Summary
I dette arbeidet rapporterer vi en ny metode for å studere protein-protein interaksjoner ved hjelp av en conductimetric biosensor basert på hybridteknologi β-lactamase. Denne metoden er avhengig av utgivelsen av protoner ved hydrolyse av β-lactams.
Abstract
Biosensors blir stadig mer viktig og implementert i ulike felt som patogen gjenkjenning, molekylær diagnose, miljøovervåking og mat sikkerhetskontroll. I denne sammenhengen brukte vi β-lactamases som effektiv reporter enzymer i flere protein-protein samhandling studier. Deres evne til å akseptere innsettinger peptider eller strukturert proteiner/domener sterkt oppfordrer videre bruk av disse enzymene generere chimeric proteiner. I en fersk studie inn vi et enkelt domene antistoff fragment Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase. Disse små domener, også kalt nanobodies, er definert som antigen bindende domener av enkelt kjede antistoffer fra camelids. Som vanlig dobbel kjeden antistoffer viser de høy slektskap og særegenheter for sine mål. Resulterende chimeric protein utstilt høy affinitet mot målet samtidig beholde β-lactamase aktiviteten. Dette tyder på at de nanobody og β-lactamase moieties fortsatt fungere. I den nåværende arbeidet rapportere vi en detaljert protokoll som kombinerer hybrid β-lactamase systemet biosensor teknologien. Bestemt binding av nanobody til målet kan oppdages takket være en conductimetric måling av protoner utgitt av katalytisk aktiviteten av enzymet.
Introduction
Biosensors er analytiske enheter som kombinerer en bio-molekylær interaksjon med fysisk eller kjemiske signalnettverk enheter kalles transdusere1. Registrert signalene kan deretter tolkes og for å overvåke samspillet mellom partnerne immobilisert og gratis. De fleste av biosensors innebærer bruk av et antistoff å oppdage analytter som hormoner eller annen patogen markører2. Skjellige formater kan brukes og inkludere masse-baserte, magnetisk, optisk eller elektrokjemisk biosensors. Sistnevnte er blant de mest brukte sensorer og fungerer ved å konvertere en bindende hendelse til et elektrisk signal. De forestillinger og sensitiviteten for alle antistoff-baserte biosensors er sterkt avhengig av hovedsakelig to parametere: i) kvaliteten på antistoffer og ii) egenskapene for systemet brukes til å generere signal2.
Antistoffer er høymolekylær masse dimeric proteiner (150-160 kDa) som består av to tunge kjeder og to lys kjeder. Samspillet mellom lette og tunge kjedene er hovedsakelig stabilisert hydrofobe samhandling samt en bevart disulfide obligasjon. Hver kjede omfatter en variabel domene som samhandler med antigen i hovedsak via tre hypervariable regioner heter komplementære bestemme regioner (CDR1-2-3). Til tross for mange fremskritt i feltet store uttrykket av full lengde antistoffer med rimelig uttrykk systemer (f.eks E. coli) ofte fører til produksjon av ustabil og aggregert proteiner. Det er derfor ulike antistoff fragmenter har blitt utviklet som enkelt-kjeden variabel fragmenter3 (ScFvs ≈ 25 kDa). De består av variabel domener av henholdsvis en tunge og en lys kjeder som covalently er knyttet sammen av en syntetisk aminosyresekvens. Men disse fragmentene ofte viser en dårlig stabilitet og har tendens til å samle, siden de viser en stor del av sine hydrofobe regioner til løsemiddel4. I denne sammenheng synes enkelt kjede Kamelid antistoff fragmenter, kalles nanobodies eller VHHs, å være gode alternativer til ScFvs. Disse domenene korresponderer til variabel domener av Kamelid single-kjeden antistoffer. I motsetning til konvensjonelle antistoffer, Kamelid antistoffer er blottet for lys kjeder og bare inneholde to tunge kjeder5. Nanobodies er derfor minste monomerisk antistoff fragmenter (12 kDa) kunne binde til et antigen med tilhørighet lik som konvensjonelle antistoffer6. I tillegg presenterer de forbedret stabilitet og løselighet sammenlignet med andre fulle antistoffer eller antistoff fragmenter. Til slutt, deres små størrelser og deres utvidet CDR3 looper tillate dem å gjenkjenne kryptiske epitoper og binder seg til enzymet aktive nettsteder7,8. I dag er disse domenene får betydelig oppmerksomhet og har vært sammen til biosensor teknologi. For eksempel Huang et al. har utviklet en nanobody-baserte biosensor av kvantifisering av menneskelig prostata-spesifikt antigen (PSA)9.
