Summary
이 작품에서는, 우리는 하이브리드 β-lactamase 기술에 따라 conductimetric 바이오 센서를 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용을 공부 하는 새로운 방법을 보고 합니다. 이 메서드는 β-lactams의 가수분해 시 양성자의 출시에 의존합니다.
Abstract
바이오 센서 병원 체 검출, 분자 진단, 환경 모니터링, 식품 안전 관리 등 다양 한 분야에서 점점 더 중요 하 고 구현 되 고 있다. 이러한 맥락에서 우리는 효율적인 기자 효소가 여러 단백질 단백질 상호 작용 연구로 β-lactamases를 사용. 또한, 강하게 펩 티 드 또는 구조적된 단백질/도메인의 삽입을 허용 하도록 그들의 능력 공상 단백질을 생성 하는이 효소의 사용을 권장 합니다. 최근 연구에서 우리 균 licheniformis BlaP β-lactamase에 단일 도메인 항 체 단편을 삽입. Nanobodies, 라고도 하는 이러한 작은 도메인 camelids에서 단일 체인 항 체의 항 원 묶는 도메인으로 정의 됩니다. 일반 이중 체인 항 체 처럼 그들은 높은 화력과 특이성 그들의 목표에 대 한 표시. 결과 공상 단백질 β-lactamase 활동을 유지 하면서 대상에 대 한 높은 선호도 전시. 이 nanobody 및 β-lactamase moieties 유지 기능 제안 합니다. 현재 작업에서 우리는 우리의 하이브리드 β-lactamase 시스템 바이오 센서 기술에 결합 하 여 상세한 프로토콜을 보고 합니다. 특정 바인딩 대상에 nanobody의 효소의 촉매 활동 발표 양성자의 conductimetric 측정 덕분에 검색할 수 있습니다.
Introduction
바이오 센서는 바이오 분자 상호 변환기1이라고 하는 물리적 또는 화학적 신호 장치를 결합 하는 분석 장치. 기록 된 신호 다음 해석 하 고 고정 및 무료 파트너 간의 상호 작용을 모니터링 변환할 수 있습니다. 바이오 센서의 대부분은 호르몬 등 다른 병원 체 마커2analytes를 검출 하는 항 체의 사용을 포함. 다른 센서 형식을 사용할 수 있습니다 하 고 질량, 자석, 광학 또는 전기 화학 바이오 센서를 포함 합니다. 후자는 가장 일반적으로 사용 되는 센서, 그리고 바인딩 이벤트를 전기 신호로 변환 하 여 작동. 공연 및 모든 항 체 기반 바이오 센서의 감도 기본적으로 두 개의 매개 변수에 강하게 의존: i)는 항 체와 ii)2신호 생성 하는 데 사용 하는 시스템의 속성의 품질.
항 체는 2 개의 무거운 사슬과 2 개의 가벼운 사슬 구성 높은 분자 질량 dimeric 단백질 (150-160 kDa). 빛과 무거운 사슬 사이 상호 작용은 주로 소수 성 상호 작용 보존된 이황화 결합에 의해 안정 된다. 각 체인에는 본질적으로 보완 결정 영역 (CDR1-2-3) 라는 3 하이퍼 영역을 통해 항 원와 상호 작용 하는 변수 도메인 포함 되어 있습니다. 필드, 낮은-비용 식 시스템 (예를 들면, 대장균) 전체 길이 항 체의 대규모 식에서에서 수많은 진보에도 불구 하 고 종종 불안정 하 고 집계 된 단백질의 생산에 지도 한다. 이 때문에 단일 체인 변수 조각3 (ScFvs ≈ 25 kDa)와 같은 다양 한 항 체 파편을 설계 되었습니다 있다. 그들은 각각 한 중 고 covalently는 합성 아미노산 서 열에 의해 연결 된 1 개의 경 쇄의 가변 도메인 구성 됩니다. 그러나,이 파편은 종종 가난한 안정성 표시 하 고 집계, 때문에 그들은 그들의 소수 성 영역 용4의 큰 부분을 노출 하는 경향이 있다. 이러한 맥락에서 단일 체인 camelid 항 체 단편, nanobodies 또는 VHHs, ScFvs에 대 한 우수한 대안을 것 같다. 이러한 도메인 camelid 단일 체인 항 체의 가변 도메인에 해당합니다. 기존의 항 체, 달리 camelid 항 체 경 쇄가 없는 고 두 무거운 체인5포함. 따라서, nanobodies는 가장 작은 단위체 항 체 파편 (12 kDa) 기존의 항 체6의 선호도와 항 원에 바인딩할 수 있습니다. 또한, 그들은 향상 된 안정성과 가용성 다른 전장 항 체 또는 항 체 파편에 비해 제시. 마지막으로, 그들의 작은 크기와 그들의 확장된 CDR3 루프 그들이 이상한 epitopes를 인식 하 고 효소 활성 사이트7,8바인딩할 수 있습니다. 요즘, 이러한 도메인 상당한 관심을 받고 있다 고 바이오 센서 기술에 결합 되었습니다. 예를 들어 황은 외. 탐지 및 정량화 인간 전립선 특정 항 원 (PSA)9의 nanobody 기반 바이오 센서를 개발 했습니다.
