Summary
בעבודה זו, אנו מדווחים על שיטה חדשה ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות ביוסנסור conductimetric מבוסס על טכנולוגיית β לקטמאז היברידית. שיטה זו מתבססת על שחרורו של פרוטונים על הידרוליזה של β-lactams.
Abstract
ביולוגיים הם הופכים יותר ויותר חשובה ולא יושם בתחומים שונים כגון זיהוי הפתוגן, אבחון מולקולרי, ניטור סביבתי, בקרת בטיחות מזון. בהקשר זה, השתמשנו β-lactamases כמו אנזימים כתב יעיל במספר מחקרים אינטראקציית חלבון-חלבון. יתר על כן, יכולתם לקבל הוספות של פפטידים או חלבונים מובנים/תחומים מאוד מעודדת את השימוש של אנזימים אלה כדי ליצור חלבונים chimeric. במחקר שנערך לאחרונה, אנחנו המוכנסים קטע תחום אחד נוגדן Bacillus licheniformis פדרליין β לקטמאז. אלה תחומים קטן, שנקרא גם nanobodies, מוגדרים על התחומים אנטיגן-איגוד של נוגדנים שרשרת אחת של גמליים. כמו נוגדנים שרשרת כפולה משותפת, הם מראים הזיקות גבוהה ו- specificities עבור המטרות שלהם. החלבון chimeric וכתוצאה מכך הציג משיכה גבוה נגד המטרה שלו תוך שמירה על הפעילות β לקטמאז. הדבר מצביע על כי nanobody וβ לקטמאז moieties נשארים פונקציונליים. בשנת העבודה הנוכחית, מדווחים פרוטוקול מפורט המשלבת למערכת שלנו β לקטמאז היברידית הטכנולוגיה ביוסנסור. הכריכה ספציפי של nanobody למטרה שלה ניתן להבחין בזכות יחידת מידה conductimetric הפרוטונים שפורסמו על ידי פעילות קטליטית של האנזים.
Introduction
ביולוגיים הם התקנים המשלבים של אינטראקציה ביו-מולקולרי עם התקני איתות פיזי או כימי המכונה מתמרים1. האותות מוקלטות יכול להיות לאחר מכן לפרש, המרה כדי לנטר את האינטראקציות בין בני הזוג קיבוע וחופשי. רוב ביולוגיים לערב את השימוש נוגדן לזהות analytes כגון הורמונים או סמנים הפתוגן שונים2. תבניות שונות חיישן יכול לשמש וכוללים ביולוגיים מבוססי-מסה, מגנטי, אופטי או אלקטרוכימי. האחרון בין הנפוץ ביותר בשימוש חיישנים, הפונקציה על-ידי המרת אירוע מחייב אות חשמלי. הופעות של רגישויות של כל נוגדן מבוססי ביולוגיים תלויים חריפה בעיקרו של דבר שני פרמטרים: i) האיכות של הנוגדן ומאפיינים ii) של מערכת המשמשת ליצירת אות2.
נוגדנים הם חלבונים dimeric מסה גבוהה-מולקולרית (150-160 kDa) המורכבות שתי שרשראות כבדות, שתי שרשראות אור. האינטראקציה בין הרשתות קל וכבד בעיקר מיוצב על ידי אינטראקציות הידרופוביות, כמו גם קשר דיסולפידי ההכפלה. בכל שרשרת כולל תחום משתנה אינטראקציה עם אנטיגן בעיקרו באמצעות שלושה אזורים hypervariable בשם משלימים קביעת אזורים (CDR1-2-3). למרות רבים בשטח, הביטוי בקנה מידה גדול של נוגדנים באורך מלא עם מערכות ביטוי נמוכים (למשל, e. coli) מובילה לעיתים קרובות לייצור של חלבונים לא יציב, צבורים. זו הסיבה מקטעי נוגדנים שונים יש מהונדס כגון משתנה יחיד-שרשרת קטעים3 (ScFvs ≈ 25 kDa). הם מורכבים של התחומים משתנה בהתאמה אחד כבד, שרשראות אור אחד אשר covalently מקושרים על ידי רצף חומצות אמיניות סינתטי. עם זאת, קטעים אלה לעתים קרובות להציג יציבות המסכן, יש נטייה לצבור, שכן הם חושפים חלק גדול של אזורים הידרופוביות שלהם עד הממס4. בהקשר זה, שרשרת יחיד גמליים נוגדן שברים, המכונה nanobodies או VHHs, נראה מצוין חלופות ScFvs. תחומים אלה תואמים התחומים משתנה של גמליים יחיד-שרשרת נוגדנים. בניגוד קונבנציונאלי נוגדנים, נוגדנים גמליים נטולי שרשראות אור, להכיל רק שתי שרשראות כבדות5. לכן, nanobodies הן הקטן נוגדן monomeric השברים (12 kDa) מסוגל לקשור אנטיגן עם זיקה דומה לזה של נוגדנים קונבנציונאלי6. בנוסף, הם מציגים יציבות משופרת, המסיסות בהשוואה נוגדנים באורך מלא או חלקי נוגדנים אחרים. לבסוף, שלהם בגדלים קטנים ולולאות CDR3 המורחבת שלהם מאפשרות להם לזהות epitopes נסתר, לאגד אנזים אתרים פעילים7,8. כיום, תחומים אלה מקבלים תשומת לב רבה, כבר בשילוב ביוסנסור לטכנולוגיה. לדוגמה, הואנג ואח. פיתחו של ביוסנסור nanobody מבוסס זיהוי, כימות של האנושי אנטיגן ספציפי הערמונית (PSA)9.
