Summary
Hier stellen wir eine neuartige Technik vor, die für die Aufzeichnung der Elektroenzephalographie (EEG) in frei bewegten neonatalen epileptischen Welpen und deren Beschreibung, Funktionen und Anwendungen entwickelt wurde. Diese Methode erlaubt es, EEG für mehr als 1 Woche aufzunehmen.
Abstract
EEG ist eine nützliche Methode, um elektrische Aktivität im Gehirn zu erkennen. Darüber hinaus ist es ein weit verbreitetes Diagnosewerkzeug für verschiedene neurologische Erkrankungen wie Epilepsie und neurodegenerative Erkrankungen. Allerdings ist es technisch schwierig, EEG-Aufnahmen bei Neugeborenen zu erhalten, da es eine spezialisierte Handhabung und große Sorgfalt erfordert. Hier präsentieren wir eine neuartige Methode zur Aufzeichnung von EEG bei neonatalen Rattenwelpen (P8-P15). Wir haben eine einfache und zuverlässige Elektrode mit Computer Pin Loci; Es kann leicht in den Schädel eines Ratten-Welpen implantiert werden, um qualitativ hochwertige EEG-Signale im normalen und epileptischen Gehirn aufzuzeichnen. Pups erhielten eine intraperitoneale (ip) Injektion der Neurotoxin-Kaininsäure (KA), um epileptische Anfälle zu induzieren. Die in diesem Verfahren durchgeführte chirurgische Implantation ist weniger teuer als andere EEG-Verfahren für Neugeborene. Mit dieser Methode können Sie qualitativ hochwertige und stabile EEG-Signale für mehr als 1 Woche aufzeichnen. Darüber hinaus kann dieses Verfahren auch auf erwachsene ra angewendet werdenTs und Mäuse, um Epilepsie oder andere neurologische Störungen zu untersuchen.
Introduction
Es ist gut etabliert, dass eine kontinuierliche Kommunikation zwischen Neuronen erforderlich ist, um eine normale Hirnfunktion zu erhalten. Die interneuronale Kommunikation findet primär bei Synapsen statt, wo Informationen von einem Neuron zu einem zweiten Neuron vermittelt werden. Diese synaptische Übertragung wird durch zwei Arten von speziellen Strukturanordnungen vermittelt: elektrische oder chemische Synapsen 1 . Die Elektrophysiologie ist das Feld, das das bei der interneuronalen Kommunikation erzeugte elektrische Potential erfasst, das die Gesamtkörperfunktionen und das Verhalten 2 kontrolliert. EEG ist die am häufigsten verwendete Methode unter vielen elektrophysiologischen Techniken.
EEG ist eine Technik, die verwendet wird, um Änderungen in elektrischen Signalen zu erkennen, die durch interne oder externe Reize erzeugt werden. Darüber hinaus ist es ein wesentlicher Test für die klinische Diagnose und Ergebnis Vorhersage der verschiedenen neurologischen Erkrankungen wie Epilepsie, Parkinson und Alzheimer-ErkrankungenE, sowie Wirkungen von pharmakologischen und toxikologischen Wirkstoffen 3 . Im Allgemeinen zeigt ein epileptischer Patient eine Übererregbarkeit und eine beeinträchtigte funktionelle Konnektivität im Gehirn; Diese werden als interictale epileptiforme Entladungen (IEDs) zusammengefasst und können von EEG in Form von scharfen, vorübergehenden Spikes aufgezeichnet werden; Scharfe Wellen; Spike-Wave-Komplexe; Oder polyspikes 4 Das Hauptmerkmal des epileptischen Gehirns ist das spontane Auftreten epileptischer Anfälle, die entweder aus der Kopfhaut oder aus dem Hirnparenchym aufgezeichnet werden können, um den für die Krampfanfälle verantwortlichen Gehirnbereich zu lokalisieren. Darüber hinaus hat EEG auch sehr wichtige Implikationen bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD). Forschung deutet darauf hin, dass veränderte EEG-Aufnahmen und beeinträchtigte Oszillationsnetze bei AD-Patienten häufig sind. Allerdings ist unser Wissen über die Pathophysiologie von Netzoszillationen bei neurodegenerativen Erkrankungen iS überraschend unvollständig und muss weiter erforscht werden 6 .