언급-위, 바이오 센서 분석에 중요 한 매개 변수는 전기 신호를 생성 하는 데 사용 하는 시스템의 효율성. 이러한 이유로, 효소 기반 전기 화학 바이오 센서 증가 관심을 받고 있다 고 건강 관리, 식품 안전, 환경 모니터링 등 다양 한 응용 프로그램에 대 한 널리 사용 되었습니다. 이 바이오 센서는 전기 신호를 생성 하는 효소에 의해 기판의 촉매 가수분해에 의존 합니다. 이러한 맥락에서 β-lactamases 더 구체적인, 더 과민 하 고 알칼리 성 인산 가수분해 효소 또는 양 고추냉이 과산화 효소10같은 많은 다른 효소 보다 실험적으로 구현 하기 더 쉬운 것 표시 했다. Β-lactamases 효소 그들을 hydrolyzing 하 여 β-락탐 항생제를 세균성 저항에 대 한 책임은 있습니다. 그들은 작은 크기의 단위체, 매우 안정, 효율적인, 그리고입니다. 또한, β-lactamases에 도메인/펩 티 드 삽입 생성 bi 기능 공상 단백질 단백질-리간드 상호작용을 연구 하는 효율적인 도구 표시 했다. 실제로, 최근 연구의 대상 항 원에 높은 선호도와 바인딩할 수 남아 공상 단백질에서 TEM1 β-lactamase 결과 항 체 변수 조각의 그 삽입을 나타났습니다. 흥미롭게도, 항 원 바인딩 TEM1 촉매 활동11,12의 allosteric 규칙 유도 표시 했다. 또한, 우리는 단백질 도메인 삽입 허용 루프에 균 licheniformis BlaP β-lactamase 단백질-리간드 상호작용13 모니터링 하는 기능 공상 단백질 생성 여러 연구에서 보였다 ,14. 우리는 최근 택시-Lys3, BlaP15이 허용 삽입 사이트에 명명 하는 nanobody를 삽입. 이 nanobody 암 탉 달걀 흰 lysozyme (HEWL)에 바인딩할 및16의 효소 활동 억제 하기 위해 표시 했다. 우리는 생성 된 하이브리드 단백질, BlaP-택시-Lys3, 라는 높은 특이성을 유지 / HEWL β-lactamase 활동 동안에 대 한 선호도 그대로 보였다. 그럼 우리가 성공적으로 β-lactamase 기술 하이브리드는 전기 화학 바이오 센서를 결합 하 여 생성 된 전기 신호 양을 했다 BlaP-택시-Lys3와 HEWL는 전극에 움직일 수 간의 상호 작용에 따라 다릅니다. 실제로, BlaP에 의해 β 락탐 항생제의 가수분해 양성자 방출 양적 전기 신호로 변환할 수 있는 유도 합니다. 이 조합은 전기 화학 바이오 센서와 하이브리드 β-lactamase 기술의 빠른, 민감한, 양적, 이며 생성 된 신호의 실시간 측정을 수 있습니다. 이 방법론은 여기 설명 되어 있습니다.
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Protocol
1. 단백질 샘플 준비
- 고 정화 하이브리드 단백질 BlaP-택시-Lys3로 우리의 이전 연구15에 보고 합니다. 50 m m 인산 버퍼 pH 7.4 다음 구성에서에서 단백질을 저장: 8 g의 NaCl, KCl의 0.2 g, 나2HPO4 의 1.44 g, KH2포4 증류수 800 mL에 용 해의 0.24 g 수정 전에 7.4 해결책의 pH 1 솔루션의 최종 볼륨을 조정 L. 필터 단백질 해결책 소독.
