Summary
In questo lavoro, segnaliamo un nuovo metodo per studiare le interazioni proteina-proteina usando un biosensore conduttimetriche basato sulla tecnologia ibrida β-lattamasi. Questo metodo si basa sul rilascio di protoni all'idrolisi di β-lattami.
Abstract
Biosensori stanno diventando sempre più importante e implementata in vari campi quali rilevamento del patogeno, diagnosi molecolare, monitoraggio ambientale e controllo della sicurezza alimentare. In questo contesto, abbiamo usato il β-lattamasi come enzimi reporter efficiente in diversi studi di interazione proteina-proteina. Loro capacità di accettare gli inserimenti di peptidi o proteine/domini strutturati fortemente incoraggia inoltre l'uso di questi enzimi per generare proteine chimeriche. In uno studio recente, abbiamo inserito un frammento di anticorpo di singolo dominio il Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase. Questi piccoli domini, chiamati anche nanobodies, sono definiti come i domini di antigene-leganti degli anticorpi di singola catena da camelidi. Come comune doppia catena anticorpi, essi mostrano elevata affinità e specificità per i loro obiettivi. La proteina chimerica risultante ha esibito un'alta affinità contro il bersaglio mantenendo l'attività β-lattamasi. Ciò suggerisce che le moiety nanobody e β-lactamase rimangono funzionali. Nel lavoro attuale, segnaliamo un protocollo dettagliato che combina il nostro sistema di β-lactamase ibrido per la tecnologia dei biosensori. Il grippaggio specifico di nanobody al suo target può essere rilevato grazie a una misurazione conduttimetriche dei protoni rilasciato dall'attività catalitica dell'enzima.
Introduction
Biosensori sono dispositivi analitici che combinano un'interazione bio-molecolari con dispositivi di segnalazione fisiche o chimiche denominate trasduttori1. Segnali registrati possono quindi essere interpretati e convertiti per monitorare le interazioni tra i partner immobilizzati e gratuiti. La maggior parte dei biosensori implicano l'uso di un anticorpo per rilevare analiti come ormoni o agente patogeno differente marcatori2. Formati di sensore diverso possono essere utilizzati e includono biosensori basati su massa, magnetici, ottici o elettrochimici. Quest'ultimo è tra i più comuni sensori utilizzati e funzione di conversione di un evento di associazione in un segnale elettrico. Le prestazioni e la sensibilità di tutti i biosensori basati su anticorpi sono fortemente dipendenti essenzialmente due parametri: i) la qualità dell'anticorpo e ii) le proprietà del sistema utilizzato per generare il segnale2.
Gli anticorpi sono proteine dimeriche massa molecolarità (150 – 160 kDa) che sono composte da due catene pesanti e due catene leggere. L'interazione tra le catene leggere e pesanti per la maggior parte è stabilizzata da interazioni idrofobiche, come pure un legame disolfuro conservato. Ogni catena include un dominio variabile che interagisce con l'antigene essenzialmente tramite tre regioni ipervariabili denominato complementari determinare regioni (CDR1-2-3). Nonostante i numerosi progressi nel settore, l'espressione su larga scala di anticorpi full-length con sistemi di espressione di basso costo (ad es., Escherichia coli) spesso porta alla produzione di proteine instabili e aggregate. Ecco perché vari frammenti di anticorpo sono stati progettati come catena singola variabile frammenti3 (ScFvs ≈ 25 kDa). Sono costituiti da domini variabili di rispettivamente uno pesante e uno catene leggere che sono legati covalentemente da una sequenza di amminoacido sintetico. Tuttavia, questi frammenti spesso visualizzare una scarsa stabilità e hanno la tendenza ad aggregare, poiché espongono una grande parte delle loro regioni idrofobiche a solvente4. In questo contesto, frammenti di anticorpo camelide singola catena, indicati come nanobodies o VOX, sembrano essere ottime alternative a ScFvs. Questi domini corrispondono ai domini variabili degli anticorpi di camelide catena singola. In contrasto con gli anticorpi convenzionali, camelide anticorpi sono privi di catene chiare e contengono solo due catene pesanti5. Pertanto, nanobodies sono i frammenti di anticorpo monomerico più piccoli (12 kDa) in grado di legarsi a un antigene con un'affinità simile a quella di anticorpi convenzionali6. Inoltre, presentano una maggiore stabilità e solubilità rispetto ad altri anticorpi Full-Length o frammenti di anticorpo. Infine, le piccole dimensioni e loro estesi cicli CDR3 permettono loro di riconoscono epitopi criptici e si legano a siti attivi dell'enzima7,8. Al giorno d'oggi, questi domini stanno ricevendo una notevole attenzione e sono stati combinati per la tecnologia dei biosensori. Ad esempio, Huang et al. hanno sviluppato un biosensore basato su nanobody per la rilevazione e la quantificazione di umano antigene prostatico specifico (PSA)9.