Som nevnt over er en viktig parameter biosensor analyser effektiviteten til systemet brukes til å generere elektrisk signal. Derfor enzym-baserte elektrokjemisk biosensors har tiltrukket seg stadig økende oppmerksomhet og har vært brukt mye for ulike applikasjoner som helse, matsikkerhet og miljøovervåking. Disse biosensors er avhengige av katalytisk hydrolyse av et av et enzym å generere elektrisk signal. I denne sammenheng ble β-lactamases vist å være mer spesifikk, mer følsomme og lettere å implementere eksperimentelt enn mange andre enzymer som alkalisk fosfatase eller pepperrot peroxidase10. Β-lactamases er enzymer som er ansvarlig for bakteriell motstand mot β-Laktam antibiotika av hydrolyzing dem. De er monomerisk, veldig stabil, effektiv, og liten størrelse. Videre genererer domene/peptid innsettinger i β-lactamases bi-fungerende chimeric proteiner som ble vist å være effektive verktøy å studere protein-ligand interaksjoner. Faktisk har studier vist at innsetting av antistoff variabel TEM1 β-lactamase resultatene i et chimeric protein som fortsatt stand til å binde med høy affinitet til sine mål antigen. Interessant, ble antigen bindingen vist å indusere allosteric regulering av TEM1 katalytisk aktivitet11,12. Videre viste vi i flere studier at protein domene innsetting en ettergivende løkke av Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase genererer funksjonelle chimeric proteiner som er godt egnet til å overvåke protein-ligand interaksjoner13 ,14. Vi nylig satt inn en nanobody, kalt cAb-Lys3, i denne ettergivende innsetting site BlaP15. Denne nanobody ble vist å binde til hen-egg-hvit lysozyme (HEWL) og til å hemme den enzymatiske aktiviteten16. Vi viste at generert hybrid protein, kalt BlaP-cAb-Lys3, beholdt en høy spesifisitet / affinitet mot HEWL mens β-lactamase aktiviteten forble uendret. Vi har kombinert β-lactamase hybridteknologi å en elektrokjemisk biosensor og viste at mengden av genererte elektrisk signal var avhengige av samspillet mellom BlaP-cAb-Lys3 og HEWL immobilisert på en elektrode. Faktisk induserer hydrolyse av β-Laktam antibiotika av BlaP en proton utgivelse som kan konverteres til en kvantitativ elektrisk signal. Denne kombinasjonen av β-lactamase hybridteknologi med en elektrokjemisk biosensor er rask, følsom, kvantitativ, og gir sanntids måling av genererte signalet. Denne metodikken er beskrevet her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. protein eksempel forberedelse
- Produsere og rense hybrid protein BlaP-cAb-Lys3 som rapportert i våre tidligere studie15. Lagre protein i 50 mM fosfat buffer pH 7.4 med følgende sammensetning: 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 og 0,24 g KH2PO4 oppløst i 800 mL destillert vann fikse pH av løsningen 7.4 før justere det siste bindet av løsningen 1 sterilisere L. Filter protein løsningen.
- Forberede en høne egg hvit lysozyme (HEWL) lager løsning. Oppløse 100 mg (40 000 enheter/mg) kjøpt kommersielt HEWL i 10 mL fosfat buffer saltoppløsning (PBS se trinn 2.1.1). Sterilisere protein løsningen ved filtrering ved hjelp av filtre med en 0.22 μm cutoff.
2. biosensor analyser
-
Løsning og buffer forberedelse
- Klargjør 50 mM PBS ved oppløsning 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4og 0,24 g KH2PO4 800 mL destillert vann. Justere til pH 7.4 med 1 N HCl eller 1 N NaOH før du justerer volumet av løsningen 1 L. Filter sterilisere og lagre på 4 ° C.
- Forberede en metning/blokkerer løsning ved å løse opp 3 g av kasein hydrolyse i 100 mL PBS forberedt som beskrevet ovenfor (se trinn 2.1.1). Filteret sterilisere og lagre på 4 ° C.