- 암 탉 달걀 흰 lysozyme (HEWL) 재고 솔루션을 준비 합니다. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS 단계 2.1.1 참조) 10 mL에 상업적으로 구입한 HEWL의 100 밀리 그램 (40000 단위/mg)을 분해. 0.22 μ m 휴즈와 필터를 사용 하 여 여과 하 여 단백질 해결책 소독.
2. 바이오 센서 분석 실험
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솔루션 및 버퍼 준비
- 8 g의 NaCl, KCl의 0.2 g, 나2HPO4, 1.44 g 및 KH2포4 증류수 800 ml에서의 0.24 g을 용 해 하 여 50 mM PBS를 준비 합니다. 1 나 필터를 소독 및 4 ° c.에 저장 솔루션의 볼륨을 조정 하기 전에 pH 7.4 1에 N HCl 또는 1 N NaOH 조정
- 카 제인의 위에서 설명한 대로 준비 하는 PBS의 100 ml에서의 3 g을 용 해 하 여 채도/차단 솔루션을 준비 (2.1.1 단계 참조). 필터를 소독 및 4 ° c.에 저장
- 카 제인의 위에서 설명한 대로 준비 하는 PBS의 100 ml에서의 1 g을 용 해 하 여 바인딩 솔루션 준비 (2.1.1 단계 참조). 필터를 소독 및 4 ° c.에 저장
- 세척 솔루션 준비 (0.1% 트윈-PBS) 위에서 설명한 대로 준비 하는 PBS의 100 mL에 트윈 20 (100%)의 100 μ를 추가 하 여 (2.1.1 단계 참조). 4 ° c.에 게
- 전극 준비 솔루션 준비 (1% 트라이 톤 X-100-PBS) 100 ml PBS 준비 위에서 설명한 대로의 트라이 톤 X-100 (100%)의 1 mL을 추가 하 여 (2.1.1 단계 참조). 4 ° c.에 게
- 최종 볼륨을 증류수에 KCl의 26 g을 용 해 하 여 전극 재생 솔루션 (3.5 M KCl) 준비 100 mL. 살 균 필터와 4 ° c.에 게
- 1 나 필터를 소독 및 4 ° c.에 저장의 최종 볼륨을 증류수에 NaCl의 0.29 g를 용 해 하 여 5 mM NaCl 솔루션을 준비 그런 다음, 5 mM NaCl 솔루션의 20 mL에 benzylpenicillin의 26.7 mg를 용 해 하 여 탐지 솔루션 (4 m m benzylpenicillin)를 준비 합니다. 필터를 소독 하 고-20 ° c.에 저장
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센서 준비 및 재생
참고:는 폴리아닐린 코팅 센서 칩 개발 하 고 친절 하 게 박사 P. Bogaerts, 닥터 미 유 누스 교수부터 Y. Glupczynski의 (가톨릭 대학교의 루 베인 라-브-추 몽-Godinne)에 의해 제공 되었다. 폴리아닐린 전기 합 프로토콜 이러한 센서를 합성 하는 데 사용 되는 센서의 설명 그들의 이전 일17에 자세히 나와 있습니다. 간단히,이 시스템은 고전 인쇄 회로 기판 (PCB) 기술에 의해 제조 된 8 개의 개별 칩의 재사용 가능한 센서를 사용 합니다. 개별 칩 3 개의 전극으로 구성 된 라운드 명소. 상위 1은 작업 전극은 폴리아닐린에 전기 합성 했다. 중간에 한 참조 전극 이며 하단 전극 구성 카운터 전극. 둘 다, 참조 및 카운터 전극은 기능성 탄소 레이어 위에 단단한 Ag/AgCl 혼합을 사용 하 여.- 3 세척 전극의 전극 준비 솔루션의 300 µ L/잘을 포함 하는 96 잘 접시의 우물에는 팁을 찍기 여 수행 (1% 트라이 톤 X-100-PBS, 참조 단계 2.1.5.). 실 온에서 부드러운 혼합으로 2 분 동안 각 세척을 수행 합니다.
- 실 온에서 부드러운 혼합으로 2 분 증류수의 300 µ L/잘을 포함 하는 96 잘 접시의 우물에는 팁을 찍기 하 여 전극 린스.