כמו שהוזכר-לעיל, הוא פרמטר חשוב במבחני ביוסנסור היעילות של המערכת המשמש ליצירת האות החשמלי. מסיבה זו, מבוססת אנזים ביולוגיים אלקטרוכימי משכו תשומת לב ההולכת וגדלה, היו בשימוש נרחב ליישומים שונים כגון בריאות, בטיחות המזון, וכן ניטור סביבתי. ביולוגיים אלה מסתמכים על הידרוליזה קטליטי של מצע על ידי אנזים כדי להפיק את האות החשמלי. בהקשר זה, β-lactamases הראו להם להיות יותר ספציפי, יותר רגיש, המאיצה השפעול יותר אנזימים רבים אחרים כגון phosphatase אלקליין או חזרת peroxidase10. Β-lactamases הם אנזימים שאחראים על עמידות חיידקים לאנטיביוטיקה β-לקטם מאת hydrolyzing אותם. הם monomeric, יציב מאוד, יעיל, בגודל קטן. יתר על כן, תחום/פפטיד הוספות לתוך β-lactamases ליצור חלבונים chimeric bi-פונקציונליים, כי הוצגו להיות כלי יעיל ללמוד אינטראקציות חלבון-ליגנד. ואכן, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו את ההכנסה של נוגדן קטעים משתנה לתוך TEM1 β לקטמאז התוצאות בחלבון chimeric הנשאר מסוגל לקשור עם זיקה גבוהה אנטיגן היעד שלה. מעניין, האיגוד אנטיגן הוצגה לזירוז אלוסטריה TEM1 פעילות קטליטית11,12. יתר על כן, אנחנו הראו מספר מחקרים כי חלבון תחום החדרת לתוך לולאה מתירני Bacillus licheniformis אייריש β לקטמאז מייצר חלבונים chimeric תפקודית מותאמים גם לפקח על אינטראקציות חלבון-ליגנד13 ,14. אנחנו לאחרונה נוסף nanobody, בשם המונית-Lys3, לתוך אתר זה ההכנסה ולקוד של אייריש-15. Nanobody זו הוצגה כדי לאגד חן-ביצה-לבן ליזוזים (HEWL), כדי לעכב את פעילות אנזימטי16. הראינו כי החלבון שנוצר היברידית, בשם אייריש-מונית-Lys3, נשמר ירידה לפרטים גבוה / זיקה נגד HEWL בעוד הפעילות β לקטמאז נותרה ללא שינוי. ואז אנו בהצלחה לשלב את הטכנולוגיה β לקטמאז היברידית ביוסנסור אלקטרוכימי, הראה כי כמות אות חשמלי שנוצר היה תלוי של האינטראקציה בין אייריש-מונית-Lys3 ו- HEWL ותשמרו על אלקטרודה. אכן, הידרוליזה של אנטיביוטיקה β lactam על ידי פדרליין גורם לשחרור פרוטון זה ניתן להמיר אות חשמלי כמותית. שילוב זה של הטכנולוגיה β לקטמאז היברידית עם ביוסנסור אלקטרוכימי מהיר, רגיש, כמותיים, ומאפשר בזמן אמת המידה של האות שנוצר. מתודולוגיה זו מתואר בזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. חלבון הכנת הדוגמא
- לייצר ולטהר את החלבון היברידית אייריש-מונית-Lys3 כפי שדווח המחקר הקודם שלנו15. לאחסן את החלבון ב- 50 מ מ פוספט מאגר pH 7.4 עם ההרכב הבא: 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם אשלגן כלורי, g 1.44 של Na-2-HPO-4 ו- g 0.24 של ח'2PO4 מומס 800 מ ל מים מזוקקים לתקן את ה-pH של התמיסה על 7.4 לפני כוונון עוצמת הקול הסופי של הפתרון 1 ל' מסנן לעקר את הפתרון חלבון.