- Forberede en forpliktende løsning ved å løse opp 1 g kasein hydrolyse i 100 mL PBS forberedt som beskrevet ovenfor (se trinn 2.1.1). Filteret sterilisere og lagre på 4 ° C.
- Forberede en vask løsning (0,1% Tween - PBS) ved å legge 100 μL mellom 20 (100%) i 100 mL PBS forberedt som beskrevet ovenfor (se trinn 2.1.1). Butikken på 4 ° C.
- Forberede en elektrode forberedelse løsning (1% Triton X-100-PBS) ved å legge 1 mL av Triton X-100 (100%) i 100 mL PBS forberedt som beskrevet ovenfor (se trinn 2.1.1). Butikken på 4 ° C.
- Forberede en elektrode gjenfødelse løsning (3,5 M KCl) ved oppløsning 26 g av KCl i destillert vann til et siste volum 100 mL. Filtrere sterilisert og lagre på 4 ° C.
- Forbered en 5 mM NaCl løsning ved oppløsning 0.29 g NaCl i destillert vann til et siste volum 1 L. Filter sterilisere og lagre på 4 ° C. Deretter forberede en gjenkjenning løsning (4 mM benzylpenicillin) ved oppløsning 26.7 mg av benzylpenicillin i 20 mL 5 mM NaCl løsning. Filteret sterilisere og lagre på 20 ° C.
-
Sensoren forberedelse og regeneration
Merk: Polyaniline belagt sensor chips ble utviklet og vennlig levert av Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus og Prof. Y. Glupczynski's (katolske universitetet i Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). Beskrivelsen av sensoren samt polyaniline electro-polymerisasjon protokollene som brukes til å syntetisere disse sensorene er beskrevet i deres tidligere arbeid17. Kort, dette systemet bruker gjenbrukbare sensorer åtte individuelle sjetonger som ble produsert av klassisk kretskort board (PCB) teknikker. Enkelte chips er sammensatt av tre elektrode runde flekker. Øverst er arbeider elektroden som polyaniline var electro-syntetisert. Mellomste er referanse elektroden bunnen elektroden utgjør counter elektroden. Både referanse og counter elektrodene er functionalized med solid Ag/AgCl amalgam oppå karbon laget.- Utføre 3 vasker av elektrodene dipping tips i brønner av en 96-brønns plate som inneholder 300 µL/vel av elektroden forberedelse løsningen (1% Triton X-100-PBS, se trinn 2.1.5.). Utføre hver vask i 2 minutter med mild blande ved romtemperatur.
- Skyll elektrodene av dipping tips i brønner av en 96-brønns plate som inneholder 300 µL/vel destillert vann i 2 minutter med mild blande ved romtemperatur.
- Regenerere elektrodene av dipping tips i brønner av en 96-brønns plate som inneholder 300 µL/vel gjenfødelse løsning (3.5 M KCl, se trinn 2.1.6) overnatting på 4 ° C eller 1t ved romtemperatur.
- Utføre 3 vasker av elektrodene dipping tips i brønner av en 96-brønns plate som inneholder 300 µL/vel fosfat buffer saltoppløsning (se trinn 2.1.1.). Utføre hver vask i 2 minutter med mild blande ved romtemperatur.
-
Bindende analysen utført på sensoren
- Kåpe HEWL på PANI (polyaniline) overflaten av elektroden ved å sette inn en 15 µL dråpe 40 µg/mL HEWL utarbeidet i PBS på elektroden overflaten. Ruge over natten på 4 ° C eller 1 time i rom temperatur.
- Utføre tre vasker av elektrodene med fosfat buffer saltvann (se trinn 2.1.1) av dipping elektrode deler av sensor chips i brønner av en 96-brønns plate som inneholder 300 µL/vel fosfat buffer saltoppløsning. Utføre hver vask i 2 minutter med mild blande ved romtemperatur.
- Mette elektrodene ved å legge en 50 µL dråpe blokkerer løsningen (se trinn 2.1.2) på elektroden overflaten. Inkuber 1t ved romtemperatur. Deretter vaske tre ganger som beskrevet i forrige trinn (se trinn 2.3.2).
- Fortynn BlaP-cAb-Lys3 løsningen 20 µg/mL i bindingen løsning (se trinn 2.1.3) og bruke en 15 µL dråpe fortynnet løsningen på elektrodene. Inkuber i 10 min ved romtemperatur. Antigen-nanobody reaksjon, vaskes tre ganger som beskrevet i forrige trinn bruker vaskeløsning (se trinn 2.1.4). Skyll elektroden gang med PBS (se trinn 2.1.1).