Come sopra accennato, un parametro importante nelle analisi di biosensore è l'efficienza del sistema utilizzato per generare il segnale elettrico. Per questo motivo, biosensori elettrochimici basati su enzima hanno attirato l'attenzione crescente e sono stati ampiamente utilizzati per varie applicazioni quali sanità, sicurezza alimentare e monitoraggio ambientale. Questi biosensori affidano l'idrolisi catalitica di un substrato di un enzima per generare il segnale elettrico. In questo contesto, β-lattamasi sono stati indicati per essere più specifici, più sensibile e più facile da implementare sperimentalmente rispetto a molti altri enzimi come la fosfatasi alcalina o perossidasi di rafano10. Β-lattamasi sono enzimi che sono responsabili della resistenza batterica agli antibiotici β-lattamici idrolizzando li. Sono monomerici, molto stabile, efficiente e di piccole dimensioni. Inoltre, gli inserimenti di dominio/peptide in β-lattamasi generano proteine chimeriche bi-funzionali che sono state indicate per essere strumenti efficaci per studiare le interazioni proteina-ligando. Infatti, recenti studi hanno dimostrato che inserimento di variabile frammenti anticorpali nei risultati del β-lactamase TEM1 in una proteina chimerica che rimane in grado di legarsi con alta affinità per l'antigene bersaglio. È interessante notare che, l'associazione dell'antigene è stato indicato per indurre la regolazione allosterica di TEM1 attività catalitica11,12. Inoltre, abbiamo dimostrato in diversi studi che l'inserzione di dominio della proteina in un ciclo permissivo del Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase genera proteine chimeriche funzionali che ben si adattano per monitorare le interazioni proteina-ligando13 ,14. Recentemente abbiamo inserito un nanobody, denominato cAb-Lys3, in questo sito di inserimento permissiva di BlaP15. Questo nanobody è stato indicato da associare alla gallina albume lisozima (HEWL) e di inibire la sua attività enzimatica16. Abbiamo mostrato che la proteina ibrida generato, denominata BlaP-cabina-Lys3, mantenuto un'alta specificità / affinità contro HEWL mentre l'attività β-lactamase è rimasto invariato. Poi con successo abbiamo combinato la tecnologia di β-lactamase ibrida di un biosensore elettrochimico e ha mostrato che la quantità di segnale elettrico generato era dipendente dell'interazione tra BlaP-cabina-Lys3 e HEWL immobilizzati su un elettrodo. Infatti, l'idrolisi degli antibiotici β-lattamici BlaP induce un rilascio di protoni che può essere convertito in un segnale elettrico quantitativo. Questa combinazione della tecnologia ibrida β-lactamase con un biosensore elettrochimico è veloce, sensibile e quantitativa e permette di misurare in tempo reale il segnale generato. Questa metodologia è descritto qui.