- 포함 하는 재생 솔루션의 300 µ L/잘 96 잘 접시의 우물으로 팁을 찍기 여 전극을 다시 생성 (3.5 M KCl, 단계 2.1.6 참조) 4 ° C 또는 실 온에서 1 h에서 하룻밤.
- 인산 염 버퍼 염 분의 300 µ L/잘을 포함 하는 96 잘 접시의 우물에는 팁을 찍기 하 여 전극의 3 세척을 수행 (2.1.1 단계를 참조 하십시오.). 실 온에서 부드러운 혼합으로 2 분 동안 각 세척을 수행 합니다.
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센서에 수행 분석 결과 바인딩
- 40 µ g/mL PBS에서 준비 하는 전극 표면에 HEWL의 15 µ L 드롭 입금 하 여 전극의 PANI (폴리아닐린) 표면 코트 HEWL. 4 ° C 또는 실 온에서 1 시간에서 밤새 품 어.
- 인산 염 버퍼 식 염 수와 전극의 3 개의 세척을 수행 (2.1.1 단계 참조) 포함 하는 인산 염 버퍼 염 분의 300 µ L/잘 96 잘 접시의 우물으로 센서 칩의 전극 부분을 찍기로. 실 온에서 부드러운 혼합으로 2 분 동안 각 세척을 수행 합니다.
- 50 µ L 방울 차단 솔루션을 추가 하 여 전극 포화 (단계 2.1.2 참조) 전극 표면에. 실 온에서 1 h에 품 어. 다음 단계 (단계 2.3.2 참조)는 이전에 설명 된 대로 세 번 세척.
- BlaP-택시-Lys3 솔루션 바인딩 솔루션에서 20 µ g/mL를 희석 (단계 2.1.3 참조) 15 µ L 방울 전극에 희석된이 솔루션을 적용. 실 온에서 10 분 동안 품 어. 항 원-nanobody 반응 후 세척 솔루션을 사용 하 여 이전 단계에서 세척을 3 번으로 설명 (2.1.4 단계 참조). 다음 한 번 PBS와 전극 린스 (2.1.1 단계 참조).
- 검색, 디지털 멀티 미터에 구리 회로 부분을 통해 센서 칩을 연결 합니다. 그런 다음 50 µ L 방울 탐지 솔루션을 적용 하 여 센서 응답 시작 (단계 2.1.7 참조) 긍정적인 전극에 적용 (단계 2.1.7 참조) 부정적인 전극에 NaCl 5mm 솔루션의 50 µ L 드롭. 실 온에서 30 분 동안 품 어. 디지털 멀티 미터와는 전도성을 모니터링 합니다.
참고:는 멀티 미터 박사 P. Bogaerts, 닥터 미 유 누스 교수부터 Y. Glupczynski의 (가톨릭 대학교의 루 베인 라-브-추 몽-Godinne에 의해 제공 된. 이 potentiostat 컴퓨터 USB 포트를 통해 제어 하 고 동시에 센서의 8 개의 서로 다른 칩을 분석 합니다. 유 누스와 동료17 에 의해 만들어진 소프트웨어는 실시간 플롯 시간에 대 한 참조 및 샘플 전극의 전도도 차이의 측정을 나타내는 만듭니다.
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Representative Results
설계 및 엔지니어링의 공상 단백질 BlaP-택시-Lys3
그림 1 균 licheniformis에서 BalP 클래스 A β-lactamase의 관대 한 루프에 택시 Lys3의 삽입을 나타냅니다. 삽입은 잔류물 Asp198와 Lys199 사이 수행 되었다. 트 롬 빈 분열 사이트 택시-Lys3의 각 측면에 도입 되었다. BlaP-택시-Lys3 공상 단백질 인코딩 구성 식 플라스 미드와 변형 세포 암 피 실린의 작은 농도 면 전에 서 성장 할 수 있었다. 이 결과 하이브리드 β-lactamase 제대로 접혀, 수용 성 이다 그것은 효율적으로 암 피 실린에 대 한 저항을 제공할 수 있는 박테리아의 periplasmic 공간으로 성공적으로 배설 될 수 있음을 나타냅니다. 우리는 더욱 우리의 공상 단백질의 bifunctionality 분석. 우리의 이전 연구에서 보고, 우리의 데이터는 공상 단백질의 택시 Lys3 moieties로 서 β-lactamase 유지 그들의 생물 학적 활동15보여주었다.