In diesem Protokoll haben wir eine einfache Elektrode entworfen, mit der man EEG aufzeichnen kann, um die elektrische Kommunikation sowohl im normalen als auch im pathologischen Gehirn zu verstehen. Die chirurgische Implantation in dieser Methode ist günstiger als andere verfügbare Verfahren 7 . Darüber hinaus kann mit dieser Methode qualitativ hochwertige und stabile EEG-Signale für längere Zeiträume ( dh 2-4 h jeden Tag für 1 Woche) aufgezeichnet werden. Darüber hinaus verwendeten wir leichtere Elektroden (mit einem Gewicht von ca. 26 mg), die es den Tieren ermöglichen, sich natürlicher zu verhalten 8 . Diese Methode ist weithin anwendbar auf die Untersuchung von EEG bei neonatalen Rattenwelpen, die den Verstärker und den Digitalisierer benötigen, die üblicherweise im Elektrophysiologie-Labor verwendet werden und keine zusätzlichen Vorrichtungen benötigen.
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Protocol
Tierpflege, chirurgische Verfahren und Aufzeichnungsverfahren wurden im Einklang mit den Richtlinien für die South China Normal University Animal Care and Use Committee.
1. Elektrodenherstellung (Abbildung 1A-C)
ANMERKUNG: Computer-Pin-Loci ist einfach ein markierter Kontakt als Teil der Signalschnittstelle in Kommunikationsgeräten. Es besteht aus einem Steckverbinder, der in die Buchse steckt.
- Trennen Sie die männlichen und weiblichen Stifte vorsichtig von den Computerstiften ( Abb. 1A ) mit Hilfe einer Zange. Verbinden Sie die männlichen und weiblichen Stifte zusammen, um eine Elektrode zu bilden, und wenden Sie Cyanacrylat an, um eine starke Klebeverbindung zu erzeugen (Abbildung 1C ).
- Setzen Sie die Elektroden in ein mit destilliertem Wasser gefülltes Becherglas und legen Sie es 10 min auf Ultraschallreiniger. Bewegen Sie sie zu einem Trockenofen bei 45 ° C für 30 min. Sterilisieren Sie die Elektroden mit UV-Licht für 30 min.
2. Chirurgisches Verfahren (Abbildung 1D-F)
- Bereiten Sie die sterilisierten chirurgischen Instrumente und stereotaxischen Apparate vor. Anästhesieren des neonatalen Rattenwelpen mit Isoflurananästhesie (2,5%) mit Luft. Wenn der Welpe tief betäubt ist, stellen Sie die Dosis von Isofluran auf 1,0% ein. Führen Sie eine Schwanz-oder Zehen-Prise vor der Operation, um die richtige Tiefe der Anästhesie zu gewährleisten.
- Fixieren Sie den Kopf des Welpen in den stereotaxischen Apparat, indem Sie die Ohrbügel in die Ohrkanäle legen und sie leicht anziehen.
HINWEIS: Die Ohrbügel nicht zu stark anziehen, da der Neugeborenenschädel sehr weich ist. - Halten Sie das sterile chirurgische Feld durch Sprühen aller Geräte mit 70% Ethanol. Machen Sie einen 15-mm-Einschnitt auf den Kopf mit einem Skalpell. Mit Pinzette, ziehen Sie die Kopfhaut vorsichtig von der Mittellinie an den vier Ecken ab. Setzen Sie etwas mit Salzlösung getränkte Baumwolle unter die Haut, um den Einschnitt weit offen zu halten ( Abbildung 1D ).
- Finde die Bregma und Lambda Punkte auf dem SchädelUnd markiere sie mit einem Bleistift. Verwenden Sie eine Spritzen-Nadel (26 G), um zwei Gratlöcher in die präfrontale Kortex (PFC) und Hippocampus zu machen.
