Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול סיב שריר מהיר מנתח, המאפשר איכות מכתים משופרת, ובכך רכישה אוטומטית וכימות של אוכלוסיות סיבים באמצעות ImageJ התוכנה הזמין באופן חופשי.
Abstract
כימות של אוכלוסיות סיב השריר מספקת תובנה עמוק יותר את ההשפעות של מחלה, טראומה, והשפעות שונות אחרות על רכב שרירי שלד. זמן רב בשיטות שונות באופן מסורתי שימשו ללמוד אוכלוסיות סיבים בתחומים רבים של מחקר. עם זאת, לאחרונה פיתח שיטות אימונוהיסטוכימיים מבוסס על ביטוי החלבון שרשרת כבדה שרירן לספק אלטרנטיבה מהירה לזהות סוגי סיבים מרובים באזור אחד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מהיר, אמין לשחזור עבור איכות מכתים משופרת, המאפשר רכישה אוטומטית של חתכים שלמים כימותים אוטומטיים של אוכלוסיות סיבים עם ImageJ. לשם כך, שרירי השלד מוטבעים נחתכים חתכים, מוכתמים באמצעות נוגדנים שרשראות כבדות שרירן עם נוגדנים ניאון משני DAPI מכתים גרעיני תאים. חתכים שלמים ואז נסרקים באופן אוטומטי באמצעות סורק שקופיות להשיג מרוכבים ברזולוציה גבוההתמונות של הדגימה כולו. ניתוחי אוכלוסיית סיבים מכן מבוצעים לכמת סיבים איטיים, ביניים ומהיר באמצעות מאקרו אוטומטי עבור ImageJ. הראינו בעבר כי שיטה זו יכולה לזהות אוכלוסיות סיבים מהימנות במידה של ± 4%. בנוסף, שיטה זו מקטינה השתנות למשתמש שאר וזמן לכל ניתוחי משמעותי באמצעות ImageJ פלטפורמת הקוד הפתוח.
Introduction
רכב שריר שלד עובר שינויים עמוקים במהלך תהליכים פיסיולוגיים כגון 1 הזדקנות, 2, תרגיל 3, 4, 5, 6, 7, או תהליכים פתופיזיולוגיים כגון מחלה 8, 9, 10 או טראומה 11. לפיכך, מספר תחומים להתרכז מחקר על ההשפעות המבניות של תהליכים אלה על מנת להבין שינויים פונקציונליים. אחד ההיבטים המרכזיים בקביעת תפקוד שריר הוא בהרכב של סיבי שריר. סיבי שריר להביע שרשרת כבדה שונה שרירן (MHC) חלבונים מסווגים ובכך לתוך סיבי איטי, בינוני, או מהר 7, 12, 13 >, 14, 15, 16, 17. יש פיסיולוגי, שרירים קומפוזיציות סיב שריר שונים בהתאם לפונקציה שלהם בגוף. באמצעות הקלדה סיב השריר, אוכלוסיות סיבים ניתן לכמת לזהות לאימוצו לתהליכים פיזיולוגיים או pathophysiological 7, 17. מבחינה היסטורית, מספר שיטות רב הזמן יושמו להבדיל בין סוגי סיבי השריר. לשם כך, סיבי שריר סווגו בין אם על ידי תגובתיות של ATPase שרירן ברמות pH שונות או פעילות אנזים שריר. כפי איכויות סיבים שונים לא ניתן היה להעריך באזור אחד, חתכים מרובים נדרשו לזהות את כל סיבי השריר ולאפשר כימות ידנית 14, 16, 17,= "Xref"> 18, 19, 20, 21, 22. לעומת זאת, הפרסומים האחרונים השתמשו אימונוהיסטוכימיה (IHC) כנגד חלבון שרשרת כבדה שרירן להכתים סוגי סיבים מרובים במהירות בתוך חתכים יחיד. בהתבסס על היתרונות של הליך זה, זה נחשב כעת את תקן זהב ניתוח אוכלוסיית סיב שריר 19, 23, 24. באמצעות פרוטוקולים מכתימים IHC השתפרו, הצלחנו לאחרונה מראה כי הרכישה אוטומטית לחלוטין של חתכי שריר שלמים וכימותי סיב שריר אוטומטית עוקבים אינה ריאלית באמצעות ImageJ פלטפורמת הקוד הפתוח. בהשוואת כימות ידנית, ההליך שלנו ספק ירידה משמעותית זמן (כ 10% מכלל ידני מנתח) נדרש לכל שקופית בעת היותו מדויק עד ± 4% 25