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Protocol
1. preparazione del campione proteina
- Produrre e purificare la proteina ibrida BlaP-cabina-Lys3 come riportato nel nostro precedente studio15. Memorizzare la proteina in 50 mM tampone fosfato pH 7.4 con la seguente composizione: 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4 e 0,24 g di KH2PO4 disciolto in 800 mL di acqua distillata difficoltà il pH della soluzione a 7.4 prima regolazione del volume finale della soluzione a 1 L. filtro sterilizzare la soluzione della proteina.
- Preparare una soluzione stock di gallina albume lisozima (HEWL). Sciogliere 100 mg (40.000 unità/mg) di HEWL acquistato in commercio in 10 mL di soluzione fisiologica di tampone fosfato (PBS Vedi punto 2.1.1). Sterilizzare la soluzione della proteina di filtrazione con filtri con un cutoff di 0.22 μm.
2. biosensore saggi
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Preparazione soluzione e buffer
- Preparare 50 mM PBS sciogliendo 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4e 0,24 g di KH2PO4 in 800 mL di acqua distillata. Regolare il pH 7.4 con 1 N HCl o NaOH N 1 prima di regolare il volume della soluzione a 1 L. filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
- Preparare una soluzione di saturazione/blocco da sciogliere 3 g di idrolizzato di caseina in 100 mL di PBS preparato come descritto in precedenza (Vedi punto 2.1.1). Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
- Preparare una soluzione di associazione sciogliendo 1 g di idrolizzato di caseina in 100 mL di PBS preparato come descritto in precedenza (Vedi punto 2.1.1). Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
- Preparare una soluzione di lavaggio (0.1% Tween - PBS) aggiungendo 100 μL di Tween 20 (100%) in 100 mL di PBS preparato come descritto in precedenza (Vedi punto 2.1.1). Conservare a 4 ° C.
- Preparare una soluzione di preparazione dell'elettrodo (1% Triton X-100-PBS) aggiungendo 1 mL di Triton X-100 (100%) in 100 mL di PBS preparato come descritto in precedenza (Vedi punto 2.1.1). Conservare a 4 ° C.
- Preparare una soluzione di rigenerazione di elettrodo (3.5 M KCl) sciogliendo 26 g di KCl in acqua distillata fino ad un volume finale 100 mL. Filtro sterilizzato e conservare a 4 ° C.
- Preparare una 5 mM NaCl soluzione sciogliendo 0,29 g di NaCl in acqua distillata ad un volume finale di 1 L. filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C. Quindi, preparare una soluzione di rilevamento (4 mM benzilpenicillina) sciogliendo 26,7 mg di benzilpenicillina in 20 mL di soluzione NaCl di 5 mM. Filtro sterilizzare e conservare a-20 ° C.
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Rigenerazione e preparazione del sensore
Nota: Il polyaniline rivestito sensore chip sono stati sviluppati e gentilmente fornito da Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus e Prof. ssa Y. Glupczynski (cattolico Università di Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). La descrizione del sensore, nonché i protocolli di electro-polimerizzazione polyaniline utilizzati per sintetizzare questi sensori sono dettagliati nel loro precedente lavoro17. Brevemente, questo sistema utilizza sensori riutilizzabili di otto chip individuali che sono state prodotte da tecniche di classico circuito stampato (PWB). Singolo chip sono composti da tre elettrodi macchie tonde. Quella in alto è l'elettrodo di lavoro il quale polyaniline era electro-sintetizzato. Quella centrale è l'elettrodo di riferimento e l'elettrodo inferiore costituisce il controelettrodo. Il riferimento sia gli elettrodi contatore sono funzionalizzati con amalgama di Ag/AgCl solido sopra lo strato di carbonio.- Effettuare 3 lavaggi degli elettrodi immergendo le punte nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenenti 300 µ l/pozzetto di soluzione di preparazione di elettrodi (Vedi Triton X-100-PBS, 1% passo 2.1.5.). Eseguire ogni lavaggio per 2 min con miscelazione delicata a temperatura ambiente.
