Summary
في هذا العمل، نحن تقرير أسلوب جديد لدراسة تفاعلات البروتين البروتين استخدام بيوسينسور كوندوكتيميتريك على أساس تكنولوجيا β-lactamase الهجين. ويعتمد هذا الأسلوب على الإفراج عن البروتونات عند التحلل من β-لاكتامس.
Abstract
أجهزة استشعار العوامل البيولوجية تزداد أهمية وتنفيذها في مختلف الميادين مثل الكشف عن مسببات المرض والتشخيص الجزيئي، والرصد البيئي، ومراقبة سلامة الأغذية. وفي هذا السياق، استخدمنا lactamases بيتا كمراسل كفاءة الإنزيمات في عدة دراسات التفاعل البروتين-بروتين. وعلاوة على ذلك، تشجع قدرتها على قبول الملاحق من الببتيدات أو منظم البروتينات/المجالات بشدة استخدام هذه الإنزيمات لتوليد بروتينات تشيميريك. في دراسة أجريت مؤخرا، ونحن إدراج جزء من جسم مجال واحد في بلاب Bacillus ليتشينيفورميس β-lactamase. يتم تعريف هذه المجالات الصغيرة، وتسمى أيضا نانوبوديس، كنطاقات مستضد ملزمة للأجسام المضادة واحد في سلسلة من الإبليات. وتظهر مثل الأجسام المضادة المشتركة لسلسلة مزدوجة، الانتماءات عالية والخصوصيات لأهدافها. معارضها البروتين تشيميريك الناتجة من تقارب عالية ضد هدفه مع الاحتفاظ بالنشاط β-lactamase. وهذا يوحي أن تظل مويتيس نانوبودي و β-lactamase الوظيفية. في هذا العمل، نحن تقرير بروتوكول مفصل الذي يجمع بين نظامنا β-lactamase الهجين للتكنولوجيا بيوسينسور. ويمكن الكشف عن ملزمة محددة من نانوبودي إلى هدفها بفضل مقياس كوندوكتيميتريك للبروتونات الصادرة عن نشاط الإنزيم الحفاز.
Introduction
أجهزة استشعار العوامل البيولوجية هي الأجهزة التحليلية التي تجمع تفاعل الحيوي جزيئي مع أجهزة إرسال الإشارات الفيزيائية أو الكيميائية المشار إليها كمحولات الطاقة1. يمكن تفسير الإشارات المسجلة وتحويلها إلى رصد التفاعلات بين الشركاء المعطل تداولها ومجانا. معظم أجهزة استشعار العوامل البيولوجية تنطوي على استخدام جسم مضاد للكشف عن تحليلها مثل الهرمونات أو علامات الممرض مختلفة2. تنسيقات استشعار مختلفة يمكن استخدامها، وتشمل هذه الأجهزة المستندة إلى كتلة أو مغناطيسية، بصرية أو الكهروكيميائية. هذه الأخيرة هي من بين الأكثر شيوعاً المستخدمة في أجهزة الاستشعار، وتعمل عن طريق تحويل حدث ملزم إلى إشارة كهربائية. الأداء والحساسيات جميع هذه الأجهزة المستندة إلى جسم تعتمد بشدة على أساسا معلمتين من معلمات: ط) نوعية الجسم والثاني) خصائص النظام المستخدمة لتوليد إشارة2.
الأجسام المضادة هي بروتينات dimeric كتلة عالية-الجزيئية (150 – 160 كاتشين) التي تتألف من اثنين من سلاسل ثقيلة واثنين من سلاسل خفيفة. واستقرت بالتفاعل بين السلاسل الخفيفة والثقيلة معظمها التفاعلات مسعور، فضلا عن سندات ثنائي كبريتيد مصانة. ويشمل كل سلسلة متغير مجال الذي يتفاعل مع مستضد أساسا عبر ثلاث مناطق هايبرفاريابل اسمه "مكملة تحديد المناطق" (CDR1-2-3). وعلى الرغم من العديد من التطورات في هذا المجال، التعبير على نطاق واسع من أجسام كاملة الطول مع أنظمة تعبير منخفضة التكلفة (مثل كولاي) غالباً ما يؤدي إلى إنتاج بروتينات غير مستقرة ومجمعة. وهذا السبب في مختلف أجزاء جسم قد تم إجراء هندسة عكسية مثل متغير واحد-سلسلة الأجزاء3 (سكففس ≈ كاتشين 25). وهي تتألف من مجالات متغير واحد على التوالي الثقيلة وسلاسل خفيفة واحدة مرتبطة تساهميا بتسلسل الأحماض الأمينية اصطناعية. بيد أن هذه الشظايا غالباً ما تعرض استقرار فقراء ولديهم ميل لتجميع، نظراً لأنها تعرض جزء كبير من مناطقها مسعور ل المذيبات4. وفي هذا السياق، يبدو أن سلسلة واحدة الكامليد جسم الشظايا، يشار إلى نانوبوديس أو فحص، بدائل ممتازة سكففس. تتوافق هذه المجالات إلى مجالات متغير من الأجسام المضادة أحادية السلسلة الكامليد. على النقيض من الأجسام المضادة التقليدية، الأجسام المضادة الكامليد تخلو من سلاسل خفيفة وتحتوي فقط على اثنين من سلاسل ثقيلة5. ولذلك، نانوبوديس هي أصغر جسم أحادي الأجزاء (12 كاتشين) قادرة على ربط مستضد مع تقارب مماثل للأجسام المضادة التقليدية6. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنها تعرض تحسين الاستقرار والقابلية للذوبان في مقارنة بغيرها طول الأجسام المضادة أو أجزاء جسم. أخيرا، أحجام صغيرة وعلى الحلقات CDR3 الموسعة يسمح لهم بالاعتراف بخفي [ابيتوبس] وربط إنزيم مواقع نشطة7،8. في الوقت الحاضر، هذه المجالات التي تحظى باهتمام كبير وتضافرت للتكنولوجيا بيوسينسور. على سبيل المثال، هوانغ وآخرون. وقد وضعت بيوسينسور على أساس نانوبودي للكشف والتحديد الكمي للبشرية مستضد البروستات محددة (PSA)9.