- הכנת תרנגולת חלבון ביצה ליזוזים (HEWL) מניות פתרון. להמיס 100 מ ג (40,000 יחידות/mg) HEWL מסחרית שנרכש ב- 10 מ ל תמיסת מאגר פוספט (PBS ראה שלב 2.1.1). לחטא את הפתרון חלבונים על ידי סינון באמצעות מסננים עם ניתוק 0.22 μm.
2. ביוסנסור מבחני
-
פתרון ומאגר הכנה
- להכין 50 מ"מ PBS על ידי המסת 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם אשלגן כלורי, g 1.44 של Na-2-HPO-4ו- 0.24 גר'2פו ח'4 ב- 800 מ ל מים מזוקקים. להתאים את ה-pH 7.4 עם 1 N HCl או 1 N NaOH לפני כוונון עוצמת הקול של הפתרון 1 ל' מסנן לחטא ולאחסן ב 4 º C.
- להכין פתרון חוסם/הרוויה על ידי המסת 3 גר' קזאין hydrolysate ב 100 מ של PBS שהוכן כפי שתואר לעיל (ראה שלב 2.1.1). מסנן לחטא ולאחסן ב 4 º C.
- להכין פתרון הכריכה על ידי המסת 1 גר' קזאין hydrolysate ב 100 מ של PBS שהוכן כפי שתואר לעיל (ראה שלב 2.1.1). מסנן לחטא ולאחסן ב 4 º C.
- להכין פתרון כביסה (0.1% Tween - PBS) על-ידי הוספת μL 100 Tween 20 (100%) ב- 100 מ של PBS שהוכן כפי שתואר לעיל (ראה שלב 2.1.1). חנות ב 4 º C.
- להכין פתרון הכנה אלקטרודה (1% טריטון X-100-PBS) על-ידי הוספת 1 מ"ל של טריטון X-100 (100%) ב- 100 מ של PBS שהוכן כפי שתואר לעיל (ראה שלב 2.1.1). חנות ב 4 º C.
- להכין פתרון התחדשות אלקטרודה (3.5 מ' אשלגן כלורי) על ידי המסת 26 גרם של אשלגן כלורי במים מזוקקים לאמצעי אחסון סופי 100 מ ל. לסנן סטיריליים ולאחסן ב 4 º C.
- להכין 5 מ מ NaCl פתרון על ידי המסת 0.29 גר' NaCl במים מזוקקים ליצירת נפח סופי של 1 ל' מסנן לחטא ולאחסן ב 4 º C. לאחר מכן, להכין פתרון זיהוי (4 מ מ benzylpenicillin) על ידי המסת 26.7 מ"ג של benzylpenicillin ב- 20 מ של 5 מ מ פתרון NaCl. מסנן לחטא ולאחסן ב-20 ° C.
-
חיישן הכנה והתחדשות
הערה: polyaniline מצופה חיישן שבבי היו פיתח, יצר לנוחיותנו על ידי ד ר ע' Bogaerts, יונוס ס ד ר פרופסור י' Glupczynski של (הקתולית האוניברסיטה בלוביין-לה-ניובה - צ'ו מונט-Godinne). התיאור של החיישן, כמו גם polyaniline אלקטרו-הפילמור בפרוטוקולים המשמשים לסנתז חיישנים אלה מפורטים ב- עבודה קודמת שלהם17. בקיצור, מערכת זו משתמשת חיישני מחדש שמיש של שבבי בודדים שמונה שיוצרו בטכניקות קלאסיות מעגל מודפס לוח (PCB). שבבי בודדים המורכבות שלוש אלקטרודות סביב נקודות. והעליונה היא האלקטרודה לעבוד על אילו polyaniline היה מסונתז אלקטרו. האמצעי האלקטרודה הפניה, האלקטרודה התחתונה מהווה האלקטרודה מונה. ההפניה והן האלקטרודות מונה הן functionalized באמצעות אמלגם Ag/AgCl מוצק מעל השכבה פחמן.- לבצע 3 שוטף של האלקטרודות בטבילת הטיפים לתוך בארות של צלחת 96-ובכן המכיל 300 µL טוב בפתרון הכנה אלקטרודה (1% טריטון X-100-PBS, ראה צעד 2.1.5.). לבצע כל כביסה למשך 2 דקות עם ערבוב עדין בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את האלקטרודות בטבילת הטיפים לתוך בארות של צלחת 96-ובכן המכיל 300 µL/טוב של מים מזוקקים למשך 2 דקות עם ערבוב עדין בטמפרטורת החדר.