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לתאר מדריך מהיר, אמין, עצמאי-למשתמש כימותי סיב שריר אוטומטיים בשרירי עכברוש כולו באמצעות פלטפורמת קוד פתוחה. בנוסף, אנו מתארים שינויים פוטנציאליים אשר יתירו את השימוש בו עבור דגימות אחרות כגון עכברים או שרירים אנושיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים כולל בנושאים בעלי חיים נערכו בהתאם לעקרונות של טיפול בבעלי חיים במעבדה כפי שהומלצו על ידי FELASA 26. התקבל אישור לפני המחקר על ידי ועדת הבדיקה המוסדית של האוניברסיטה לרפואה של וינה והמשרד האוסטרי למחקר ומדע (BMWF: Bundesministerium fuer Wissenschaft und Forschung, מספר אסמכתא: BMWF-66.009 / 0222-WF / II / 3B / 2014).
1. שריר קציר
הערה: פרסום קודם על ידי ואח 'מנג. 27 זמין המתארים את ההקפאה הנכונה של דגימות שריר בפירוט רב.
- השג השרירים כולה או רקמה מספקת לרכוש חתכים כולו מיד לאחר המתת חסד של בעלי חיים.
- הסר את השריר כולו מנקודת עכברוש הרדים או מורדם. הסר את כל רקמת החיבור והגידים סביב השריר עם מלקחיים ומספריים. למשךnesthesia או המתת חסד, פעל על פי ההנחיות הבינלאומיות של FELASA 28.
- לשקול שריר באמצעות סולם דיוק מכויל. צעד מהיר זה מאפשר ניתוחים השוואתיים בין דגימות שריר, במיוחד לאחר טיפולים פולשניים.
- שם שריר לתוך כלי, מלא לגמרי במתחם אוקטובר, בהתאם לגודל של השריר עם מרווח ביטחון של כ 1 מ"מ לכל הצדדים (למשל, מנייר אלומיניום).
- להקפיא אותו כ 2 דק 'precooled איזופנטאן באמצעות חנקן נוזלי. איזופנטאן חייב להתחיל להראות גבישים לבנים בתחתית המיכל.
הערה: שלב זה הוא חיוני לשמירה על הארכיטקטורה הנכונה של השריר ובכך מאפשר מכתים הנכון וסיבים מנתחים 27. - דגימות חנות נשמרו ב אוקטובר עבור 24 שעות לפחות ב -80 מעלות צלזיוס. דוגמאות ניתנות, עם זאת, להיות מאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים או אפילו שנים, אם קור ctly מקורר.
- חותך 10 מיקרומטר חלקים רוחביים מן midportion של השריר ב -20 ° C באמצעות cryotome. אם החיתוך ב 10 מיקרומטר הוא לא ריאלי, להגדיל את העובי בצעדים של 2 מיקרומטר עד למקסימום של 20 מיקרומטר. מספיק להבי חיתוך חדה חיוניים הצעד הזה.
- החל את הסעיפים לשקופיות דבקות על ידי קירוב השקופיות אל החתכים. החתכים יידבקו אוטומטית השקופיות הדבקות. אחסן את השקופיות ב -20 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני מכתים.
2. מכתים
הערה: מספר רב של נוגדנים כנגד חלבוני שרשרת כבדת שרירן זמין; עם זאת, נוגדנים באיכות גבוהות חיוניים לרכישה וניתוחים אוטומטיים. עבור דילולים והפנית נוגדנים, ראה טבלה 1. לקבלת קובץ גיליון אלקטרוני כדי לחשב את דילולים נכונים לראות את מספר בכמויות פתרון נדרש, ראהsource.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx">Supplemental קובץ 1.