- For deteksjon, plugg sensor flis via kobber-krets delen som et digitalt multimeter. Deretter starte sensor svaret ved å bruke en 50 µL dråpe oppdagelsen løsning (se trinn 2.1.7) på positive elektrodene og bruke en 50 µL dråpe NaCl 5 mM løsning på de negative elektrodene (se trinn 2.1.7). Inkuber i 30 min ved romtemperatur. Overvåke konduktans med en digital multimeter.
Merk: Multimeter ble levert av Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus og Prof. Y. Glupczynski's (katolske universitetet i Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. Denne potentiostat er datastyrt via en USB-port og analyserer i åtte forskjellige sjetonger av sensoren samtidig. Opprettet av Yunus og kolleger17 opprettes et sanntids plott som representerer målinger av konduktans forskjellen mellom referanse og prøve elektrodene mot tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Design og utvikling av chimeric protein BlaP-cAb-Lys3
Figur 1 representerer innsetting av cAb-Lys3 i en ettergivende løkke av BalP klasse A β-lactamase fra Bacillus licheniformis. Innsetting ble utført mellom rester Asp198 og Lys199. Et trombin cleavage område ble introdusert på hver side av cAb-Lys3. Celler forvandlet en grunnleggende uttrykk plasmider koding BlaP-cAb-Lys3 chimeric protein kunne vokse i nærvær av en liten konsentrasjon av ampicillin. Resultatet indikerer at hybrid β-lactamase er løselig, riktig foldet og kan bli vellykket utskilt i periplasmic plass av bakterier der det kan effektivt gi motstand mot ampicillin. Vi analysert videre bifunctionality våre chimeric protein. Som rapportert i våre tidligere studier, viste våre data at β-lactamase samt cAb-Lys3 moieties av chimeric protein beholdt sine biologiske aktiviteter15.
Conductimetric biosensor analysen
Sensoren sjetonger brukes for denne analysen er vist i figur 2. Sensorene brukes for disse eksperimentene inneholder 8 sjetonger. Hver brikke med tre elektroder: en arbeider elektrode, en mot elektrode og en referanse elektrode. Disse 8 brikker er organisert som 4 parene i sensoren. For hvert par, en av sjetongene merket "-" tilsvarer en negativ kontroll, mens chip merket "+" tilsvarer testet prøven.
Figur 3 representerer en skjematisk beskrivelse av eksperimentelle oppsettet brukes i dette arbeidet som kombinerer β-lactamase hybridteknologi å en potentiometric biosensor. To elektrodene brukes dette oppsettet: i) en referanse elektrode og ii) en polyaniline (PANI) belagt elektrode. HEWL er adsorbert på PANI belagt elektrode som rapportert i andre studier18,19. Etter tilstrekkelig vasker, BlaP-cAb-Lys3 (for "+" merket sjetonger) eller BlaP uten innsatte nanobody (for "-" merket sjetonger) brukes på elektrodene. Etter tillegg av β-Laktam (benzylpenicillin) på elektrodene, endringer i elektrode konduktans måles. Faktisk genererer β-Laktam hydrolyse av β-lactamases en utgivelse av protoner; som ble vist å skape betydelige endringer i elektrode konduktans med en svært kort svartid. Biosensor analyser i figur 4 angir at binding av BlaP-cAb-lys3 å HEWL immobilisert på PANI elektroden kan oppdages og overvåket av måle proton utgivelsen skyldes immobilisert β-lactamase aktiviteten. Derimot fant ingen konduktans forskjell når forsøket ble utført med BlaP uten noen innsatte nanobody.