كما ذكر أعلاه، هو معياراً هاما في فحوصات biosensor كفاءة النظام المستخدمة لتوليد إشارة كهربائية. ولهذا السبب، المستندة إلى إنزيم أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية تجتذب اهتماما متزايداً، وقد استخدمت على نطاق واسع لمختلف التطبيقات مثل الرعاية الصحية والسلامة الغذائية، والرصد البيئي. أجهزة الاستشعار هذه تعتمد على التحلل الحفاز من الركازة بإنزيم لتوليد الإشارة الكهربائية. وفي هذا السياق، عرضت β-لاكتاماسيس أن تكون أكثر تحديداً، وأكثر حساسية وأسهل في التنفيذ تجريبيا من العديد من الإنزيمات الأخرى مثل الفوسفاتيز القلوية أو الفجل البيروكسيديز10. Β-lactamases هي الإنزيمات التي المسؤولة عن مقاومة الجراثيم للمضادات الحيوية بيتا لاكتام التي هيدروليزينج لهم. وهم أحادي، ومستقرة جداً، والكفاءة، وصغيرة الحجم. وعلاوة على ذلك، تولد الملاحق المجال/الببتيد إلى β-lactamases البروتينات تشيميريك ثنائية-الوظائف التي عرضت أن تكون أدوات فعالة لدراسة تفاعلات البروتين-يجند. في الواقع، أظهرت دراسات أجريت مؤخرا أن إدراج أجزاء جسم متغير في نتائج β-lactamase TEM1 في بروتين تشيميريك التي ما زالت قادرة على ربط مع تقارب عالية على مستضد المستهدفة به. من المثير للاهتمام، والربط مستضد أبدى للحث على تنظيم نشاط الحفاز TEM111،12اللوستيريك. وعلاوة على ذلك، أظهرت أننا في العديد من الدراسات أن الإدراج المجال البروتين في حلقة متساهلة من Bacillus ليتشينيفورميس بلاب β-lactamase يولد البروتينات تشيميريك الوظيفية التي مناسبة تماما لرصد تفاعلات البروتين-يجند13 ،14. ونحن مؤخرا إدراج نانوبودي، اسمه كاب-Lys3، في هذا الموقع الإدراج المتساهلة بلاب15. وأبدى هذا نانوبودي لربط lysozyme الدجاجة-البيض-أبيض (هول) وكبح النشاط الأنزيمي16. لقد أظهرنا أن البروتين الهجين الذي تم إنشاؤه، اسمه بلاب-كاب-Lys3، الاحتفاظ خصوصية عالية/تقارب ضد هول بينما ظل النشاط β-lactamase بدون تغيير. ثم أننا بنجاح الجمع بين التكنولوجيا الهجينة β-lactamase إلى biosensor الكهروكيميائية وأظهر أنه يعتمد التفاعل بين بلاب-كاب-Lys3 وهول معطلة في قطب كمية الإشارات الكهربائية التي تم إنشاؤها. وفي الواقع، يدفع التحلل من المضادات الحيوية بيتا لاكتام بلاب بيان بروتون التي يمكن تحويلها إلى إشارة كهربائية كمية. هذا المزيج من التكنولوجيا الهجينة β-lactamase مع biosensor الكهروكيميائية سريعة وحساسة، الكمية، ويتيح قياس الإشارات التي تم إنشاؤها في الوقت الحقيقي. ويرد وصف هذه المنهجية هنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد نموذج البروتين
- إنتاج وتنقية البروتين الهجين بلاب-كاب-Lys3 كما ورد في أعمالنا السابقة الدراسة15. تخزين البروتين في 50 ملم الفوسفات المخزن المؤقت الأس الهيدروجيني 7.4 على النحو التالي: 8 غرام من كلوريد الصوديوم، 0.2 جم من بوكل، ز 1.44 غ2هبو4 و 0.24 ز خ2بو4 حله في 800 مل ماء المقطر إصلاح الرقم الهيدروجيني للحل إلى 7.4 قبل ضبط حجم الصوت النهائي من حل 1 تصفية ل. تعقيم حل البروتين.