- להתחדש האלקטרודות בטבילת הטיפים לתוך בארות של צלחת 96-ובכן המכיל 300 µL טוב של התחדשות פתרון (3.5 מ' אשלגן כלורי, ראה שלב 2.1.6) לילה 4 ° C או h 1 בטמפרטורת החדר.
- לבצע 3 שוטף של האלקטרודות בטבילת הטיפים לתוך בארות של צלחת 96-ובכן המכיל 300 µL טוב תמיסת מאגר פוספט (ראה שלב 2.1.1.). לבצע כל כביסה למשך 2 דקות עם ערבוב עדין בטמפרטורת החדר.
-
איגוד וזמינותו המבוצעת על חיישן
- מעיל HEWL על גבי המשטח PANI (polyaniline) של האלקטרודה על ידי הפקדת טיפת 15 µL µg 40/mL HEWL מוכן ב- PBS על גבי המשטח אלקטרודה. דגירה בין לילה 4 ° C או שעה בטמפרטורת החדר.
- לבצע שלושה שוטף של האלקטרודות בתמיסת מאגר פוספט (ראה שלב 2.1.1) על ידי שילוב חלקי האסימונים חיישן אלקטרודה לתוך בארות של צלחת 96-ובכן המכיל 300 µL טוב תמיסת מאגר פוספט. לבצע כל כביסה למשך 2 דקות עם ערבוב עדין בטמפרטורת החדר.
- להרוות את האלקטרודות על-ידי הוספת טיפת 50 µL הפתרון חסימה (ראה שלב 2.1.2) על גבי משטח אלקטרודה. תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף שלוש פעמים כפי שמתואר הקודם שלב (ראה שלב 2.3.2).
- לדלל את הפתרון אייריש-מונית-Lys3 µg/mL 20 ב מחייב פתרון (ראה שלב 2.1.3) חלה ירידה 15 µL של הפתרון מדולל אל האלקטרודות. תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר תגובה אנטיגן-nanobody, לשטוף שלוש פעמים כפי שמתואר בשלב הקודם באמצעות הפתרון לשטוף (ראה שלב 2.1.4). ואז לשטוף האלקטרודה פעם אחת עם PBS (ראה שלב 2.1.1).
- לצורך זיהוי, חבר את שבב חיישן דרך החלק נחושת-המעגלים מולטימטר. לאחר מכן, ליזום את התגובה חיישן על-ידי החלת טיפת 50 µL זיהוי פתרון (ראה שלב 2.1.7) אל האלקטרודות חיובי והחלת טיפה 50 µL של NaCl פתרון 5 מ מ על גבי האלקטרודות שלילי (ראה שלב 2.1.7). תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר. נטר את מוליכות עם מולטימטר.
הערה: multimeter סופק על ידי ד ר ע' Bogaerts, ד ר ס יונוס, פרופסור י' Glupczynski של (הקתולית האוניברסיטה בלוביין-לה-ניובה - צ'ו מונט-Godinne. Potentiostat הזה זו. שבשליטת למחשב באמצעות יציאת USB ומנתח את שבבי שונים שמונה של החיישן בעת ובעונה אחת. התוכנה שנוצרו על-ידי Yunus ועמיתיו17 יוצרת מגרש בזמן אמת, המייצג את המידות של ההבדל מוליכות בין האלקטרודות הפניה ודגימת נגד הזמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עיצוב והנדסה של החלבון chimeric אייריש-מונית-Lys3
איור 1 מייצג החדרת המונית-Lys3 לתוך לולאה ולקוד של BalP מדרגה ראשונה β לקטמאז Bacillus licheniformis. הכניסה בוצעה בין שאריות Asp198 ו- Lys199. אתר המחשוף תרומבין הוצג בכל צד של מונית-Lys3. תאים טרנספורמציה עם פלסמיד ביטוי המכונן קידוד החלבון chimeric אייריש-מונית-Lys3 הצליחו לגדול בנוכחות ריכוז קטן של אמפיצילין. תוצאה זו עולה כי היברידית β לקטמאז הוא מסיס, מקופל כראוי, יכול להיות מופרש בהצלחה לחלל periplasmic של החיידק בהם זה ביעילות לספק עמידות נגד אמפיצילין. בהמשך ניתחנו את bifunctionality של חלבון chimeric שלנו. כפי שדווח במחקרים קודמים שלנו, הנתונים שלנו הראה את β לקטמאז, כמו גם את moieties המונית-Lys3 של החלבון chimeric נשמר שלהם פעילויות ביולוגיות15.