Figur 1: ordningen som representerer chimeric protein BlaP-cAb-Lys3 samspill med HEWL. BlaP vises i cyan, cAb-Lys3 i oransje og HEWL i blått. Dette tallet ble oppnådd ved å kombinere tridimensional strukturer av BlaP (PDB-ID: 4BLM) og cAb-Lys3/HEWL komplekset (PDB-ID: 1MEL). Β-lactamase inneholder 2 domener: α/β domenet og α domenet, katalytisk området ligger på grensesnittet mellom begge domenene. Løkken brukes for innsettingspunktet er merket med gult og ligger i et løsemiddel-eksponerte loop i α domenet. N - og C-terminalen deler av cAb-Lys3 vises i rødt. Den CDR3 løkken av cAb-Lys3 gjør mesteparten av kontaktene med HEWL katalytisk området. Binding av cAB-Lys3 å HEWL hemmer dens enzymatisk aktivitet. Denne illustrasjonen og resultatene som presenteres her er publisert i våre tidligere arbeid15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: bilde av sensoren i eksperimentet. Hver sensor inkluderer en gruppe av 8 personlige chips. På hver brikke, finnes det tre elektroder: en arbeider elektrode, en referanse elektrode og en counter ion elektrode. Den kobber-dekket delen er koblet til en digital multimeter koblet til en datamaskin. Enkelte chips er organisert som 4 parene der den "-" merket chips er negativ kontroll elektroder og "+" merket chips er prøven elektrodene. Dette oppsettet kan annerledes eksperimentell gjentak eller HEWL / β-lactamase konsentrasjoner skal testes samtidig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: skjematisk fremstilling av eksperimentelle oppsettet brukes i analysen vår biosensor. HEWL var immobilisert på en PANI (polyaniline) belagt elektrode. Chimeric protein BlaP-cAb-Lys3 ble så brukt på elektroden. Immobilisert β-lactamase aktivitet, som bestemmes av måle utgivelsen av protoner indusert ved hydrolyse av benzylpenicillin, er direkte proporsjonal med samspillet mellom HEWL og chimeric protein. Proton utgivelsen induserer elektrisk konduktans endringer som blir konvertert til et signal som kan tolkes av brukeren. Utviklingen av konduktans forskjellen observert mellom PANI belagt og referanse elektroden som en funksjon av tid. Denne illustrasjonen og resultatene som presenteres her er publisert i våre tidligere arbeid15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: grafisk representasjon av den conductimetric mål viser bestemte samspillet av BlaP-cAb-Lys3 til HEWL. Tillegg av benzylpenicillin er angitt med en pil. Denne potensielle forskjellen skyldes at proton forekommer på antibiotika hydrolyse. Målingene ble utført med hybrid protein BlaP-cAb-Lys3 (rød) og den opprinnelige β-lactamase BlaP uten noen innsatte nanobody (blå), som en negativ kontroll. Forskjellige kurvene representerer uavhengige målinger utført på forskjellige sjetonger. Denne illustrasjonen og resultatene som presenteres her er publisert i våre tidligere arbeid15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbeidet presenterer vi en metode for å functionalize en nanobody med BlaP β-lactamase som en operatør protein og vi vise at vi lykkes kan implementere resulterende hybrid protein i en potentiometric sensor analysen. Det viktigste nyvinning aspektet av vårt arbeid i forhold til andre biosensor analyser er kovalente koblingen av antistoff delen som den enzymatiske aktiviteten som genererer elektrisk signal. Denne såkalte protein innsetting teknologien presenterer fordeler og begrensninger som vil være hovedfokus for denne delen.
Fordeler med hybrid β-lactamase teknologi.
Β-lactamases er effektiv enzymer
En av de viktigste parameterne som påvirker følsomheten og signal-til-støy forholdet mellom en biosensor er den enzymatiske aktiviteten brukt til å generere signalet. I denne sammenheng presentere β-lactamases flere fordeler: de er liten (≈29 kDa), monomerisk, veldig stabil og mer viktigere, utstilling høy aktiviteten og høy omsetning sammenlignet med andre enzymer i potentiometric sensor analyser som glukose oksidase, urease, lipase, peroxydase eller alkalisk fosfatase20. For alle disse grunner er β-lactamases enzymer valgfrihet for ulike biosensor analyser.
Direkte innsetting β-lactamase kan forbedre produksjonen yield og stabilitet av innsatte protein/domene.
En av de begrensende aspektene av mange immunosensor analyser er kvaliteten (f.eks stabilitet, renhet) av antistoffer brukes til å oppdage analytt2. Foreløpig lavpris produksjonssystemer av antistoffer eller antistoff fragmenter (f.eks E. coli) være utfordrende og ofte føre til samlede proteiner med dårlig løslighet og stabilitet21. Våre hybridteknologi β-lactamase synes å være en god tilnærming for å løse disse vanskelighetene siden vi viste tidligere at denne strategien forbedrer uttrykk yield og stabilitet av de innsatte protein domener14. Spesielt i studien, bruke vår hybrid β-lactamase system, var chimeric protein kalt BlaP-cAb-Lys3 vellykket uttrykt i E. coli med en meget god avkastning (≈10 mg av rent protein per liter kultur) og renset til homogenitet.