- تحضير دجاجة البيض أبيض lysozyme (هيول) حل أسهم. حل 100 مغ (40,000 وحدات/mg) من هول تجارياً المشتراة في 10 مل من المحلول الملحي العازلة الفوسفات (راجع الخطوة 2.1.1 من برنامج تلفزيوني). تعقيم حل البروتين عن طريق الترشيح باستخدام عوامل التصفية مع قطع 0.22 ميكرومتر.
2. فحوصات بيوسينسور
-
إعداد المخزن المؤقت للحل
- إعداد 50 مم برنامج تلفزيوني بتذويب ز 0.2 من بوكل وز 1.44 غ2هبو4، 8 غرام من كلوريد الصوديوم و 0.24 ز خ2ص4 في 800 مل ماء المقطر. ضبط على درجة الحموضة 7.4 مع 1 N HCl أو هيدروكسيد الصوديوم N 1 قبل ضبط وحدة تخزين حل 1 تصفية ل. تعقيم وتخزين في 4 درجات مئوية.
- إعداد حل حظر/تشبع بتذويب 3 ز من الكازين هيدروليساتي في 100 مل من برنامج تلفزيوني أعد كما هو موضح أعلاه (راجع الخطوة 2.1.1). فلتر تعقيم وتخزين في 4 درجات مئوية.
- إعداد حل ملزم بتذويب ز 1 من الكازين هيدروليساتي في 100 مل من برنامج تلفزيوني أعد كما هو موضح أعلاه (راجع الخطوة 2.1.1). فلتر تعقيم وتخزين في 4 درجات مئوية.
- تعد حلاً غسيل (0.1% توين-برنامج تلفزيوني) بإضافة 100 ميكروليتر من 20 توين (100%) في 100 مل من برنامج تلفزيوني أعد كما هو موضح أعلاه (راجع الخطوة 2.1.1). مخزن في 4 درجات مئوية.
- تعد حلاً إعداد قطب كهربائي (1% Triton X-100-برنامج تلفزيوني) بإضافة 1 مل من Triton X-100 (100%) في 100 مل من برنامج تلفزيوني أعد كما هو موضح أعلاه (راجع الخطوة 2.1.1). مخزن في 4 درجات مئوية.
- تعد حلاً تجدد قطب كهربائي (3.5 م بوكل) بتذويب ز 26 من بوكل في الماء المقطر لوحدة تخزين نهائي 100 مل. فلتر تعقيم ومخزن في 4 درجات مئوية.
- إعداد 5 ملم من محلول كلوريد الصوديوم بتذويب 0.29 جم من كلوريد الصوديوم في الماء المقطر لوحدة تخزين نهائي 1 تصفية ل. تعقيم وتخزين في 4 درجات مئوية. ثم، تعد حلاً كشف (بينزيلبينيسيلين 4 ملم) بتذويب 26.7 مغ بينزيلبينيسيلين في 20 مل من محلول كلوريد الصوديوم 5 ملم. فلتر تعقيم وتخزين في-20 درجة مئوية.
-
إعداد أجهزة الاستشعار والتجديد
ملاحظة: بوليانيليني المغلفة استشعار وضعت رقائق وتفضلت المقدمة من د. ب. بوجارتس والدكتور يونس س. أ. د. ي. جلوبكزينسكي (الكاثوليكية جامعة لوفين-لوس أنجليس--نوف-تشو مونت-جودين). مفصلة وصف الاستشعار، فضلا عن بوليانيليني الكهربائية-البلمرة البروتوكولات المستخدمة لتجميع هذه المجسات على العمل السابق17. بإيجاز، أن هذا النظام يستخدم أجهزة استشعار قابلة لإعادة الاستخدام من ثماني رقائق الفردية التي صنعت بتقنيات الكلاسيكية الدوائر المطبوعة المجلس (ثنائي الفينيل متعدد الكلور). رقائق الفردية تتكون من ثلاثة قطب الجولة البقع. رأس واحد هو العامل الكهربائي في بوليانيليني التي تم توليفها الكهربائية. واحدة متوسطة مسرى المرجعية ويشكل القطب السفلي مسرى العداد. يتم فونكتيوناليزيد على حد سواء، والإشارة، واقطاب مكافحة استخدام مزيج Ag/AgCl الصلبة فوق طبقة الكربون.- إجراء 3 يغسل من أقطاب كهربائية بغمس النصائح في آبار صفيحة 96-كذلك تحتوي على 300 ميليلتر/جيدا من قطب كهربائي إعداد الحل (انظر Triton X-100-برنامج تلفزيوني، 1% خطوة 2.1.5.). أداء كل غسل لمدة 2 دقيقة مع خلط لطيف في درجة حرارة الغرفة.