- ההפשרה להתייבש באוויר בסעיפי השריר קפואים במשך 10 דקות לפני ההליך המכתים.
- Wash מחליק בזהירות עם בופר פוספט (PBS) + 0.05% Triton X עבור 10 דקות ולאחר מכן עבור 5 דקות. טריטון הוכח כדי לשפר את איכות מכתים משמעותית. ראה דיון לפרטים נוספים.
- בואו סעיפי אוויר-יבש עבור 2 דקות ו מתאר חתכים בודדים על כל שקופית באמצעות עט הידרופובי (כדי למזער סכום הנדרש של נוגדן) ולאפשר ייבוש נוסף עבור 15 דקות.
- חסום את כל השקופיות עם PBS + 0.05% טריטון X (PBST) המכיל 10% בסרום עיזים עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר.
- לדלל כל נוגדנים ראשוניים (לוח 1) קוקטייל של PBS + 0.05% טריטון X (PBST) המכילה סרום עיזים 10%. מערבבים מספיק לפני היישום. טריטון X חיוני מכתים שווה של חתכים השלמים. לחשבכ 30 μL של קוקטייל נוגדן ראשוני לכל חתך.
- לקבלת שלבים 2.7-2.13 להבטיח הגנה מספקת מפני אור. אורות בחדר התעמעמו ומגשים מכתים מכוסה לספק הגנה נאותה. בנוסף, למלא את המגש מכתים עם נוזל בתחתית לספק סביבה לחה במהלך מכתים ולמנוע ייבוש.
- החל נוגדן ראשוני (לוח 1) קוקטיילים על השקופיות עבור 1 h במגש מכתים לח על בטמפרטורת החדר.
- לשטוף שקופיות עם PBS + 0.05% Triton X עבור 10 דקות ולאחר מכן עם PBST חדש עבור 5 דקות.
- מדולל נוגדנים משני קוקטייל של PBS + 0.05% טריטון X (PBST) + 10% נסיוב עז. חישוב 30 μL של קוקטייל נוגדן ראשוני לכל חתך.
- החל קוקטייל נוגדנים משנית השקופיות עבור 1 h.
- לשטוף שקופיות עם PBS + 0.05% טריטון X (PBST) במשך 10 דקות ועם PBST החדש עבור 5 דקות אחרות.
- החלת ערכת מכתים גרעיני DAPI (רצוי לקרוא לשימוש בפתרונות) FOr 15 דקות או לפי הוראות היצרן להכתים גרעין התא.
- Wash מחליק בקצרה עם PBS + 0.05% טריטון X (PBST) עבור 1 דקות. לאחר מכן, בואו שקופיות בקצרה אוויר-יבשה.
- החל פלורסנט בינוני coverslips הרכבה. חנות ב 4 ° C מוגן מפני אור ולבצע הדמיה אופטימלית תוך 24-48 שעות.
מיקרוסקופי 3.
- טענת מחליק לתוך סורק שקופיות. לכל היותר 12 מגלשות אינו ריאלי תלוי בסורק שקופיות.
- התחל פרוייקט חדש. לקבלת תצוגה מקדימה להגדיר את ערוץ DAPI ואת העדשה פי 2.5. לניתוח מפורט להשתמש DAPI, GFP, ערוצי FITC ו Cy5 ואת המטרה 20X. מיקוד אוטומטי נרכש לאורך הפרויקט בערוץ DAPI.
- השתמש בצבעים הבאים עבור כל ערוץ: DAPI -blue, FITC: ירוק, טקסס אדום: אדום, Cy5: צהוב.
- צור תצוגות מקדימות של כל שקופית באמצעות ערוץ DAPI. לשם כך, להחיל פוקוס ידני על הדגימה הראשונה ולהשתמש בו לאורך כל המקדימהניתוח לרכוש תמונות תצוגה מקדימה של כל דגימה.
- מתאר כל חתך כי יש לכלול את תהליך הרכישה המפורט. אל תציירו מתאר קרוב לקצוות של הדגימה, כדי להבטיח כיתוב של האזור כולו של עניין.