- Sciacquare gli elettrodi immergendo le punte nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenenti 300 µ l/pozzetto di acqua distillata per 2 min con miscelazione delicata a temperatura ambiente.
- Rigenerare gli elettrodi immergendo le punte nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenenti 300 µ l/pozzetto di soluzione di rigenerazione (3.5 M KCl, vedi punto 2.1.6) overnight a 4 ° C o 1 h a temperatura ambiente.
- Effettuare 3 lavaggi degli elettrodi immergendo le punte nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenenti 300 µ l/pozzetto di soluzione salina tampone fosfato (v. punto 2.1.1). Eseguire ogni lavaggio per 2 minuti con miscelazione delicata a temperatura ambiente.
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Analisi di associazione eseguita sul sensore
- Cappotto HEWL sulla superficie dell'elettrodo PANI (polianilina) depositando una goccia di 15 µ l di 40 µ g/mL HEWL preparato in PBS sulla superficie dell'elettrodo. Incubare per una notte a 4 ° C o 1 ora a temperatura ambiente.
- Eseguire tre lavaggi degli elettrodi con soluzione salina tampone fosfato (Vedi punto 2.1.1) immergendo le parti elettrodo dei chip sensore nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenenti 300 µ l/pozzetto di soluzione salina tampone fosfato. Eseguire ogni lavaggio per 2 min con miscelazione delicata a temperatura ambiente.
- Saturare gli elettrodi con l'aggiunta di una goccia di 50 µ l di soluzione bloccante (Vedi punto 2.1.2) sulla superficie dell'elettrodo. Incubare per 1 h a temperatura ambiente. Quindi lavare tre volte come descritto nel precedente passo (vedere il punto 2.3.2).
- Diluire la soluzione di BlaP-cabina-Lys3 a 20 µ g/mL in soluzione di associazione (Vedi punto 2.1.3) e applicare una goccia di 15 µ l di questa soluzione diluita sugli elettrodi. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la reazione antigene-nanobody, lavare tre volte come descritto nel passaggio precedente utilizzando la soluzione di lavaggio (Vedi punto 2.1.4). Quindi sciacquare l'elettrodo una volta con PBS (Vedi punto 2.1.1).
- Per il rilevamento, collegare il chip sensore tramite la parte di circuiti di rame di un multimetro digitale. Quindi, avviare la risposta del sensore applicando una goccia di 50 µ l di soluzione di rilevamento (Vedi punto 2.1.7) sugli elettrodi positivi e applicando una goccia di 50 µ l di soluzione di NaCl 5 mM sugli elettrodi negativi (Vedi punto 2.1.7). Incubare per 30 min a temperatura ambiente. Monitorare la conduttanza con un multimetro digitale.
Nota: Il multimetro è stato fornito da Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus e Prof. ssa Y. Glupczynski (cattolico Università di Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. Questo potenziostato è controllato dal computer tramite una porta USB e analizza le otto diversi chip del sensore simultaneamente. Il software creato da Yunus e colleghi17 crea un plot in tempo reale che rappresenta le misure della differenza conduttanza tra gli elettrodi di riferimento e campione contro il tempo.
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Representative Results
Design e ingegneria della proteina chimerica BlaP-cabina-Lys3
Figura 1 rappresenta l'inserimento di cabina-Lys3 in un ciclo permissivo della BalP classe A β-lactamase da Bacillus licheniformis. L'inserimento è stato effettuato fra i residui Asp198 e Lys199. Un sito di clivaggio della trombina è stata introdotta su ciascun lato della cabina-Lys3. Cellule trasformate con un plasmide di espressione costitutiva che codifica per la proteina chimerica BlaP-cabina-Lys3 sono stati in grado di crescere in presenza di una piccola concentrazione di ampicillina. Questo risultato indica che il β-lactamase ibrido è solubile, correttamente piegato e può essere escreto con successo nello spazio periplasmico dei batteri dove può fornire in modo efficiente resistenza all'ampicillina. Abbiamo analizzato ulteriormente la bifunzionalità della nostra proteina chimerica. Come riportato nei nostri studi precedenti, i nostri dati hanno mostrato che il β-lactamase come pure le moiety cabina-Lys3 della proteina chimerica mantenuto loro attività biologiche15.