- شطف أقطاب كهربائية بغمس النصائح في آبار صفيحة 96-كذلك تحتوي على 300 ميليلتر/جيدا من الماء المقطر لمدة 2 دقيقة مع خلط لطيف في درجة حرارة الغرفة.
- إعادة إنشاء أقطاب كهربائية بغمس النصائح في آبار صفيحة 96-كذلك تحتوي على 300 ميليلتر/جيدا لحل التجديد (3.5 م بوكل، راجع الخطوة 2.1.6) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- إجراء 3 يغسل من أقطاب كهربائية بغمس النصائح في آبار صفيحة 96-كذلك تحتوي على 300 ميليلتر/جيدا من الفوسفات المالحة المخزن المؤقت (راجع الخطوة 2.1.1.). أداء كل غسل لمدة دقيقتين مع خلط لطيف في درجة حرارة الغرفة.
-
ملزمة والرزن يقوم على استشعار
- معطف هول إلى سطح المؤسسة الوطنية للطفولة (بوليانيليني) القطب بإيداع قطره 15 ميليلتر من 40 ميكروغرام/مل هول أعدت في برنامج تلفزيوني على سطح القطب. تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- أداء يغسل ثلاثة من الأقطاب مع الفوسفات المالحة المخزن المؤقت (راجع الخطوة 2.1.1) بغمس أجزاء القطب من رقائق الاستشعار في آبار صفيحة 96-كذلك تحتوي على 300 ميليلتر/بئر المالحة العازلة الفوسفات. أداء كل غسل لمدة 2 دقيقة مع خلط لطيف في درجة حرارة الغرفة.
- تشبع أقطاب كهربائية بإضافة قطره 50 ميليلتر من عرقلة الحل (راجع الخطوة 2.1.2) على سطح القطب. احتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل ثلاث مرات، كما هو موضح في السابق خطوة (راجع الخطوة 2.3.2).
- تمييع الحل بلاب-كاب-Lys3 إلى 20 ميكروغرام/مل في ربط حل (راجع الخطوة 2.1.3) وتطبيق قطره 15 ميليلتر من هذا محلول مخفف على أقطاب كهربائية. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد رد فعل مستضد نانوبودي، يغسل ثلاث مرات كما وصفت في الخطوة السابقة باستخدام الحل أغسل (راجع الخطوة 2.1.4). ثم شطف مسرى مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني (راجع الخطوة 2.1.1).
- للكشف، قم بتوصيل رقاقة الاستشعار عن طريق الجزء النحاس-الدوائر إلى متعدد رقمية. ثم بدء استجابة جهاز استشعار بتطبيق قطره 50 ميليلتر من الكشف عن الحل (راجع الخطوة 2.1.7) إلى أقطاب الإيجابية وتطبيق قطره 50 ميليلتر من محلول كلوريد الصوديوم 5 مم على الأقطاب السالبة (راجع الخطوة 2.1.7). احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. رصد في الموصلية مع متعدد رقمية.
ملاحظة: المتعدد قدم الدكتور ب. بوجارتس والدكتور يونس س. أ. د. ي. جلوبكزينسكي (الكاثوليكية جامعة لوفين-لوس أنجليس--نوف-تشو مونت-جودين. هذا بوتينتيوستات الخاضعة لسيطرة جهاز الكمبيوتر عبر منفذ USB ويحلل رقائق مختلفة ثمانية من أجهزة الاستشعار في وقت واحد. البرامج التي تم إنشاؤها بواسطة يونس وزملاؤه17 ينشئ مؤامرة في الوقت الحقيقي التي تمثل قياسات الموصلية الفرق بين أقطاب المرجعية وعينه مع الزمن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التصميم والهندسة للبروتين تشيميريك بلاب-كاب-Lys3
ويمثل الرقم 1 إدراج Lys3 سيارة الأجرة في حلقة متساهلة من الفئة أ بالب β-lactamase من Bacillus ليتشينيفورميس. وأجرى الإدراج بين بقايا Asp198 و Lys199. وعرض موقع انقسام ثرومبين على كل جانب من Lys3 سيارة أجرة. الخلايا التي تتحول مع بلازميد تعبير تأسيسي ترميز البروتين تشيميريك بلاب-كاب-Lys3 تمكنوا من ينمو حضور تركيز الأمبيسلّين صغيرة. هذه النتيجة تشير إلى أن الهجين β-lactamase قابل للذوبان، مطوية بشكل صحيح، ويمكن أن تفرز بنجاح في الفضاء بيريبلاسميك من البكتيريا حيث أنها يمكن أن توفر كفاءة المقاومة ضد الأمبيسلّين. كذلك قمنا بتحليل بيفونكتيوناليتي لدينا بروتين تشيميريك. كما ورد في دراساتنا السابقة، أظهرت البيانات المتوفرة لدينا أن β-lactamase، فضلا عن مويتيس Lys3 سيارة الأجرة من البروتين تشيميريك الإبقاء على الأنشطة البيولوجية15.