- הגדרת זמני חשיפה עבור כל ערוץ. ברוב המקרים, פרמטרי חשיפה של הערוצים השונים זהים עבור כל החתכים.
- הפעל רכישת תמונה אוטומטית. בדוק רכישה נכונה עבור השדה הראשון של נופים, כדי למנוע רכישה נכונה בתחילת התהליך האוטומטי.
- אם נדרש, להקים שליטה מרחוק באמצעות תוכנת שולחן העבודה שיקוף. זה מאפשר ניטור מרחוק של תהליך רכישת תמונה על ידי שיקוף מסך המחשב של סורק השקופיות למחשב אחר באמצעות כל חיבור לרשת או לאינטרנט. אמנם, לא ניתן לבצע שינויים על המערך הפיזי לגבי המגלשות בשימוש, הסביבה הווירטואלית של תוכנת רכישת תמונה מאפשרת ניטור פעמי פוקוס או חשיפה נכונה של התמונות. בנוסף, הזמן המשוער להשלמת ניתן לבדוק באופן קבוע.
- לאחר השלמת רכישת תמונה, לשלוט על פוקוס אוטומטי הנכון של כל התמונות על ידי שליטה ידנית אם הארכיטקטורה סיבים, סיבים בודדים ועל סוגי סיבים שונים וניתן להבחין בהם.
- לרכישה מחדש של התמקד תמונת באזורים שגוי עבור שדות אחת של נוף או אזורים שלמים של עניין. עבור רכש חוזר של אזורים יחידים, לסמן אזורים או תמונות לאורך הפרויקט כולו ולהשיג מחדש באזורים עם פוקוס ידני. ברוב המקרים, פרט תמונה נוסף לרמת מוקד שונה מוביל את התמונות התמקדו באופן שגוי
- עבור כל חתך שאמור להיכלל ניתוחים הסופיים, לייצא כל ערוץ (למעט DAPI) בנפרד כקבצי JPEG. שם ולמיין קבצים בהתאם לאפיקים החשופים בתיקיות בשם טקסס האדומה, FITC ו Cy5.
4. ניתוח סיבים אוטומטי
אוהל "> הערה: מאקרו ניתן להשיג מדף האינטרנט הבא: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/- תצוגה מקדימה כל תמונה באמצעות תוכנת עריכת תמונות קונבנציונלית לפני ניתוחים ולבדוק מספיק ניגודיות בין סיבי ורקע צבעוניים. במידת הצורך, להתאים הניגודיות והבהירות להגדיל את הפער, באמצעות פקודות הבהירות והניגודיות הסתגלות.
- ImageJ פתח או פיג'י. פתח את המאקרו באמצעות הפקודה "תוספים - מאקרו -. ערוך" זו מציגה את קוד מאקרו המקור ומאפשרת התאמת פרמטרים מהירה. במידת הצורך, לשנות תיקייה עבור כל ערוץ בקוד המקור של מאקרו.
הערה: ערכים עבור ניתוחי סיב שריר מבוססים על שריר זרוע חולדה שרירי תולעת, מינים אחרים או שרירים עשויים לדרוש ערכים שונים. - השתמש בפקודה "הפעלה" כדי להתחיל את המאקרו. כל התמונות של התיקייה נטענות עכשיו לתוך מאקרו לכמת בסדר רצוף. התוצאות הן shown בחלון חדש. שלב זה עשוי להימשך בין שניות עד מספר שעות, בהתאם לכמות של להיות מנותחים נתונים.
- יצוא בחלון התוצאות כקובץ גיליון אלקטרוני. זיהוי ערכים עבור Cy5 נספר חיובי (לאט), FITC (ביניים) וטקסס האדום (מהיר) סיבים לסכם עבור מספר סיבים הכולל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שריר עכברוש שלמים חתכים הוכתמו במהירות באמצעות אימונוהיסטוכימיה לזהות MHC I, IIA סיבי שריר IIB. שימוש בסורק שקופיות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, החתכים כולו אז נרכשו באופן אוטומטי עבור סיב שריר אוטומטי מנתח עם ImageJ. הרעיון של ההליך מבוסס על מתן עבודה פשוטה, אמינה זמן יעיל עבור כימות של סיבי השריר.
