基于β-内酰胺酶的导电生物传感器检测法用于检测生物分子相互作用

摘要

在本研究中，我们报道了一种基于杂合β-内酰胺酶技术的电导型生物传感器新方法，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。该方法依赖于β-内酰胺水解过程中质子的释放。

摘要

生物传感器正变得越来越重要，并已广泛应用于病原体检测、分子诊断、环境监测和食品安全控制等多个领域。在本研究中，我们利用β-内酰胺酶作为高效的报告酶，开展了多项蛋白质-蛋白质相互作用研究。此外，这类酶能够接受肽段或结构化蛋白质/结构域的插入，这极大地促进了其在构建嵌合蛋白中的应用。在最近的一项研究中，我们将一个单结构域抗体片段插入到Bacillus licheniformis BlaP β-内酰胺酶中。这些小型结构域也被称为纳米抗体，定义为骆驼科动物来源的单链抗体的抗原结合结构域。与常见的双链抗体类似，它们对其靶标具有高亲和力和高特异性。所获得的嵌合蛋白在保持β-内酰胺酶活性的同时，对其靶标表现出高亲和力，表明纳米抗体和β-内酰胺酶两个部分均保持功能完整。在本研究中，我们报道了一种详细的实验方案，将我们的杂合β-内酰胺酶系统与生物传感器技术相结合。通过检测酶催化活性所释放的质子引起的电导率变化，可实现对纳米抗体与其靶标特异性结合的检测。

引言

生物传感器是一类分析装置，它将生物分子相互作用与被称为换能器的物理或化学信号装置相结合¹。所记录的信号可被解读并转换，用于监测固定化分子与游离分子之间的相互作用。大多数生物传感器使用抗体来检测分析物，例如激素或不同病原体标志物²。可采用多种传感器形式，包括基于质量、磁性、光学或电化学的生物传感器。其中，电化学生物传感器是使用最广泛的传感器之一，其功能是将结合事件转化为电信号。所有基于抗体的生物传感器的性能和灵敏度主要取决于两个关键参数：i）抗体的质量；ii）用于产生信号的系统的特性²。

抗体是高分子质量的二聚体蛋白（150–160 kDa），由两条重链和两条轻链组成。轻链与重链之间的相互作用主要通过疏水相互作用以及一个保守的二硫键来稳定。每条链均包含一个可变区，该区主要通过三个称为互补决定区（CDR1-2-3）的高变区与抗原相互作用。尽管该领域已取得诸多进展，但在低成本表达系统中大规模表达全长抗体仍面临挑战。例如, E. coli）常常导致不稳定且易聚集的蛋白质产生。因此，人们已设计出多种抗体片段，例如单链可变区片段³ （ScFvs ≈ 25 kDa）。它们由一条重链和一条轻链的可变区组成，通过一段合成的氨基酸序列共价连接。然而，由于这些片段会将其疏水....

方案

1. 蛋白质样品制备

1. 按照我们之前的研究方法制备并纯化杂合蛋白BlaP-cAb-Lys3¹⁵。将蛋白储存于50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，缓冲液组成为：8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄ 和 0.24 g KH₂PO₄ 溶解于800 mL蒸馏水中，在定容至1 L前将溶液pH调节至7.4。用滤膜过滤除菌处理蛋白溶液。
2. 配制鸡卵清溶菌酶（HEWL）储备液。将100 mg（40,000 单位/mg）市售HEWL溶解于10 mL磷酸盐缓冲液（PBS，见步骤 2.1.1）中。使用孔径0.22 μm的滤膜过滤，对蛋白溶液进行除菌处理。

2. 生物传感器检测

1. 溶液与缓冲液的配制
   1. 通过将 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄ 和 0.24 g KH₂PO₄ 溶解于 800 mL 去离子水中，配制 50 mM PBS。用 1 N HCl 或 1 N NaOH 将 pH 调至 7.4，再将溶液定容至 1 L。过滤除菌后，于 4 °C 保存。
   <....

结果

BlaP-cAb-Lys3 融合蛋白的设计与构建

图1展示了将cAb-Lys3插入来自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的A类β-内酰胺酶BlaP的一个容许性环区。该插入位于Asp198和Lys199残基之间。在cAb-Lys3的两侧均引入了凝血酶切割位点。用编码BlaP-cAb-Lys3嵌合蛋白的组成型表达质粒转化的细胞能够在低浓度氨苄青霉素存在下生长。该结果表明，这种杂合β-内酰胺酶可溶、正确折叠，并能成功分泌至细菌的周质空间，在其中可有效提供对氨苄青霉素的抗性。我们进一步分析了该嵌合蛋白的双功能特性。如我们先前研究所述，实验数据表明，该嵌合蛋白中的β-内酰胺酶部分以及cAb-Lys3部分均保留了各自的生物学活性¹⁵。

电导率生物传感器检测

.......

讨论

在本研究中，我们介绍了一种利用 BlaP β-内酰胺酶作为载体蛋白对纳米抗体进行功能化的方法，并证明了可成功将所获得的杂合蛋白应用于电位传感器检测。与其它生物传感器检测方法相比，本工作的主要创新之处在于抗体部分与产生电信号的酶活性之间实现了共价偶联。这种所谓的蛋白质插入技术具有若干优势与局限性，将是本节讨论的重点。

杂合β-内酰胺酶技术的优势。

β-内酰胺酶是高效的酶
影响生物传感器灵敏度和信噪比的最重要参数之一，是用于产生信号的酶活性。在此背景下，β-内酰胺酶具有多项优势：它们分子量小（≈29 kDa）、为单体结构、非常稳定，更重要的是，与其他用于电位型传感器检测的酶（如葡萄糖氧化酶、脲酶、脂肪酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶）相比，具有更高的比活性和更高的催化转换速率²⁰。基于上述所有原因，β-内酰胺酶是多种生物传感器检测中的首选酶类。

直接插入到 ββ-内酰胺酶可提高插入蛋白/结构域.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
KH2PO4	Sigma-Aldrich	V000225
K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Tris–HCl	Roche	10812846001
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	NIST2186II
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250
丙氨酸	Sigma-Aldrich	A7627
HClO4	Fluka	34288	1 M HClO4 溶液，经销商：Sigma-Aldrich
酪蛋白水解物	Sigma-Aldrich	22090
青霉素钠	Sigma-Aldrich	B0900000
鸡蛋清溶菌酶	Roche	10837059001
庚烷	Sigma-Aldrich	246654
甲醇	Sigma-Aldrich	322415
氨水溶液	Sigma-Aldrich	380539	28% NH3 in H2O，经双重蒸馏纯化（浓？）
实验室耗材
6 孔板	Greiner Bio-One	657165	CELLSTAR 6 孔板
设备
pH 计	WTW	1AA110	Lab pH 计 inoLab pH 7110
真空过滤系统	Nalgene	NALG300-4100	带接收瓶的滤器，经销商：VWR
电位传感器芯片			由 Yunus 及同事制备（参考文献 16）
PGSTAT30 Autolab	Metrohm Autolab		已停产，后继型号为 Autolab PGSTAT302N
数字万用表，METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		已停产，后继型号为 Metrahit Base