Dosaggio di biosensore conduttimetriche
Il sensore chip utilizzati per questo test è illustrato nella figura 2. I sensori utilizzati per questi esperimenti contengono 8 chip. Ogni chip include tre elettrodi: un elettrodo di lavoro, un contro-elettrodo ed elettrodo di uno riferimento. Questi 8 chip sono organizzati come 4 paia nel sensore. Per ogni coppia, uno dei chip con l'etichetta "-" corrisponde a un controllo negativo, mentre il chip con l'etichetta "+" corrisponde al campione testato.
Figura 3 rappresenta la descrizione schematica dell'apparato sperimentale utilizzato in questo lavoro che combina la tecnologia di β-lactamase ibrido di un biosensore potenziometrico. In questa configurazione, vengono utilizzati due elettrodi: i) un elettrodo di riferimento e ii) un elettrodo rivestito polianilina (PANI). Come riportato in altri studi18,19, HEWL è adsorbito sull'elettrodo rivestito di PANI. Dopo adeguate lavaggi, BlaP-taxi-Lys3 (per "+" etichettato chip) o BlaP senza nanobody inserito (per "-" etichettato chip) vengono applicate sugli elettrodi. In seguito all'aggiunta di β-lattamici (benzilpenicillina) sugli elettrodi, le variazioni di conduttanza di elettrodo sono misurate. Infatti, β-lattamici idrolisi di β-lattamasi genera un rilascio di protoni; che è stato indicato per creare cambiamenti significativi nella conduttanza elettrodo con un tempo di risposta molto brevi. I dosaggi di biosensore presentati nella figura 4 indicano che l'associazione di BlaP-cabina-lys3 a HEWL immobilizzata sull'elettrodo PANI possa essere rilevato e monitorato misurando il rilascio di protoni derivanti dall'attività immobilizzate β-lattamasi. Al contrario, nessuna differenza di conduttanza è stata rilevata quando l'esperimento è stato effettuato con BlaP senza alcun nanobody inserito.
Figura 1: schema che rappresenta l'interazione proteina chimerica BlaP-cabina-Lys3 con HEWL. BlaP è mostrato in ciano, cabina-Lys3 in arancione e HEWL in blu. Questa cifra è stata ottenuta combinando le strutture tridimensionali di BlaP (PDB ID: 4BLM) e il complesso di cabina-Lys3/HEWL (PDB ID: 1MEL). Il β-lactamase contiene 2 domini: il dominio α/β e del α, il sito catalitico si trova all'interfaccia tra entrambi i domini. Il ciclo utilizzato per l'inserimento è evidenziato in giallo e situato in un'ansa nel dominio α esposte al solvente. Le parti di N - e C-terminale della cabina-Lys3 sono mostrate in rosso. Il ciclo di CDR3 della cabina-Lys3 rende la maggior parte dei contatti con il sito catalitico HEWL. L'associazione di cabina-Lys3 a HEWL inibisce la sua attività enzimatica. Questa figura e i risultati presentati qui sono stati pubblicati nel nostro precedente lavoro15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: immagine del sensore utilizzato nell'esperimento. Ogni sensore è composto da un gruppo di 8 singoli circuiti. Su ogni chip, ci sono tre elettrodi: un elettrodo di lavoro, un elettrodo di riferimento e un controelettrodo di ioni. La parte di rame-coperti è collegata a un multimetro digitale collegato ad un computer. I singoli circuiti sono organizzati come 4 coppie dove il "-" con etichetta chip sono elettrodi di controllo negativo e il "+" con etichetta chip sono gli elettrodi di campione. Questa configurazione permette diverse repliche sperimentali o HEWL / le concentrazioni di β-lactamase per essere testate contemporaneamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: rappresentazione schematica dell'apparato sperimentale usato per i nostri test di biosensore. HEWL era immobilizzati su un elettrodo rivestito di PANI (polianilina). La proteina chimerica BlaP-taxi-Lys3 è stato poi