الإنزيم بيوسينسور كوندوكتيميتريك
أجهزة الاستشعار الرقائق المستخدمة لهذا التحليل هو هو مبين في الشكل 2. أجهزة الاستشعار المستخدمة لهذه التجارب تحتوي على رقائق 8. كل رقاقة تتضمن ثلاثة أقطاب: واحد العامل القطب والقطب مكافحة واحد وقطب مرجعي واحد. ويتم تنظيم هذه الرقائق 8 4 أزواج في أجهزة الاستشعار. لكل زوج، واحدة من الرقائق المسمى "-" يتوافق مع عنصر تحكم سلبيا، بينما الرقاقة المسمى "+" يتوافق مع العينة المختبرة.
ويمثل الرقم 3 وصف الإعداد التجريبية المستخدمة في هذا العمل الذي يجمع بين التكنولوجيا الهجينة β-lactamase إلى بيوسينسور فرق الجهد التخطيطي. في هذا الإعداد، يتم استخدام قطبين: قطب مرجعي ط) والثاني) قطب مغلفة بوليانيليني (المؤسسة). هو تمتز هول على مسرى المغلفة المؤسسة الوطنية للطفولة كما ورد في18،الدراسات الأخرى19. بعد كافية يغسل، بلاب-كاب-Lys3 (ل "+" المسمى رقائق) أو بلاب دون نانوبودي المدرج (ل "-" المسمى رقائق) يتم تطبيقها على أقطاب كهربائية. بعد إضافة بيتا-لاكتام (بينزيلبينيسيلين) على أقطاب كهربائية، يتم قياس التغيرات في الموصلية قطب كهربائي. وفي الواقع، يولد التحلل بيتا-لاكتام من β-lactamases إطلاق البروتونات؛ الذي أبدى لإنشاء تغييرات كبيرة في الموصلية قطب كهربائي مع وقت استجابة قصيرة جداً. فحوصات بيوسينسور قدم في الشكل 4 يشير إلى أن ربط بلاب-كاب-lys3 إلى هيول المعطل تداولها على مسرى الاتئماني يمكن الكشف عنها ورصدها بقياس إطلاق سراح بروتون الناجمة عن النشاط المعطل تداولها β-lactamase. وفي المقابل، تم الكشف عن أي فرق الموصلية عندما أجريت التجربة مع بلاب دون أي نانوبودي المدرج.
رقم 1: مخطط يمثل التفاعل البروتين تشيميريك بلاب-كاب-Lys3 مع هول- ويبين بلاب السماوي، Lys3 سيارة الأجرة في أورانج وهول باللون الأزرق. تم الحصول على هذا الرقم من خلال الجمع بين هياكل بلاب تريديمينسيونال (معرف PDB: 4BLM) ومجمع كاب-Lys3/هيول (معرف PDB: 1MEL). Β-lactamase يحتوي على مجالات 2: المجال α/β والمجال α، موقع حافز يقع في الواجهة بين المجالين. الحلقة المستخدمة للإدراج وأبرزت باللون الأصفر ويقع في حلقة المعرضة للمذيبات في المجال α. أجزاء الطرفي ن وجيم من أجرة Lys3 تظهر باللون الأحمر. الحلقة CDR3 من Lys3 سيارة الأجرة يجعل معظم جهات الاتصال مع موقع الحفاز هول. ربط Lys3 سيارة الأجرة لهول يعوق نشاطها الأنزيمي. هذا الرقم والنتائج المقدمة في هذه الوثيقة صدرت في أعمالنا السابقة العمل15. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: صورة من أجهزة الاستشعار المستخدمة في التجربة- كل أجهزة الاستشعار يتضمن مجموعة من رقائق الفردية 8. على كل شريحة، وهناك ثلاثة أقطاب: واحد العامل القطب وقطب إشارة قطب كهربائي أيون عداد. يتم توصيل الجزء المغطاة بالنحاس متعدد رقمية متصلة بكمبيوتر. تنظم رقائق الفردية كأزواج 4 حيث "-" رقائق مسماة أقطاب التحكم السلبي و "+" هي رقائق مسماة أقطاب عينة. يسمح هذا الإعداد replicates تجريبية مختلفة أو هول/β-lactamase تركيزات لفحصها في وقت واحد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التمثيل التخطيطي للإعداد التجريبية المستخدمة في أعمالنا بالانزيم بيوسينسور. وكان هول معطلة على مسرى مغلفة المؤسسة الوطنية للطفولة (بوليانيليني). ثم طبق البروتين تشيميريك بلاب-كاب-Lys3 على مسرى. النشاط المعطل تداولها β-lactamase، والتي تتحدد بقياس إطلاق البروتونات الناجمين عن طريق التحلل المائي ل benzylpenicillin، طرديا للتفاعل بين هول والبروتين تشيميريك. الحث على الإفراج عن بروتون التغييرات الموصلية الكهربائية التي يتم تحويلها إلى إشارة يمكن أن تفسر من قبل المستخدم. تطور الموصلية الفرق الملاحظ بين الاتئماني المغلفة ومسرى الإشارة كدالة للزمن. هذا الرقم والنتائج المقدمة في هذه الوثيقة صدرت في أعمالنا السابقة العمل15. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تمثيل رسومي كوندوكتيميتريك قياسات عرض محددة تفاعل بلاب-كاب-Lys3 لهول- يتم الإشارة إلى إضافة بينزيلبينيسيلين سهم. يؤدي هذا الاختلاف المحتملة من الإفراج عن بروتون التي تحدث عند التحلل المضادات الحيوية. وأجريت القياسات مع البروتين الهجين بلاب-كاب-Lys3 (أحمر) وبلاب β-lactamase الأصلية دون أي نانوبودي المدرج (أزرق)، كعنصر سلبي. منحنيات مختلفة تمثل قياسات مستقلة أجريت على شرائح مختلفة. هذا الرقم والنتائج المقدمة في هذه الوثيقة صدرت في أعمالنا السابقة العمل15. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا العمل نقدم طريقة فونكتيوناليزي نانوبودي استخدام بلاب β-lactamase بروتين الناقل ونظهر أن يمكن أن ننفذ البروتين الهجين الناتجة بنجاح في مقايسة استشعار فرق الجهد. الجانب الابتكار الرئيسي لعملنا مقارنة بغيرها فحوصات بيوسينسور هو اقتران التساهمية الجزء الأجسام المضادة للنشاط الأنزيمي الذي يولد الإشارة الكهربائية. ويعرض هذه التكنولوجيا الإدراج البروتين يسمى المزايا والقيود التي سوف يكون التركيز الرئيسي لهذا القسم.
مزايا التكنولوجيا β-lactamase الهجين.
Β-lactamases هي كفاءة الإنزيمات
واحدة من أهم البارامترات التي تؤثر على حساسية والإشارات إلى الضجيج نسبة بيوسينسور هو النشاط الأنزيمي المستخدمة لإنشاء الإشارة. وفي هذا السياق، β-lactamases يقدم العديد من المزايا: فهي الصغيرة (كاتشين إيتش تو ناين)، ومستقرة جداً، وأحادي، وأكثر الأهم من ذلك، يحمل عالية النشاط النوعي وارتفاع معدل دوران مقارنة بالأنزيمات الأخرى المستخدمة في فحوصات استشعار فرق الجهد مثل الجلوكوز أوكسيديز، أورياسي، lipase، الغلوثانيون أو الفوسفاتيز القلوية20. ولجميع هذه الأسباب، هي β-lactamases الإنزيمات الاختيار لفحوصات بيوسينسور مختلفة.
يمكن تحسين الإدراج المباشر إلى β-lactamase في إنتاج المحصول واستقرار المدرج البروتين/المجال.
أحد جوانب الحد من العديد من إيمونوسينسور فحوصات هو نوعية الأجسام المضادة المستخدمة في الكشف عن أكثر2(مثل الاستقرار والطهارة). في الوقت الراهن، نظم إنتاج منخفضة التكلفة للأجسام المضادة أو أجزاء جسم (مثل كولاي) تظل صعبة وغالباً ما تؤدي إلى البروتينات المجمعة مع ضعف القابلية للذوبان والاستقرار21. لدينا التكنولوجيا الهجينة β-lactamase، على ما يبدو، نهجاً جيدا للتغلب على هذه الصعوبات منذ أظهرنا سابقا أن هذه الاستراتيجية بتحسين الغلة التعبير والاستقرار في المجالات المدرجة البروتين14. على وجه الخصوص، في هذه الدراسة، باستخدام نظامنا β-lactamase الهجين، تشيميريك البروتين المسمى بلاب-كاب-Lys3 بنجاح أعرب عن في كولاي مع عائد جيد جداً (إيتش وان زيرو ملغ من البروتين النقي للتر الواحد للثقافة) وتنقيته للتجانس.
اقتران التساهمية بين الأضداد والانزيميه مويتيس يجعل فحوصات استشعار أرخص وأسرع
في إيمونوسينسورس التقليدية، يتطلب الكشف عن أكثر استخدام الأجسام المضادة الأولية التي هي معطلة على رقاقة الاستشعار. وفي وقت لاحق، جسم ثانوي الذي يقترن بإنزيم أو تحقيق مسمى مطلوب أيضا لتوليد إشارة قابلة لقياس. هذا النهج ينطوي على العديد من إينكوبيشنز وخطوات الغسيل ولذلك يمكن أن تكون مضيعة للوقت. وبالإضافة إلى ذلك، هذا البروتوكول مكلفة منذ عدة أجسام مطلوبة واقتران التساهمية بين الأجسام المضادة الثانوية وتحقيقا إنزيم ضروري أيضا. على النقيض من ذلك، يستخدم فقط بروتين هجين لكشف وتحديد أكثر نظامنا، والتالي يسمح في الوقت الحقيقي رصد دون استخدام الأجسام المضادة الثانوية.