ביוסנסור conductimetric assay
החיישן צ'יפס משמש assay זו מוצגת באיור 2. החיישנים המשמש עבור ניסויים אלה מכילים צ'יפס 8. כל שבב כוללת שלוש אלקטרודות: אלקטרודה עובד אחד, אלקטרודה נגד אחד, הפניה אחת אלקטרודה. האסימונים 8 מאורגנים כמו 4 זוגות בהחיישן. עבור כל זוג, באחד האסימונים שכותרתו "-" המתאים לפקד שלילי, ואילו השבב שכותרתו "+" מקביל המדגם שנבדקו.
איור 3 מייצג תיאור סכמטי של ההתקנה ניסיוני להשתמש בעבודה זו, המשלבת את הטכנולוגיה β לקטמאז היברידית ביוסנסור potentiometric. בהגדרת הזה, משמשות שתי אלקטרודות: i) אלקטרודה הפניה, אלקטרודה מצופה ii) polyaniline (PANI). HEWL הוא הספוחה על האלקטרודה מצופה PANI כפי שדווח מחקרים אחרים,18,19. לאחר שוטף נאותה, אייריש-מונית-Lys3 (עבור "+" שכותרתו צ'יפס) או אייריש ללא מוספים nanobody (עבור "-" שכותרתו צ'יפס) מוחלים על האלקטרודות. בעקבות התוספת של β לקטם (benzylpenicillin) על האלקטרודות, נמדדים לשינויים אלקטרודה מוליכות. אכן, β-לקטם הידרוליזה על ידי β-lactamases יוצר שחרור של פרוטונים; אשר הוצגה כדי ליצור שינויים משמעותיים במוליכות אלקטרודה עם זמן תגובה קצר מאוד. מבחני ביוסנסור המוצג באיור 4 מציינים כי הכריכה של אייריש-מונית-lys3 כדי HEWL ותשמרו על האלקטרודה PANI ועוזרת המנוטרת על-ידי מדידת פרסום פרוטון הנובע הפעילות β לקטמאז קיבוע. לעומת זאת, אין הבדל מוליכות זוהה בעת הניסוי בוצע עם פדרליין ללא כל nanobody שנוסף.
איור 1: ערכת המייצג את החלבון chimeric אייריש-מונית-Lys3 אינטראקציה עם HEWL. אייריש מוצג ציאן, מונית-Lys3 ב orange ו HEWL בכחול. איור זה הושג על-ידי שילוב של מבנים תלת מימדי של אייריש (PDB מזהה: 4BLM), המתחם המונית-Lys3/HEWL (מזהה PDB: 1MEL). Β לקטמאז מכיל 2 תחומים: תחום α/β, התחום α, האתר הפעיל הינו ממוקם בין שני התחומים. הלולאה המשמש את ההוספה בצבע צהוב, הממוקם בתוך לולאה החשופים הממס בתחום α. חלקי N - ו C-מסוף המונית-Lys3 מוצגים באדום. הלולאה CDR3 של מונית-Lys3 עושה את רוב אנשי הקשר עם האתר הפעיל HEWL. הכריכה של מונית-Lys3 כדי HEWL מעכב את פעילותה אנזימטיות. איור זה ואת התוצאות שהוצגו במסמך זה פורסמו העבודה הקודמת שלנו15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: תמונה של החיישן המשמשים את הניסוי. כל חיישן כוללת קבוצה של 8 שבבי בודדים. על כל שבב, ישנם שלוש אלקטרודות: אלקטרודה אחת לעבוד אלקטרודה הפניה, אלקטרודות יון של מונה. החלק מצופה נחושת מחובר מולטימטר מחובר למחשב. שבבי בודדים מאורגנים כמו 4 זוגות איפה "-" שכותרתו הם כימיקלים בקרת שלילי ו "+" שכותרתו ששבבים האלקטרודות הדגימה. התקנה זו מאפשרת משכפל ניסיוני שונה או HEWL / ריכוזים β לקטמאז ייבדק בעת ובעונה אחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ייצוג סכמטי של ההתקנה נסיוני בשימוש assay ביוסנסור שלנו. HEWL היה מרותק למיטה על אלקטרודה מצופה PANI (polyaniline). החלבון chimeric אייריש-מונית-Lys3 ואז הוחל על גבי האלקטרודה. פעילות β לקטמאז קיבוע, אשר נקבע על ידי מדידת שחרורו של פרוטונים שנגזרות של הידרוליזה של benzylpenicillin, הוא ביחס ישר האינטראקציה בין HEWL לבין החלבון chimeric. שחרור פרוטון גורם לשינויים מוליכות חשמלית מומרים לאות שניתן לפרשם על-ידי המשתמש. האבולוציה של ההבדל מוליכות שנצפה בין את PANI מצופה האלקטרודה