זרימת העבודה של ההליך (איור 1) מתחילה עם הסרת הקפאה הנכונה של דגימות שריר, כפי שתוארה לעיל קודמת הדרכה על ידי מנג ואח. 27. זה חיוני עבור איכות מכתים נאותה. בשלב הבא, דגימות שריר נחתכים מוכתמות באמצעות נוגדנים עיקריים נגד ואני בכיתת חלבוני שרשרת כבדת שרירן, IIA ו- IIB לבין נוגדני ניאון משניים מתאימים. עבור אופטימלי staining איכות, הריכוזים המומלצים של היצרן עבור הנוגדנים משני הוכפלו ו טריטון X המשמש קוקטיילי הנוגדן לספק אפילו איכות מכתימה. מכתים immunofluorescent של סיבי השריר הוא מהיר עם תגובתיות צולבת קטין יכול להיות מושלם כ 5 h עבור קבוצות של עד 26 שקופיות ההגדרה שלנו. תמונות שהתקבלו הראו ניגודיות גבוהה בין סיב החיובי ורקמות שמסביב הבחנה חזקה בין סוגי סיבים שונים (איור 2). הבא, רכישת תמונה מתבצעת באמצעות סורק שקופיות המאפשר סריקה אוטומטית של חתכים שרירים כולו. הנה, עד 12 שקופיות נסרקות באופן אוטומטי, למשל, הלילה. בזאת, תמונות סקירה של חתכים נוצרות בפירוט גבוה עם רזולוציה המאפשרת בדיקה של מורפולוגיה סיב בודד (איור 2).
בשלב האחרון, ערוצים בודדים oסעיף ו כל צלב מיוצא עבור כימות של אוכלוסיות סיב שריר באמצעות מאקרו שתוכנן במיוחד עבור ImageJ. הניתוח האוטומטי לוקח כ 5-10 דקות עבור קטע שרירי עכברוש חוצה המכיל בין 3,000-6,000 סיבים, ואילו הניתוחים הידניים לקחו כ 60 דק '25. ניתוחים אוטומטיים מאוד תלוי בכוח המחשוב של גודל העבודה ואת הקובץ. כפי שהוצג קודם, המאקרו הוא מסוגל לזהות אוכלוסיות סיב השריר ביחס ברמת דיוק של ± 4% לעומת ניתוח ידני (איור 3). ספירה מוחלטת בסך הכל היא גבוהות בהשוואה ידנית ניתוחי, לעומת זאת, ספירה יחסית נשארה דומה בטווח ± 4%, כפי שהוצג קודם.
איור 1: Workflow של שריר סיבים כימות פרוטוקול. ראשית, דגימות שריר מתקבלותבעלי חיים קפוא כהלכה (ראו וידאו יופיטר ידי מנג et al. 27). ואז לחתוך שרירים חתכים ולערוך מכתים החיסון. לרכוש תמונות של חתכים מוכתמים באמצעות סורק שקופיות של תמונות חתכים שלמות מפורטות. הפעל את המאקרו כימות עבור ImageJ עבור אוכלוסיית סיב שריר המנתח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: שרירי העכברוש Biceps חתך. סקירה כללית של חתך שריר שרירי עכברוש צבעוני: החתך מציג סיבי MHC שאני איטיים בצהובים, סיבי MHC IIA ביניים סיבים ירוקים ומהירים MHC IIB באדום. אנא לחץ כאן כדי לצפות versi גדולעל דמות זו.