وعلاوة على ذلك، من المهم ملاحظة أن إدخال المجال في فئة كان سيظهر β-lactamases لتوليد البروتينات المختلطة العارضة22،اللوستيريك مثل تبديل السلوك23. رموز التبديل هذه يمكن أن تجد العديد من التطبيقات في الاختبارات المستندة إلى بيوسينسور.
القيود المفروضة على تكنولوجيا β-lactamase الهجين.
القيود الناجمة عن هندسة البروتينات.
في هذا النظام، هي الصعوبة الرئيسية لتصميم والحصول على بروتين هجين بإدراج مجموعة جسم β-lactamase. يجب أن يكون هذا البروتين تشيميريك الناتجة عن بيفونكشونال: moiety الانزيمية يجب أن تظل قادرة على كفاءة يتحلمأ المضادات الحيوية بيتا لاكتام لتوليد إشارة كهربائية، بينما يجب ربط أكثر المستهدفة مع تقارب عالية moiety جسم و خصوصية. للحصول على البروتينات تشيميريك بيفونكشونال، معلمات مختلفة تحتاج إلى النظر فيها من أجل تجنب القيود الفراغية. النقطة الحرجة الأولى هو موقف الموقع الإدراج. على الرغم من أنه ثبت أن العديد من نقاط الإدخال هي25ممكن24،،26، الإدراج مواقف غالباً ما توجد في المذيبات تتعرض الحلقات بعيداً عن الموقع النشط من البروتين الناقل. وهذا يقلل من التغيرات المحتملة كونفورماشونال أو إعاقة الفراغية الناجمة عن البروتين المدرج. للأسباب نفسها، من المستحسن أيضا أن الموقع النشط من البروتين المدرج أن يقع بعيداً من موقع الإدراج بغية منع التعديلات لنشاطها. وأخيراً، سوف لن يتم التسامح إدراج بروتينات التي تمثل الأطراف مرونة أو المجاورة ن وج-محطة أفضل. في الواقع، الأطراف البعيدة وجامدة يمكن يفرض قيودا الفراغية على كلا الشريكين من البروتين تشيميريك، وهكذا تغيير أنشطة بيولوجية كل منهما. ولذلك، من المهم أن نذكر أن حجم البروتين المدرج له سوى أثر ضئيل على البروتين تشيميريك الناتجة. وفي الواقع، فقد ثبت أن المجالات الهيكلية الكبيرة يمكن إدراجها بنجاح في β-lactamases، ما دامت تلك الأطراف الطرفي ن وج مرنة أو قريبة من بعضها البعض13،14،2، 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29-في هذه الدراسة، يوجد موقع الإدراج في بلاب بعيداً عن موقعها النشط وقد نانوبودي المدرج طويلة نسبيا ومرونة الأطراف (غير مرئية في هيكل الأشعة السينية) التي تقع بعيداً عن باراتوبي. هذه الميزات محددة تكفل فرض الحد الأدنى من القيود الفراغية على الأسطح النشطة بيولوجيا لكلا الشريكين من البروتين الهجين. ومع ذلك، عندما لا يقدم البروتين إدراج المعايير الموصى بها للإدراج الأمثل في بروتين الناقل، من الممكن إلى مناطق رابط مهندس بغية خفض القيود الفراغية المحتملة. في الواقع، تبين وجود رابط مرنة (مثل الغليسين-سر التكرار) للاتصال الناقل والبروتين المدرج زيادة كبيرة في التسامح إزاء إدراج بروتينات كبيرة وتنظيما في ناقل أحد30 ،12.
القيود الملازمة الكهروكيميائية أجهزة استشعار العوامل البيولوجية-
على الرغم من أن تطوير أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية/فرق الجهد أصبح حقل المتنامية، وهذه الاختبارات قد القيود الهامة التي يلزم أخذها في الاعتبار عند تصميم التجربة بيوسينسور. أولاً، جميع أجهزة استشعار العوامل البيولوجية التي تنطوي على إطلاق سراح ح+ أو امتصاص تتطلب استخدام الحلول مخزنة ضعيفة جداً (أي < 5 مم)31 بغية قياس الاختلافات المحتملة كبيرة. يمكن أن يؤثر التباين درجة الحموضة التي يسببها عند الإفراج عنهم ح+ خصائص البروتين والنشاط الأنزيمي المستخدمة لإنشاء الإشارة. ثانيا، الأس الهيدروجيني وقوة الأيونية في بيوفلويدس يمكن أن تختلف بشكل ملحوظ وبالتالي يؤدي إلى تغيرات هامة في الاستجابة وزيادة الضوضاء الخلفية من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية32. وهذا هو السبب، حاولت مجموعات بحثية مختلفة لتطوير تكنولوجيات النانو لتقليل أحجام عناصر الاستشعار الكهروكيميائية بغية زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء للعمليات التي تحدث في واجهة الجهاز33، 34 , 35-نتيجة لذلك، من الممكن أيضا لتطوير جزيئات جسم المسمى مع عدة جزيئات الإنزيم نفسه لزيادة الإشارة الناجمة عن ربط جزيء واحد هدف32. ومع ذلك، على الرغم من هذه القيود، تظل أجهزة استشعار العوامل البيولوجية/كوندوكتوميتريك الأجهزة كفاءة عالية وحساسية مع حدود المقدرة للكشف (لودس) في المجموعة من 10-8 إلى 10-11 م36.