הפניה כפונקציה של הזמן. איור זה ואת התוצאות שהוצגו במסמך זה פורסמו העבודה הקודמת שלנו15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: ייצוג גרפי של conductimetric המידות להראות את האינטראקציה ספציפי של אייריש-מונית-Lys3 HEWL. התוספת של benzylpenicillin מסומן על ידי חץ. זה הפרש הפוטנציאלים נובעת שחרור פרוטון המתרחשים בעת הידרוליזה לאנטיביוטיקה. המדידות בוצעו עם החלבון היברידית אייריש-מונית-Lys3 (אדום), את פדרליין β לקטמאז מקורי ללא כל nanobody שנוספו (כחול), כפקד שלילי. עקומות שונות מייצגות מדידות עצמאי המבוצעת על שבבי שונים. איור זה ואת התוצאות שהוצגו במסמך זה פורסמו העבודה הקודמת שלנו15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעבודה זו אנו מציגים שיטה functionalize nanobody באמצעות אייריש β לקטמאז כמו חלבון נשא ולהראות לנו כי אנחנו יכולים ליישם בהצלחה החלבון היברידית וכתוצאה מכך ב וזמינותו חיישן potentiometric. ההיבט חדשנות הראשי של העבודה שלנו לעומת מבחני ביוסנסור אחרים הוא זיווג קוולנטיות החלק נוגדן הפעילות האנזימטית מתרחשת שיוצר את האות החשמלי. טכנולוגיה זו ההכנסה חלבון שנקרא מציג יתרונות ומגבלות זה יהיה המוקד העיקרי של סעיף זה.
יתרונות הטכנולוגיה β לקטמאז היברידית.
Β-lactamases הם אנזימים יעיל
אחד הפרמטרים החשובים ביותר להשפיע על רגישות ועל יחס אות לרעש ביוסנסור הוא הפעילות האנזימטית מתרחשת המשמש ליצירת האות. בהקשר זה, β-lactamases מציגים מספר יתרונות: הם קטנים (≈29 kDa), monomeric, מאוד יציב ועוד, חשוב להפגין פעילות ספציפיות גבוהה של תחלופה גבוהה בהשוואה אנזימים אחרים המשמשים חיישן potentiometric מבחני כגון גלוקוז אוקסידאז, אוראז, ליפאז, peroxydase או phosphatase אלקליין20. מכל הסיבות האלה, β-lactamases הם אנזימים של בחירה עבור מבחני ביוסנסור שונים.
הכנסה ישירה לתוך β לקטמאז יכול לשפר את הייצור תפוקה ויציבות של התחום/החלבון שנוספו.
אחד ההיבטים המגביל של מבחני immunosensor רבים הוא האיכות (למשל יציבות, טוהר) של הנוגדן להשתמש כדי לזהות את analyte2. כיום, מערכות ייצור עלות נמוכה של נוגדנים או מקטעי נוגדנים (למשל e. coli) נשארים מאתגר, לעיתים קרובות להוביל מצטברים חלבונים עם המסיסות המסכן, יציבות21. בטכנולוגיה היברידית β לקטמאז נראה גישה טובה כדי להתגבר על קשיים אלה מאז בעבר הראינו כי אסטרטגיה זו משפר את התשואה הביטוי ואת יציבותו של תחומים מוספים חלבון14. בפרט, במחקר הנוכחי, באמצעות מערכת β לקטמאז שלנו היברידית, החלבון chimeric בשם אייריש-מונית-Lys3 בהצלחה שבאה לידי ביטוי ב- e. coli עם תשואה טובה מאוד (≈10 מ ג של פרוטאין טהור לליטר של תרבות), לטהר עד הומוגניות.
קוולנטיות צימוד בין נוגדן moieties אנזימטי גורם מבחני חיישן זול יותר ומהיר
ב- immunosensors המקובלת, זיהוי analyte מחייבת הניצול של נוגדנים הראשי הם ותשמרו על השבב חיישן. לאחר מכן, נוגדנים משניים כי זה משולב אנזים או בדיקה עם תוויות נדרש גם כדי ליצור אות מדיד. גישה זו כרוך incubations מספר צעדים כביסה, ולכן יכול להיות זמן רב. בנוסף, פרוטוקול זה יקר מאז מספר נוגדנים נדרשים קוולנטיות צימוד בין הנוגדן המשני של אנזים/בדיקה זה נחוץ גם. לעומת זאת, המערכת שלנו משתמש רק חלבון היברידית כדי לזהות ולכמת את analyte, ולכן מאפשר בזמן אמת ניטור ללא השימוש של נוגדנים משניים.