איור 3: שריר סיבים ניתוח תוצאות של סעיף עכברוש הצלב באיור 2. אנליזות של השריר MHC I, MHC IIA ו- MHC IIB סיבים. למעלה: ספירה מוחלטת של סיבי שריר על ידי ספירה ידנית או אוטומטית. התיכון: מנות יחסית של אוכלוסיות סיבי השריר לאחר כימות ידנית. למטה: מנות יחסית של אוכלוסיות סיבי השריר לאחר כימות מוחלטת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלה 1: מכתים immunohistochemical סיבי MHC. תיאור של נוגדנים ראשוניים ומשניים כולל דילולים המשמשים היםTaining ההליך. (שונה Bergmeister et al. 25)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנה, אנחנו מדגימים מתודולוגיה נגיש נרחב ללמוד ובאופן אוטומטי לכמת את האוכלוסיות סיבי שריר של חתכי עכברוש באמצעות אימונוהיסטוכימיה באופן יעיל בזמן. עבור שחזור, אנו מציגים צעד מפורט על ידי תיאור צעד ושינויים פוטנציאל יישומי מינים אחרים לא המתוארים במחקר זה. יתר על כן, אנו דנים ביתרונות של ההליך, תנאים מוקדמים לתפקוד אופטימלי ואת מגבלותיו.
נכון לעכשיו, מספר שיטות מכתימות להתקיים לזהות אוכלוסיות סיב שריר מספר השיטות תואר עבור כימות ידנית או חצי אוטומטי של סיבי שריר 17. עם זאת, אין פרוטוקולים קיימים המשלבים שניהם מתארים גישה סטנדרטית להכתים מהימנה אוכלוסיות סיב שריר באופן אוטומטי לרכוש ולכמת סיבי שריר, באמצעות זמין בחינם מנתחת תוכנה. בהתבסס על פרסומים קודמים"> 24, 29, אנחנו מותאמים קיימים נהלים מכתימים אימונוהיסטוכימיה שרשרת כבדת שרירן עבור ניתוחים אוטומטיים של אוכלוסיות סיבים ב חתכים בעכברים שרירים. ובכך, הראינו לאחרונה כי הניתוח האוטומטי של חתכים כולו אינו ריאלי, אמין לעומת ידני מנתח, ו עוד 27 זמן יעיל. בנוסף, השיטה היא ידידותית עצמאי ובכך להקטין טעות אנושה ובכך לספק השוואה אובייקטיבית כמו למשל בין קבוצות טיפול השונות.
הפרוטוקול כולו מתבסס על מתן תמונות מפורטות ואיכותיות של חתכים כולו לתהליך הכימות האוטומטי. ImageJ בתור תוכנת קוד פתוחה מספקת מספר פקודות פשוטות עדיין חזקות, אשר מסודרות מאקרו לאפשר זיהוי של סיבי שריר. עם זאת, הבדלים באיכות בתוך או בין צורך חתך להיות ממוזערים כדי להשיג תוצאות אמינות. יש לנו identifieד כמה צעדים קריטיים כי הם חיוניים כדי להשיג את האיכות הנדרשת. זה כולל את השימוש של נוגדנים ראשוניים אופטימליים. בדומה לכך, שימוש נוגדנים משני המתאימים מתן אותות ניאון מובחנים היה חיוני, ואנחנו הוכפלנו ריכוזים עבור איכות אות משופרת. בנוסף, צפינו איכות מכתים גבוהה ואפילו יותר עם שימוש טריטון X של קוקטיילי הנוגדן. חשוב לציין, זה לא נצפה עם שימוש Tween במקום. תמונות עם איכות מכתים לא טובה הותאמו באופן ידני עבור ניגודיות טובה יותר כדי לאפשר רכישת תמונה אוטומטית. החשוב ביותר לתהליך הרכישה הייתה הפונקציה הנכונה של מערכת הפוקוס האוטומטית. לשם כך, השתמשנו ערכת DAPI-להכתים את גרעין התא של תאי הלוויין, אשר סיפק נקודת ציון אמין עבור מערכת פוקוס אוטומטי.
לקבלת מידע אודות תהליך כימות ImageJ, ערכים אופטימליים נקבעו על ידי השוואה ידנית תוצאות אוטומטיות הרצוף בסדר-tuנינג של הפרמטרים 25: חלקיקי סף ולנתח. הערכים שהתקבלו היו מספיק שרירים שרירי תולעת ולכן שרירי עכברוש אפשרי אחרים. בנוסף, Bloemberg ואח. 24 הראו כי המכתים חל על מינים אחרים כגון בני אדם או עכברים. לכן, הפרוטוקול כולו ניתן להתאים באופן תיאורטי לשימוש ב מינים אחרים, אבל היה, לעומת זאת, דורש זיהוי הפרמטרים הדרושים. הפקודות הרלוונטיות מודגשות את קוד המקור.