applicata sull'elettrodo. L'attività immobilizzate β-lattamasi, che è determinata misurando il rilascio di protoni indotta tramite l'idrolisi di benzilpenicillina, è direttamente proporzionale all'interazione tra HEWL e la proteina chimerica. Il rilascio di protoni induce i cambiamenti di conduttanza elettrica che vengono convertiti in un segnale che può essere interpretato dall'utente. Evoluzione della conduttanza differenza osservata tra il PANI rivestito e l'elettrodo di riferimento in funzione del tempo. Questa figura e i risultati presentati qui sono stati pubblicati nel nostro precedente lavoro15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: rappresentazione grafica della conduttimetriche misure mostrando l'interazione specifica di BlaP-cabina-Lys3 a HEWL. L'aggiunta di benzilpenicillina è indicata da una freccia. Questa differenza di potenziale deriva dal rilascio di protoni che si verificano su idrolisi antibiotico. Le misurazioni sono state eseguite con la proteina ibrida BlaP-taxi-Lys3 (rosso) e il nativo di β-lactamase BlaP senza alcun nanobody inserito (blu), come controllo negativo. Le diverse curve rappresentano misurazioni indipendenti eseguite su chip diversi. Questa figura e i risultati presentati qui sono stati pubblicati nel nostro precedente lavoro15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo lavoro presentiamo un metodo per funzionalizzare un nanobody utilizzando il β-lactamase BlaP come una proteina carrier e mostriamo che possiamo implementare con successo la proteina ibrida risultante in un'analisi di sensore potenziometrico. L'aspetto di innovazione principale del nostro lavoro rispetto ad altri dosaggi di biosensore è l'accoppiamento covalente della parte dell'anticorpo per l'attività enzimatica che genera il segnale elettrico. Questa tecnologia di inserimento della cosiddetta proteina presenta vantaggi e limiti che saranno l'obiettivo principale di questa sezione.
Vantaggi della tecnologia ibrida β-lattamasi.
Β-lattamasi sono enzimi efficienti
Uno dei parametri più importanti che influenzano la sensibilità e il rapporto segnale-rumore di un biosensore è l'attività enzimatica utilizzata per generare il segnale. In questo contesto, β-lattamasi presentano diversi vantaggi: sono piccole (≈29 kDa), monomerico, molto stabile e più d'importanza, presentano elevata attività specifica e fatturato elevato rispetto agli altri enzimi utilizzati nelle analisi di sensore potenziometrico come il glucosio ossidasi, ureasi, lipasi, della perossidasi o fosfatasi alcalina20. Per tutte queste ragioni, β-lattamasi sono enzimi di scelta per i vari test di biosensore.
Inserimento diretto nel β-lactamase può migliorare la resa produttiva e la stabilità della proteina/dominio inserito.
Uno degli aspetti limitanti di molti saggi di immunosensor è la qualità (es. stabilità, purezza) dell'anticorpo utilizzato per rilevare l' analita2. Attualmente, sistemi di produzione a basso costo di anticorpi o frammenti di anticorpo (ad esempio e. coli) rimangono impegnativi e spesso portano a proteine aggregate con scarsa solubilità e stabilità21. La nostra tecnologia di β-lactamase ibrido sembra essere un buon approccio per superare queste difficoltà, dato che precedentemente abbiamo indicato che questa strategia migliora il rendimento di espressione e la stabilità della proteina inserita domini14. In particolare, nel presente studio, utilizzando il nostro sistema di β-lactamase ibrido, la proteina chimerica denominata BlaP-cabina-Lys3 era correttamente espressa in e. coli con una resa molto buona (â10 mg di proteina pura per litro di cultura) e purificata ad omogeneità.