Conductimetric 바이오 센서 분석 결과
센서 칩이 분석이 결과 대 한 사용 그림 2에 표시 됩니다. 이 실험에 사용 되는 센서 포함 8 칩. 각 칩 포함 3 개의 전극: 1 개의 작업 전극, 하나의 카운터 전극과 참조 전극. 이러한 8 칩 센서에 4 쌍으로 구성 됩니다. 각 쌍에 대 한 칩 중 하나 라는 "-" 칩 표시 "+" 테스트 샘플에 해당 하는 반면, 부정적인 컨트롤에 해당.
그림 3 하이브리드 β-lactamase 기술 potentiometric 바이오 센서를 결합 하 여이 작업에 사용 되는 실험적인 체제의 개요 설명을 나타냅니다. 이 설정에서 두 전극 사용 된다: i) 참조 전극 및 ii)는 폴리아닐린 (PANI) 코팅된 전극. 다른 연구18,19에 보고 HEWL PANI 코팅된 전극에 흡착 됩니다. 적절 한 세척, BlaP-택시-Lys3 후 (대 한 "+" 칩을 표시) 또는 삽입된 nanobody 없이 BlaP (대 한 "-" 표시 칩) 전극에 적용 됩니다. 전극에 β-락탐 (benzylpenicillin)의 추가 따라 전극 전도도에 변화 측정 됩니다. 실제로, β-락탐 가수분해 β lactamases에 의해 생성 양성자;의 릴리스 전극 전도도 매우 짧은 응답 시간에 큰 변화를 만들 표시 했다. 그림 4에 제시 하는 바이오 센서 분석 BlaP-택시-lys3 HEWL PANI 전극에 움직일에 바인딩 감지 되 고 양성자 릴리스 고정된 β-lactamase 활동에서 결과 측정 하 여 모니터링 될 수 있습니다 나타냅니다. 반면, 실험 어떤 삽입된 nanobody 없이 BlaP와 함께 수행한 때 계수 차이가 발견 되었다.
그림 1: HEWL와 공상 단백질 BlaP-택시-Lys3 상호 작용을 나타내는 체계. BlaP은 하늘색, 주황색에서 택시-Lys3 및 HEWL 파란색에서에 표시 됩니다. 이 그림은 BlaP의 유행 구조를 결합 하 여 얻은 (PDB ID: 4BLM) 택시-Lys3/HEWL 복잡 한 (PDB ID: 1MEL). Β-lactamase 포함 2 도메인: α/β 도메인 및 α 도메인, 촉매 사이트는 두 도메인 간의 인터페이스. 루프 삽입에 사용 되는 노란색으로 강조 표시 이며 α 도메인에서 용 매에 노출 된 루프에 있는. 택시-Lys3의 N와 C 맨끝 부분 빨간색으로 표시 됩니다. 택시-Lys3의 CDR3 루프 HEWL 촉매 사이트와 연락처의 대부분은. 택시-Lys3 HEWL에의 바인딩 그것의 효소 활동을 억제. 이 수치와 결과 여기 발표 이전 작업15에 출판 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 실험에 사용 되는 센서의 사진. 각 센서 8 개별 칩의 그룹을 포함합니다. 각 칩에는 3 개의 전극: 1 개의 작업 전극, 기준 전극과 카운터 이온 전극. 구리 덮인 부분 디지털 멀티 미터는 컴퓨터에 연결 된 연결입니다. 개별 칩 4 쌍으로 구성 됩니다 어디에 "-" 레이블이 칩은 부정적인 제어 전극과 "+" 레이블이 칩은 샘플 전극. 다른 실험적인 복제 또는 HEWL이이 설치 수 / β-lactamase 농도를 동시에 테스트할 수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 우리의 바이오 센서 분석 결과에서 사용 하는 실험적인 체제의 도식 대표. HEWL는 PANI (폴리아닐린) 코팅된 전극에는 움직일 수 있었다. 공상 단백질 BlaP-택시-Lys3는 전극에 적용 했다. Benzylpenicillin의 가수분해에 의해 유도 된 양성자의 릴리스를 측정 하 여 결정 되는 고정된 β-lactamase 활동은 HEWL와 공상 단백질 간의 상호 작용에 직접 비례 합니다. 양성자 출시 사용자가 해석 될 수 있는 신호 변환 되는 전기 전도도 변화를 유도 합니다. 시간의 기능으로 코팅 PANI와 참조 전극 사이 관찰 전도도 차이의 진화. 