في هذه الدراسة، وقد أظهرنا أننا يمكن إدراج نجاح نانوبودي أن يتوجه هول إلى فئة A β-lactamase يدعى بلاب، واحتفاظ البروتين الهجين الذي تم إنشاؤه على الأنشطة البيولوجية على حد سواء: ط) ضيق ملزمة من هول والثاني) القدرة على يتحلمأ المضادات الحيوية بيتا لاكتام. وتشكل هذه الدراسة دليلاً على مفهوم الإدراج من مختلف أجزاء نانوبوديس أو جسم إلى بلاب وتنفيذ هذه التكنولوجيا الهجينة البروتين في فحوصات استشعار فرق الجهد. هذه التكنولوجيا يمكن يحتمل أن تستخدم للكشف عن مختلف البروتينات [ابيتوبس] وتنفيذها في العديد من الأدوات التشخيصية. وفي الواقع، بالتنمية والاستخدام الفعال لمثل هذه الاختبارات أصبحت حاسمة في مجتمعنا وهي أساسا مدفوعة بالاحتياجات الاجتماعية والاقتصادية لمنخفضة التكلفة وسهلة لتشغيل التكنولوجيات في مختلف المجالات مثل النظم الغذائية والصحية، لا سيما في البلدان النامية. وعلاوة على ذلك، تلعب تكنولوجيات النانو دوراً متزايد الأهمية في تطوير أجهزة الاستشعار هذه. في الوقت الحاضر، إشارة تجهيز التكنولوجيات المتوفرة على الأجهزة المحمولة مثل الهواتف الذكية، وأقراص والذكي مختلف التطبيقات موجودة بالفعل لمعالجة الإشارات37. على سبيل المثال، في الآونة الأخيرة، جهاز استشعار فرق الجهد قد أدمجت في الهاتف ذكي للسماح بتركيز الجلوكوز رصد38. خبراء الصحة واثقون من أن تصبح هذه الأجهزة المبتكرة نوعا من الحلول الصحية أكثر أهمية في السنوات المقبلة39،40.
وفي الختام، يمثل هذا العمل مثالاً يوضح إمكانات ومزايا التكنولوجيا الإدراج البروتين لدينا. ونأمل أن هذا العمل سوف يسهم في تطوير تكنولوجيات مبتكرة ومفيدة لأغراض طبية وبحثية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يعترف أصحاب المنطقة الفالونية لبلجيكا في إطار مشاريع البحوث سينسوتيم ونانوتيك وكذلك الوطنية الأموال للبحث العلمي (F.R.S.-F.N.R.S) لتقديم الدعم المالي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
- Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
- Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O'Kennedy, R. Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).
- Huston, J. S., et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).
- Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores. Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Sheriff, S., Constantine, K. L.
- Stijlemans, B., et al. Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm. J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).
- Thanongsaksrikul, J., et al. A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A. J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).
- Huang, L., et al. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).
- Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens. J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).
- Kojima, M., et al. Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules. Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).
- Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains. Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).
- Vandevenne, M., et al. The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments. Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).
- Vandevenne, M., et al. Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions. Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).
- Crasson, O., et al. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).
- Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications. Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).
- Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).
- Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline. Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).
- Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).
- Khatkhatay, M. I., Desai, M. A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).
- Worn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).
- Ostermeier, M. Engineering allosteric protein switches by domain insertion. Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).
- Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. Design of protein switches based on an ensemble model of allostery. Nat Commun. 6, 6968 (2015).
- Collinet, B., et al. Functionally accepted insertions of proteins within protein domains. J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).
- Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein. Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).
- Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).
- Ruth, N., et al. DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli. Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).
- Zervosen, A., et al. Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI). FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).
- Chevigne, A., et al. Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development. J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).
- Ke, W., et al. Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation. PloS One. 7, 39168 (2012).
- Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate. Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).
- D'Orazio, P. Biosensors in clinical chemistry. Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).
- Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection. Analyst. 134, 1601-1607 (2009).
- Ding, J., Wang, X., Qin, W. Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).
- Wang, X., et al. A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing. Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).
- Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures. Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).
- Bakker, E., Pretsch, E.
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).
- Nemiroski, A., et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).
- Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , Price Waterhouse Coopers. Commission, T.E (2013).