Accoppiamento covalente tra l'anticorpo ed enzimatica moiety rende saggi di sensore più economico e più veloce
In convenzionale immunosensori, la rilevazione dell'analita esige l'utilizzo di anticorpi primari che sono immobilizzati sul chip sensore. Successivamente, un anticorpo secondario che è accoppiato ad un enzima o una sonda marcata è anche necessaria per generare un segnale misurabile. Questo approccio comporta diverse incubazioni e lavaggi e pertanto può richiedere molto tempo. Inoltre, questo protocollo è costoso, poiché parecchi anticorpi sono richiesti e attacco covalente tra l'anticorpo secondario e un'enzima/sonda è anche necessario. Al contrario, il nostro sistema utilizza solo una proteina ibrida per rilevare e quantificare l'analita e pertanto consente monitoraggio senza l'uso di anticorpi secondari in tempo reale.
Inoltre, è importante notare che inserzione di dominio in classe che un β-lattamasi è stato indicato per generare proteine ibride che esibiscono allosterico interruttore-come comportamento22,23. Tali interruttori potrebbero trovare numerose applicazioni in saggi basati su biosensori.
Limitazioni della tecnologia ibrida β-lattamasi.
Limitazioni indotte da ingegneria proteica.
In questo sistema, la difficoltà principale è quello di progettare e ottenere una proteina ibrida inserendo il β-lactamase parte dell'anticorpo. Questa proteina chimerica risultante deve essere bifunzionale: la frazione enzimatica deve rimanere in grado di idrolizzare efficientemente gli antibiotici β-lattamici per generare il segnale elettrico, mentre la frazione di anticorpo deve associare all'analita mirato con alta affinità e specificità. Per ottenere proteine chimeriche bifunzionale, vari parametri devono essere considerati al fine di evitare vincoli di ingombro sterici. Il primo punto critico è la posizione del sito di inserimento. Anche se è stato dimostrato che più punti di inserimento sono possibili24,25,26, inserimento posizioni sono spesso situati in solvente esposti cicli lontano dal sito attivo della proteina carrier. Questo riduce al minimo potenziali cambiamenti conformazionali o impedimento sterico indotta dalla proteina inserita. Per gli stessi motivi, è inoltre consigliabile che il sito attivo della proteina inserita trovarsi lontano dal sito di inserimento al fine di prevenire le alterazioni della sua attività. Infine, inserimento delle proteine che presentano estremità flessibile o limitrofi N - e C-terminale sarà meglio tollerato. Infatti, estremità distanti e rigida può imporre vincoli di ingombro sterici su entrambi i partner della proteina chimerica e così alterare le rispettive attività biologiche. Pertanto, è importante ricordare che le dimensioni della proteina inserita ha solo un impatto minimo sulla proteina chimerica risultante. Infatti, è stato dimostrato che domini di grandi dimensioni strutturate possono essere inseriti con successo in β-lattamasi, come loro estremità N - e C-terminale sono flessibili o vicino a vicenda13,14,2, 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29. nello studio presente, il sito di inserimento in BlaP si trova lontano dal suo sito attivo e la nanobody inserito ha estremità relativamente lunga e flessibile (non visibile nella struttura dei raggi x) che si trovano lontano dal paratope. Queste caratteristiche specifiche assicurano che vengono imposti vincoli sterici minimi sulle superfici biologicamente attive di entrambi i partner della proteina ibrida. Tuttavia, quando la proteina inserita non presenta i criteri consigliati per un ottima inserimento in una proteina carrier, è possibile ingegnere del linker regioni al fine di ridurre potenziali limiti di ingombro sterici. Infatti, la presenza di un linker flessibile (ad es. Gly-Ser ripetizioni) per collegare il supporto e la proteina inserita è stata indicata per aumentare drammaticamente la tolleranza verso l'inserimento delle proteine ampie e strutturate in un vettore di uno30 ,12.