שינויים אפשריים נוספים של ההליך כוללים את ההתקנה של סורק השקופיות. ב ההתקנה שלנו, השתמשנו במערכת סורק שקופיות, עם עדשה פי 2.5 עבור התצוגה המקדימה עדשת 20X לרכישת בפועל. בעוד שינוי העדשה לתהליך המקדים יספק שום תועלת משמעותית מבחינת איכות או מהירות, הרכישה יכולה להתנהל גם באמצעות עדשת 10X להגדיל את המהירות (ו consequently להקטין את הרזולוציה) או במקום עדשה 40X להגדלת הרזולוציה וכתוצאה מכך זמן הרכישה. כפי שאפשר לראות באיור 2, הגדלת הרזולוציה היא ככל הנראה לא הכרחי שרירי עכברוש אך ייתכן שתשקול מינים אחרים. שינויים אחרים שמתאימים בהגדרה זה מכתים עבור סיבי MHC-IIX או laminin לדמיין את תאי מטריקס של השריר. שינויים אלה, עם זאת, דורשים שינוי הגדרת הרכישה עבור שני מחזירים נוספים (עבור Cy7 למשל) ושינוי מאקרו ImageJ לכלול נוסף מנתח עם הפרמטרים הנכונים לקוד סקריפט.
מגבלה של טכניקה זו היא כי ספירת הסיבים המוחלטת הייתה משמעותיים גבוהה יותר לעומת ספירות ידניות בניתוח קודם, למרות ספירה יחסית נשארה 25 דומה. זהו ככל הנראה התוצאה של פרדה לקויה ובכך כימות חוזרות ונשנות של סיבים. אפקט זהקיים יותר סיבים כי הם מוכתמים או להציג סוגים אחרים כהלכה של חפצים. עם זאת, מספר עבירות סיבים יחסית ולכן אוכלוסיות סיבים נשאר מאוד מדויק. בהשוואה למקובל לכימות תת-חלק מוגדר של חתך, למשל 40%, ואנו מאמינים כי מנתח של החתך כולו על ידי ImageJ מדויקים יותר כתוצאת ארכיטקטורת סיב השריר הטרוגנית (איור 2) . מגבלת פוטנציאל של ההליך היא הדרישה להשתמש סורקי שקופיות יקרים עבור רכישה אוטומטית של החתך כולו, אשר אינם זמינות בדרך כלל. גישה חלופית היא לרכוש שדה בודד של נופים ולכמת כל אחד בנפרד על ידי המאקרו.
לסיכום, אנו מאמינים פרוטוקול זה הוא נגיש לציבור רחב ומאפשר כימות מהירה ואמינה של חתכים כולו שרירים באמצעות בחופשיות זמין מנתחת התוכנה. לכן, ההליך הציגמספק תרומה מועילה הניתוחים של מורפולוגיה סיב השריר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר כריסטיאן דופלר. ברצוננו להודות סבין ראושר מן הדמיה מתקן Core באוניברסיטה הרפואית של וינה, אוסטריה על התמיכה לאורך כל הפרויקט. נוגדנים ראשיים פותחו על ידי Schiaffino, ס, מבנק התפתחותית מחקרים Hybridoma, נוצר על ידי NICHD של NIH ומתוחזק באוניברסיטה של איווה, מהמחלקה לביולוגיה, איווה סיטי, IA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain) | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
References
- Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
- Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
- Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
- Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -X., Yu, J. -G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455 (2014).
- Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
- Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
- Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908 (2011).
- Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
- Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
- Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
- Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
- Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
- Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, Pt 2 341-349 (1994).
- Schiaffino, S., Reggiani, C.
- Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
- Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
- Lieber, R. L. Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore, MD. (2009).
- Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
- Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. chrijvers-, Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
- Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
- Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
- Guillen, J.
- Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586 (2014).
- Guillen, J.
- Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).