Kovalente kopling mellom antistoff og enzymatiske moieties gjør billigere og raskere sensor analyser
Konvensjonelle immunosensors krever oppdagelsen av analytt bruken av primære antistoffer som er blokkert på sensoren chip. Deretter kreves en sekundær antistoff som er koblet til et enzym eller en merket probe også for å generere en målbar signal. Denne tilnærmingen omfatter flere incubations og vask trinn, og derfor kan være tidkrevende. I tillegg er denne protokollen dyrt siden flere antistoffer er nødvendig og kovalente kopling mellom sekundær antistoffer og en enzym/sonde er også nødvendig. Derimot systemet bruker bare en hybrid protein oppdage og kvantifisere analytt, og derfor gir sanntids overvåking uten bruk av sekundære antistoffer.
Videre er det viktig å merke seg at domenet innsetting klasse en β-lactamases ble vist å generere hybrid proteiner viser allosteric bytte-lignende oppførsel22,23. Slike svitsjer finner mange programmer i biosensor-baserte analyser.
Begrensninger av β-lactamase hybridteknologi.
Begrensninger av protein engineering.
I dette systemet er største vanskeligheten å designe og få en hybrid protein ved å sette inn antistoff moiety i β-lactamase. Dette resulterende chimeric protein må være bifunctional: den enzymatiske moiety må være stand til hydrolyse effektivt β-Laktam antibiotika for å generere elektrisk signal, mens antistoff moiety må binde til de målrettede analytt med høy affinitet og spesifisitet. For å få bifunctional chimeric proteiner, må ulike parametere vurderes for å unngå steric begrensninger. Det første kritiske punktet er plasseringen av innsetting site. Selv om det har vist at flere innsetting poeng er mulig24,25,utsatt26, innsetting posisjoner er ofte plassert i løsemiddel looper langt vekk fra det aktive området av operatør protein. Dette minimerer mulige conformational endringer eller steric hindring av innsatte protein. Av samme grunn, er det også anbefalt at det aktive området av innsatte protein være ligger langt fra innsetting site for å hindre endringer av sin virksomhet. Til slutt, innsetting av proteiner som presenterer fleksibel eller nærliggende N - og C-terminalen ekstremiteter vil bli bedre tolerert. Faktisk kan fjernt og stive ekstremiteter pålegge steric begrensninger på begge partnere av chimeric protein, og dermed endre deres respektive biologiske aktiviteter. Derfor er det viktig å nevne at størrelsen på innsatte protein har bare liten innvirkning på det resulterende chimeric proteinet. Faktisk har det vært vist at store strukturert domener kan lykkes settes inn i β-lactamases, så lenge ekstremiteter N - og C-terminalen er fleksible eller nær hverandre13,14,2, 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29. i studien, innsetting området i BlaP ligger langt vekk fra det aktive området og den innsatte nanobody har relativt lang og fleksibel ekstremiteter (ikke synlig i X-ray strukturen) som ligger langt fra paratope. Disse funksjonene sikre at minimal steric begrensninger er pålagt biologisk aktive overflater for begge partnere av hybrid protein. Imidlertid når innsatte protein ikke viser de anbefalte vilkårene for optimal innsetting en operatør protein, er det mulig å ingeniør koblingsfunksjonalitet områder for å redusere potensielle steric begrensninger. Faktisk ble tilstedeværelse av en fleksibel koblingsfunksjonalitet (f.eks Gly-Ser repetisjoner) koble holderen og innsatte protein vist å dramatisk øke toleransen mot innsetting av stor og strukturert protein bærer en30 ,12.
Begrensninger iboende å elektrokjemiske biosensors.