Limitazioni inerenti a elettrochimico biosensori.
Sebbene lo sviluppo di biosensori elettrochimici/potenziometrico è diventato un campo crescente, queste analisi hanno importanti limitazioni che devono essere considerati quando si progetta l'esperimento di biosensore. Primo, tutti i biosensori che coinvolgono l'assorbimento o emissione di H+ richiedono l'uso di soluzioni molto debolmente tampone (cioè < 5 mM)31 al fine di misurare le differenze di potenziale significative. La variazione di pH indotta al momento del rilascio di H+ possa influenzare le proprietà della proteina e l'attività enzimatica utilizzata per generare il segnale. In secondo luogo, pH e forza ionica in biofluidi può variare significativamente e di conseguenza provocare importanti variazioni nella risposta e aumentare il rumore di fondo dei biosensori32. Per questo, vari gruppi di ricerca hanno cercato di sviluppare le nanotecnologie per diminuire le dimensioni degli elementi del sensore elettrochimico al fine di aumentare il rapporto segnale-rumore per i processi che avvengono all'interfaccia del dispositivo33, 34 , 35. di conseguenza, è anche possibile sviluppare molecole dell'anticorpo etichettate con molte molecole dello stesso enzima per aumentare il segnale derivanti dall'associazione di una molecola alla sua destinazione e32. Tuttavia, nonostante queste limitazioni, conduttimetrica/biosensori rimangono dispositivi altamente efficienti e sensibili con stimati limiti di rilevabilità (LOD) nella gamma di 10-8 -10-11 M36.
In questo studio, abbiamo dimostrato che possiamo inserire correttamente un nanobody destinato HEWL in una classe A β-lactamase denominato BlaP, e che la proteina ibrida generato mantiene entrambe le attività biologiche: i) stretto il legame di HEWL e ii) la capacità di idrolizzare Antibiotici β-lattamici. Questo studio costituisce un proof of concept per l'inserimento di vari frammenti di nanobodies o dell'anticorpo in BlaP e l'implementazione di questa tecnologia di proteina ibrida nelle analisi sensore potenziometrico. Questa tecnologia potrebbe potenzialmente essere utilizzata per rilevare vari epitopi di proteine e implementata in numerosi strumenti diagnostici. Infatti, lo sviluppo e l'uso efficace di tali dosaggi sono diventati cruciali nella nostra società e sono essenzialmente guidato da esigenze sociali ed economiche per il basso costo e facile da usare tecnologie in vari campi quali i sistemi di alimentazione e salute, soprattutto in paesi in via di sviluppo. Inoltre, le nanotecnologie gioca un ruolo sempre più importante nello sviluppo di tali sensori. Al giorno d'oggi, le tecnologie di elaborazione del segnale sono disponibili su dispositivi portatili come smartphone e tablet e smartphone diverso esistono già applicazioni per elaborazione del segnale37. Ad esempio, recentemente, un dispositivo sensore potenziometrico è stato integrato in uno smartphone per consentire38di controllo della concentrazione di glucosio. Gli esperti di salute sono fiduciosi che questi tipo di innovativi dispositivi diventeranno più importanti soluzioni di salute nei prossimi anni39,40.
In conclusione, questo lavoro rappresenta un esempio che illustra le potenzialità e i vantaggi della nostra tecnologia di inserimento della proteina. Ci auguriamo che questo lavoro possa contribuire allo sviluppo di tecnologie innovative e utili per la ricerca e scopi medici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono la regione vallona del Belgio, nel quadro dei progetti di ricerca SENSOTEM e NANOTIC nonché la nazionale fondi per la ricerca scientifica (f.r.s.-F.N.R.S) per il loro sostegno finanziario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
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