יתר על כן, חשוב לציין כי הכניסה לתחום לכיתה שβ-lactamases הראו ליצירת חלבונים היברידית מפגין התנהגות מתג allosteric22,23. בוררים שכזה יכול למצוא יישומים רבים מבוססי ביוסנסור מבחני.
מגבלות הטכנולוגיה β לקטמאז היברידית.
המגבלות שנגזרות חלבון הנדסה.
במערכת זו, הקושי העיקרי הוא לעצב ולקבל חלבון היברידית על-ידי הוספת את moiety נוגדנים β לקטמאז. חלבון chimeric וכתוצאה מכך זה חייב להיות bifunctional: moiety אנזימטי חייבים להישאר מסוגלים ביעילות hydrolyse אנטיביוטיקה β lactam כדי להפיק את אות חשמלי, ואילו moiety נוגדנים עליך לאגד analyte יישוב עם זיקה גבוהה, ירידה לפרטים. כדי לקבל חלבונים chimeric bifunctional, פרמטרים שונים צריכים לקחת בחשבון על מנת להימנע הסטריים אילוצים. הנקודה הראשונה הינה מיקומו של אתר ההכנסה. אמנם הוכח כי נקודות הכניסה מרובות הן אפשרי24,25,26, עמדות ממוקמים לעיתים קרובות ממס ההכנסה חשוף לולאות הרחק מן האתר הפעיל של החלבון המוביל. פעולה זו ממזערת שינויים הסתגלותי פוטנציאליים או הסטריים הפרעה הנגרמת על ידי החלבון שנוספו. מאותן סיבות, מומלץ גם כי האתר הפעיל של החלבון שנוספו להיות ממוקם רחוק מן האתר הכניסה כדי למנוע שינויים של פעילותה. לבסוף, ההכנסה של חלבונים שמציגים גמיש או שכנות N - ו C-מסוף הגפיים נסבול יותר טוב אכן, מרוחק ונוקשה הגפיים יכול לכפות הסטריים אילוצים על שני בני הזוג של החלבון chimeric, ובכך לשנות את פעילותם הביולוגית בהתאמה. לכן, חשוב להזכיר כי הגודל של החלבון שנוספו יש רק השפעה מועטה על חלבון chimeric שנוצר. אכן, הוכח כי תחומים מובנה גדול שניתן בהצלחה להוסיף β-lactamases, כל עוד הגפיים N - ו C-מסוף שלהם הם גמישים או קרוב אחד לשני13,14,2, 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29. במחקר הנוכחי, באתר ההכנסה פדרליין ממוקם הרחק מן האתר הפעיל שלו ויש nanobody שנוסף יחסית ארוכות וגמישות הגפיים (לא גלוי במבנה רנטגן) הנמצאים הרחק מן paratope. תכונות ספציפיות אלה מבטיחים כי אילוצי הסטריים מינימלי מוטלות על משטחים פעילים ביולוגית של שני בני הזוג של החלבון היברידית. עם זאת, כאשר החלבון שנוסף אינו מציג את הקריטריונים המומלצים להכנסה אופטימום לתוך חלבון נשא, אפשרי לאזורים מקשר מהנדס על מנת להקטין אילוצים הסטריים פוטנציאליים. אכן, הנוכחות של גמיש מקשר (למשל Gly-Ser חזרות) כדי להתחבר המוביל של החלבון שנוספו הוצגה להגדיל באופן משמעותי את סובלנות כלפי החדרת חלבונים גדולים, מובנית לתוך טנדר אחד30 ,12.
מגבלות הטבועות אלקטרוכימי ביולוגיים.
למרות התפתחות ביולוגיים אלקטרוכימי/potentiometric הפך שדה ההולכת וגוברת, מבחני אלה יש מגבלות חשובים שצריך לקחת בחשבון בעת תכנון הניסוי ביוסנסור. הראשון, כל ביולוגיים המערבות H+ -הפצה או ספיגת דורשים שימוש פתרונות במאגר מאוד חלש (קרי < 5 מ מ)31 כדי למדוד הבדלים משמעותיים פוטנציאליים. וריאציית pH המושרה מתבסס H+ יכולים להשפיע את מאפייני חלבון ואת הפעילות האנזימטית מתרחשת המשמש ליצירת האות. שנית, pH וכוח יוניים ב- biofluids יכול להשתנות באופן משמעותי, כתוצאה מכך לגרום בווריאציות חשוב בתגובה ולהגדיל רעש רקע של ביולוגיים32. לכן, קבוצות מחקר שונות ניסו לפתח ננוטכנולוגיה כדי להקטין את גודל חיישן אלקטרוכימי רכיבים על מנת להגדיל את יחס אות לרעש התהליכים המתרחשים על הממשק של המכשיר33, 34 , 35. כתוצאה מכך, זה גם אפשרי לפתח נוגדנים מולקולות עם מספר מולקולות של האנזים כדי להגביר את האות הנובע הכריכה של מולקולה אחת שלה היעד32תוויות. עם זאת, למרות מגבלות אלו, conductometric/ביולוגיים נותרו מכשירים מאוד רגיש ויעיל עם מגבלות המשוערת של זיהוי (LODs) בטווח של 10-8 עד 10-11 מ'36.