이 수치와 결과 여기 발표 이전 작업15에 출판 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 그래픽 표현의 conductimetric HEWL에 BlaP-택시-Lys3의 특정 상호 작용을 보여주는 측정. Benzylpenicillin의 추가 화살표로 표시 됩니다. 이 전위차는 항생제가 수 분해 시 발생 하는 양성자 방출에서 결과. 측정은 부정적인 컨트롤로 하이브리드 단백질 BlaP-택시-Lys3 (빨강)와 모든 삽입 된 nanobody (블루) 없이 네이티브 β-lactamase BlaP 수행 했다. 다른 곡선 다른 칩에 수행 하는 독립적인 측정을 나타냅니다. 이 수치와 결과 여기 발표 이전 작업15에 출판 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 작품에서는 캐리어 단백질으로 BlaP β-lactamase를 사용 하 여 nanobody를 functionalize 하는 방법을 소개 하 고 우리는 우리가 성공적으로 구현할 수 결과 하이브리드 단백질 potentiometric 센서 분석 결과 보여. 다른 바이오 센서 분석 실험에 비해 우리의 작업의 주요 혁신 측면은 전기 신호를 생성 하는 효소 활동을 항 체 부분의 공유 결합. 이 소위 단백질 삽입 기술 선물 장점과 한계가이 섹션의 주요 초점이 될 것입니다.
하이브리드 β-lactamase 기술의 장점입니다.
Β-lactamases는 효율적인 효소
감도는 바이오 센서의 신호 대 잡음 비율에 영향을 주는 가장 중요 한 매개 변수 중 하나는 신호를 생성 하는 데 사용 하는 효소 활동입니다. 이러한 맥락에서 β-lactamases 여러 장점을 제시: 그들은 작은 (≈29 kDa), 단위체, 매우 안정, 그리고 더 중요 한 것은, 높은 특정 활동 및 포도 당 등 potentiometric 센서 분석 실험에서 사용 하는 다른 효소에 비해 높은 매출을 전시 산화 효소, urease, 리 파 제, peroxydase 또는 알칼리 성 인산 가수분해 효소20. 모든 이러한 이유로, β-lactamases는 다양 한 바이오 센서 분석 실험에 대 한 선택의 효소.
Β-lactamase를 직접 삽입 생산 수율 및 삽입 된 단백질/도메인의 안정성을 높일 수 있습니다.
많은 immunosensor 분석 실험의 제한 측면 중 하나는 분석2를 검색 하는 데 사용 하는 항 체의 품질 (예: 안정성, 순도)입니다. 현재, 항 체 또는 항 체 파편 (예: 대장균)의 저비용 생산 시스템 도전 남아 고 종종 집계 단백질 불 쌍 한 용 해도와 안정성21. 우리의 하이브리드 β-lactamase 기술 이후 이전 살펴보았습니다이 전략 식 수율 및 삽입 된 단백질 도메인14의 안정성을 향상 시킵니다 이러한 어려움을 극복 하기 위해 좋은 방법이 될 것으로 보인다. 특히, 우리의 하이브리드 β-lactamase 시스템을 사용 하 여 현재 연구에서 BlaP-택시-Lys3 라는 공상 단백질 성공적으로 매우 좋은 수익률 (문화의 리터 당 순수 단백질의 ≈10 mg) 대장균 에 표현 되었고 동질성을 정화.
항 체와 효소 moieties 간의 공유 결합은 저렴 하 고 빠른 센서 분석 실험
기존의 immunosensors는 분석의 감지 센서 칩에는 움직일 수 있는 1 차 항 체의 활용을 합니다. 그 후, 효소 또는 레이블이 프로브에 결합 된 이차 항 체 또한 측정 신호를 생성 하기 위해 필요 합니다. 이 방법은 여러 외피와 세척 단계를 포함 하 고 따라서 시간이 소요 될 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 여러 항 체는 필요 때문에 이차 항 체와 효소/프로브 간의 공유 결합은 또한 필요한 비싼. 대조적으로, 우리의 시스템만 사용 하 여 하이브리드 단백질 검출 및 분석, 계량 하며 따라서 실시간 2 차 항 체를 사용 하지 않고 모니터링
또한, 그것은 β lactamases allosteric 스위치 처럼 동작22,23전시 하이브리드 단백질 생성을 표시 했다 클래스에는 도메인 삽입을 주의 하는 것이 중요. 이러한 스위치는 바이오 센서 기반 분석 실험에 수많은 응용 프로그램을 찾을 수 있습니다.