Selv om utviklingen av elektrokjemiske/potentiometric biosensors har blitt et stadig voksende felt, har disse analyser viktige begrensninger som må vurderes når du utformer biosensor eksperimentet. Først, alle biosensors som involverer H+ utgivelse eller opptak krever bruk av svært svakt bufrede løsninger (dvs. < 5 mM)31 for å måle betydelig potensial forskjeller. PH variasjonen indusert ved H+ løslatelse kan påvirke egenskapene protein og enzymatiske aktiviteten brukt til å generere signalet. Dernest kan pH og ioniske styrke i biofluids variere betydelig og dermed føre viktig varianter i respons og øke bakgrunnsstøyen av biosensors32. Dette er grunnen, forskjellige forskningsgrupper har forsøkt å utvikle nanoteknologi for å redusere størrelsen på elektrokjemiske sensor elementer for å øke signal-til-støy forholdet for prosessene som oppstår i grensesnittet enheten33, 34 , 35. som en konsekvens, er det også mulig å utvikle antistoff molekyler merket med flere molekyler av samme enzym å øke signalet som følge av binding av ett molekyl sine mål32. Til tross for disse begrensningene beholdes imidlertid conductometric/biosensors svært effektive og følsomme enheter med beregnede grensene for påvisning (LODs) i området 10-8 10-11 M36.
I denne studien har vi vist at vi lykkes kan sette inn en nanobody som mål HEWL i en klasse A β-lactamase kalt BlaP, og at generert hybrid protein beholder begge biologiske aktiviteter: i) stramt binding av HEWL og ii) kapasitet til hydrolyse Β-Laktam antibiotika. Denne studien utgjør et bevis på konsept for innsetting av ulike nanobodies eller antistoff fragmenter i BlaP og gjennomføringen av denne hybrid protein teknologien i potentiometric sensor analyser. Denne teknologien kan potensielt brukes til å oppdage ulike protein epitoper og implementert i mange diagnostiske verktøy. Faktisk utvikling og effektiv bruk av slike analyser har blitt avgjørende i vårt samfunn, og er i hovedsak drevet av sosiale og økonomiske behov for lave kostnader og enkel å betjene teknologier i ulike som mat og helse systemer, spesielt i utviklingsland. Videre spille nanoteknologi en stadig økende rolle i utviklingen av slike sensorer. I dag er signal behandling teknologier tilgjengelig på bærbare enheter som smartphones og tabletter og ulike smartphone programmer finnes for signalbehandling37. For eksempel nylig er en potentiometric sensor enhet integrert i en smarttelefon å tillate glukose konsentrasjon overvåking38. Helse-eksperter er overbevist om at disse slags innovative enheter blir viktigere helse-løsninger i de kommende år39,40.
I konklusjonen, representerer dette arbeidet et eksempel som viser potensialet og fordelene ved vår protein innsetting teknologi. Vi håper at dette arbeidet vil bidra til å utvikle nyskapende og nyttige teknologier for forskning og medisinske formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne bekrefter Vallonsk Region i Belgia innenfor rammen av forskningsprosjekter SENSOTEM og NANOTIC samt National midler For the forskning (F.R.S.-F.N.R.S) for deres støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
- Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
- Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O'Kennedy, R. Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).
- Huston, J. S., et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).
- Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores. Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Sheriff, S., Constantine, K. L.
- Stijlemans, B., et al. Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm. J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).
- Thanongsaksrikul, J., et al. A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A. J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).
- Huang, L., et al. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).
- Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens. J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).
- Kojima, M., et al. Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules. Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).
- Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains. Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).
- Vandevenne, M., et al. The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments. Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).
- Vandevenne, M., et al. Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions. Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).
- Crasson, O., et al. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).
- Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications. Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).
- Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).
- Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline. Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).
- Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).
- Khatkhatay, M. I., Desai, M. A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).
- Worn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).
- Ostermeier, M. Engineering allosteric protein switches by domain insertion. Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).
- Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. Design of protein switches based on an ensemble model of allostery. Nat Commun. 6, 6968 (2015).
- Collinet, B., et al. Functionally accepted insertions of proteins within protein domains. J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).
- Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein. Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).
- Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).
- Ruth, N., et al. DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli. Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).
- Zervosen, A., et al. Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI). FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).
- Chevigne, A., et al. Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development. J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).
- Ke, W., et al. Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation. PloS One. 7, 39168 (2012).
- Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate. Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).
- D'Orazio, P. Biosensors in clinical chemistry. Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).
- Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection. Analyst. 134, 1601-1607 (2009).
- Ding, J., Wang, X., Qin, W. Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).
- Wang, X., et al. A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing. Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).
- Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures. Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).
- Bakker, E., Pretsch, E.
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).
- Nemiroski, A., et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).
- Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , Price Waterhouse Coopers. Commission, T.E (2013).