במחקר זה, אנחנו הראו כי שנוכל בהצלחה להכניס nanobody שמכוונת HEWL לתוך מחלקה A β לקטמאז בשם פדרליין, ושומרת כי החלבון שנוצר היברידית שתי פעילויות ביולוגיות: איגוד חזק i) של HEWL ו- ii) את היכולת hydrolyse אנטיביוטיקה β lactam. מחקר זה מהווה הוכחה של קונספט ההכנסה של קטעים nanobodies או נוגדנים שונים לתוך פדרליין, יישום טכנולוגיה חלבון זו היברידית במבחני חיישן potentiometric. טכנולוגיה זו יכולה להיות פוטנציאל המשמשים לזיהוי epitopes חלבונים שונים, ליישם כלי אבחון רבים. אכן, פיתוח, שימוש יעיל כזה מבחני הפכו חיוני בחברה שלנו, הם בעצם מונעים ע י הצרכים החברתיים והכלכליים בעלות נמוכה וקל לתפעול טכנולוגיות בתחומים שונים כגון מערכות מזון ובריאות, במיוחד מדינות מתפתחות. יתר על כן, ננוטכנולוגיה לשחק תפקיד גדל והולך בפיתוח של חיישנים כאלה. כיום, טכנולוגיות עיבוד אות זמינים על מכשירים ניידים כמו טלפונים חכמים, טבליות, החכם שונים יישומים קיימים כבר עבור עיבוד אותות37. לדוגמה, לאחרונה, מכשיר חיישן potentiometric שולב smartphone כדי לאפשר ריכוז הגלוקוז ניטור38. המומחים לבריאות בטוחים כי התקנים אלה די חדשנית תהפוך פתרונות בריאות חשובים יותר הקרובים שנים39,40.
לסיכום, עבודה זו מייצגת דוגמא שמראה את הפוטנציאל ואת היתרונות של טכנולוגיית ההכנסה שלנו חלבון. אנו מקווים כי עבודה זו תתרום לפתח טכנולוגיות חדשני ושימושי עבור מחקר, למטרות רפואיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים להכיר את ולוני אזור בלגיה במסגרת מחקריהם SENSOTEM ו- NANOTIC, כמו גם הלאומי כספים את המחקר המדעי (F.R.S.-F.N.R.S) לתמיכה הפיננסית שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
- Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
- Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O'Kennedy, R. Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).
- Huston, J. S., et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).
- Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores. Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Sheriff, S., Constantine, K. L.
- Stijlemans, B., et al. Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm. J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).
- Thanongsaksrikul, J., et al. A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A. J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).
- Huang, L., et al. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).
- Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens. J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).
- Kojima, M., et al. Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules. Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).
- Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains. Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).
- Vandevenne, M., et al. The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments. Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).
- Vandevenne, M., et al. Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions. Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).
- Crasson, O., et al. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).
- Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications. Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).
- Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).
- Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline. Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).
- Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).
- Khatkhatay, M. I., Desai, M. A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).
- Worn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).
- Ostermeier, M. Engineering allosteric protein switches by domain insertion. Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).
- Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. Design of protein switches based on an ensemble model of allostery. Nat Commun. 6, 6968 (2015).
- Collinet, B., et al. Functionally accepted insertions of proteins within protein domains. J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).
- Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein. Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).
- Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).
- Ruth, N., et al. DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli. Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).
- Zervosen, A., et al. Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI). FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).
- Chevigne, A., et al. Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development. J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).
- Ke, W., et al. Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation. PloS One. 7, 39168 (2012).
- Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate. Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).
- D'Orazio, P. Biosensors in clinical chemistry. Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).
- Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection. Analyst. 134, 1601-1607 (2009).
- Ding, J., Wang, X., Qin, W. Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).
- Wang, X., et al. A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing. Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).
- Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures. Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).
- Bakker, E., Pretsch, E.
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).
- Nemiroski, A., et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).
- Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , Price Waterhouse Coopers. Commission, T.E (2013).