하이브리드 β-lactamase 기술의 제한입니다.
단백질 공학에 의해 유도 된 제한입니다.
이 시스템에서 주요 어려움은 디자인 하 고 β-lactamase에 항 체 moiety를 삽입 하 여 하이브리드 단백질을 얻을. 이 결과 공상 단백질 bifunctional 되어야 합니다: 효소 moiety 항 체 moiety 높은 선호도와 타겟된 분석에 바인딩해야 하는 반면 전기 신호를 생성 하는 β-락탐 항생제를 효율적으로 hydrolyse 할 수 있어야 하 고 특이성입니다. Bifunctional 공상 단백질을 얻기 위해 다양 한 매개 변수 입체 제약을 피하기 위하여 고려 될 필요가 있다. 첫 번째 중요 한 포인트는 삽입 사이트의 위치입니다. 여러 삽입 포인트는 가능한24,25,표시 되었습니다 비록26, 삽입 위치 용 매에 있는 자주 노출 루프 캐리어 단백질의 활성 사이트에서 멀리 떨어져. 이 잠재적인 구조적 변경 또는 삽입 된 단백질에 의해 유도 된 입체 방해를 최소화 합니다. 같은 이유로 그것은 또한 것이 좋습니다는 삽입 된 단백질의 활성 사이트 위치 멀리 삽입 사이트에서 활동의 변경 방지 하기 위해. 마지막으로, 유연한 또는 이웃 N-와 C-터미널 사지를 제시 하는 단백질의 삽입은 더 용납 될 것입니다. 실제로, 먼 및 엄밀한 사지 두 파트너에서 모두 공상 단백질의 입체 제약을 부과 하 고 따라서 그들의 각각 생물 학적 활동을 변경할 수 있습니다. 따라서, 그것은 삽입 된 단백질의 크기는 결과 공상 단백질에 작은 영향만을 언급 하는 것이 중요입니다. 실제로, 그것은 보였다 그 큰 구조적된 도메인 성공적으로에 삽입할 수 있는 β-lactamases, 자신의 N-C 터미널 사지는 유연으로 또는 서로13,14,2, 에 가까운 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29. 현재 연구에서 BlaP에 삽입 사이트는 그것의 활동적인 위치에서 멀리 떨어져 위치와 삽입 된 nanobody는 비교적 길고 유연한 사지 (x-선 구조에 표시 되지 않음)는 paratope에서 멀리 떨어져 있는. 이러한 특정 기능 확인 최소한의 입체 제약 하이브리드 단백질의 두 파트너의 생물 학적 활성 표면에 적용 됩니다. 그러나 때 삽입 된 단백질 팬 들은 캐리어 단백질으로 최적의 삽입에 대 한 권장된 기준의 정보를 표시 하지 않습니다, 그것 가능 하다 엔지니어 링커 지구에 잠재적인 입체 제약을 낮추기 위하여. 실제로, 캐리어를 연결 하는 유연한 링커 (예: Gly-Ser 반복) 및 삽입 된 단백질의 존재 하나30 캐리어에 크고 구조 단백질의 삽입으로 공차를 극적으로 증가 표시 했다 ,12.
전기 화학에 내재 된 한계 바이오 센서.
비록 전기/potentiometric 바이오 센서의 개발 적 성장 분야 되고있다,이 분석 실험 바이오 센서 실험을 설계할 때 고려해 야 할 중요 한 제한이 있다. 첫 번째, 매우 약하게 버퍼 솔루션의 사용을 필요로 하는 H+ 릴리스 또는 통풍 관을 포함 하는 모든 바이오 센서 (즉, < 5mm) 중요 한 잠재적인 차이 측정 하기 위해31 . H+ 출시에 따라 유도 pH 변화 단백질 속성 및 신호를 생성 하는 데 사용 하는 효소 활동 영향을 줄 수 있습니다. 둘째, pH, 이온 강도 biofluids에 수 크게 다 따라서 응답에서 중요 한 변화 귀착되 고 바이오 센서32의 배경 잡음을 증가. 이런 이유로, 다양 한 연구 그룹 장치33, 의 인터페이스에서 발생 하는 프로세스에 대 한 신호 대 잡음 비율을 증가 하기 위하여 전기 화학 센서의 크기를 줄이려면 나노기술 개발 하려고 34 , 35. 결과적으로, 그것은 또한 그것의 대상32를 한 분자의 바인딩에서 발생 하는 신호를 증가 하는 동일한 효소의 여러 분자와 함께 표시 하는 항 체 분자를 개발할 수. 그러나, 이러한 한계에도 불구 하 고 conductometric/바이오 센서 매우 효율적이 고 민감한 장치 10-8 10-11 M36의 범위에서 탐지 (Lod)의 예상된도를 유지.
