche SENSOTEM et NANOTIC, ainsi que le National fonds pour la recherche scientifique (F.R.S-F.N.R.S) pour leur soutien financier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
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