이 연구에서 우리가 나타났습니다 우리가 성공적으로 HEWL, BlaP 라는 클래스 A β-lactamase에 대상 nanobody를 삽입할 수 있습니다 생성 된 하이브리드 단백질 모두 생물 학적 활동을 유지: HEWL 및 hydrolyse을 ii) 용량 i) 꽉 바인딩 Β-락탐 항생제입니다. 이 연구는 BlaP로 다양 한 nanobodies 또는 항 체 파편의 삽입 및 potentiometric 센서 분석 실험이 하이브리드 단백질 기술의 구현에 대 한 개념 증명을 구성합니다. 이 기술은 잠재적으로 다양 한 단백질 epitopes를 감지 하는 데 사용 하 고 다양 한 진단 도구에 구현 된 수 있습니다. 실제로, 개발 하 고 이러한 분석의 효과적인 사용 우리 사회에서 중요 한 되 고는 기본적으로 저렴 한 비용에 대 한 사회적, 경제적 요구에 의해 구동 하 고 특히 음식과 건강 시스템 등 다양 한 분야의 기술이 운영 하 게 쉬운 개발 도상 국가입니다. 또한, 나노는 증가에 역할 같은 센서의 개발. 요즘, 신호 처리 기술 신호 처리37스마트폰 및 태블릿과 다른 스마트폰 응용 프로그램에 이미 같은 휴대용 장치에서 사용할 수 있습니다. 예를 들어 최근, potentiometric 센서 장치 모니터링38포도 당 농도 허용 하는 스마트폰으로 통합 되었습니다. 건강 전문가 들은 이러한 종류의 혁신적인 장치 오는 년39,40에서 더 중요 한 건강 솔루션을 될 것입니다 확신 합니다.
결론적으로,이 작품은 우리의 단백질 삽입 기술의 장점과 잠재력을 보여 주는 예제를 나타냅니다. 우리는이 작품 연구 및 의료 목적을 위한 혁신적이 고 유용한 기술 개발에 기여할 것입니다 바랍니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 SENSOTEM 및 NANOTIC 연구 프로젝트의 프레임 워크 내에서 벨기에의 왈 롱 지역 뿐만 아니라 국가 자금에 대 한의 과학 연구 (F.R.S.-F.N.R.S) 그들의 재정 지원에 대 한 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
- Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
- Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O'Kennedy, R. Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).
- Huston, J. S., et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).
- Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores. Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Sheriff, S., Constantine, K. L.
- Stijlemans, B., et al. Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm. J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).
- Thanongsaksrikul, J., et al. A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A. J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).
- Huang, L., et al. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).
- Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens. J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).
- Kojima, M., et al. Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules. Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).
- Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains. Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).
- Vandevenne, M., et al. The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments. Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).
- Vandevenne, M., et al. Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions. Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).
- Crasson, O., et al. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).
- Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications. Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).
- Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).
- Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline. Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).
- Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).
- Khatkhatay, M. I., Desai, M. A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).
- Worn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).
- Ostermeier, M. Engineering allosteric protein switches by domain insertion. Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).
- Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. Design of protein switches based on an ensemble model of allostery. Nat Commun. 6, 6968 (2015).
- Collinet, B., et al. Functionally accepted insertions of proteins within protein domains. J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).
- Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein. Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).
- Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).
- Ruth, N., et al. DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli. Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).
- Zervosen, A., et al. Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI). FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).
- Chevigne, A., et al. Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development. J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).
- Ke, W., et al. Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation. PloS One. 7, 39168 (2012).
- Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate. Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).
- D'Orazio, P. Biosensors in clinical chemistry. Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).
- Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection. Analyst. 134, 1601-1607 (2009).
- Ding, J., Wang, X., Qin, W. Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).
- Wang, X., et al. A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing. Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).
- Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures. Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).
- Bakker, E., Pretsch, E.
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).
- Nemiroski, A., et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).
- Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , Price Waterhouse Coopers. Commission, T.E (2013).