HINWEIS: Der PFC befindet sich bei +1,8 mm hinter dem Bregma und -0,5 mm seitlich zur Mittellinie, während der Hippocampus bei -2,0 mm anterior bis bregma und ± 0,5 mm seitlich zur Mittellinie liegt (Abbildung 1D und E ). Die Tiefe der Elektrode sollte nicht mehr als 2 mm unterhalb der kortikalen Oberfläche liegen, um Hirnschäden zu minimieren. - Verwenden Sie Pinzette, um die Elektroden zu halten und legen Sie die Referenz- und Aufzeichnungselektroden in die PFC und den Hippocampus ein. Tragen Sie Erythromycin-Salbe um die Elektrode, um eine mögliche Infektion zu vermeiden. Fixieren Sie die Elektrode mit Cyanacrylat.
- Bereiten Sie Zahn-Acryl-Zement, so dass es eine klebrige und viskose Konsistenz hat. Tragen Sie den Zahnzement auf, um die Elektroden und den Rest des Schädels zu bedecken.
HINWEIS: Den Schädel vor dem Auftragen des Zahnzements gründlich trocknen. 5% Pikrinsäure auf die Elektroden auftragen, um sie zu schützen.
HINWEIS: Das gesamte Verfahren sollte in einer Biosicherheitshaube durchgeführt werden, um sterile Bedingungen zu erhalten. - Entfernen Sie das Tier aus dem stereotaxischen Rahmen und injizieren Sie 300 μl 10% Glukose subkutan. Legen Sie es auf eine beheizte Decke für die Erholung. Stellen Sie sicher, dass das Tier warm ist (37 ° C) und ambulant ( dh vollständig wiederhergestellt). Verabreichung von Buprenorphin intraperitoneal (0,05 mg / kg) für postoperative Schmerzen
HINWEIS: Lassen Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es genügend Bewusstsein (dh normales Verhalten und Bewegung) wiedererlangt hat. - Bring den Welpen zu seinem Hauskäfig mit ihrem Damm zurück, nachdem er das Bewusstsein wiedererlangt hat. Warten Sie zwei Tage, bis das Tier vollständig erholt ist.
3. EEG-Aufzeichnung
- Nach vollständiger Wiederherstellung die Elektroden, die auf den Schädel des Welpen implantiert sind, an den Verstärker im eigenen Käfig anschließen. Verbinden Sie den Verstärker mit einem Analog-Digital-COnverter und den Konverter an einen Computer anschließen; Die Verbindungslinien sollten sorgfältig behandelt werden, damit sie sich nicht verheddern.
- Wählen Sie für die Aufzeichnung mindestens 10.000 Hz Abtastrate auf der Datenerfassungseinheit (die Bandbreite des Senders beträgt 1-100 Hz). Stellen Sie sicher, dass die Daten ordnungsgemäß abgetastet werden.
- Nach dem Erfassen der Baseline-Aufnahme injizieren Sie den Welpen intraperitoneal mit Kainsäure (KA) (2 mg / kg), um epileptische Anfälle zu induzieren. 15 min nach der KA-Injektion beobachten und aufzeichnen die epileptischen Entladungen. Beschlagnahme durch KA sind meist körperlich.
HINWEIS: Die ictal-tonische Dauer beträgt etwa 15,2 ± 0,9 s, die Anfallsdauer beträgt etwa 62 ± 5 s. Krampfanfälle können in der Neugeborenen-Ratte durch die IP-Injektion von Chloralhydrat (400 mg / kg) verhindert werden. - Speichern Sie die digitalisierten Daten und analysieren Sie sie mit Signalverarbeitungs-Softwarepaketen wie spike2. Zeigen Sie den Leistungspegel der verschiedenen Frequenzkomponenten im neonatalen EEG-Signal per perf anOrming eine Leistungsspektrumanalyse. Berechnen Sie die Leistung in einem 1-min-Zeitrahmen, indem Sie die mittlere quadratische Amplitude von 1 bis 100 Hz (EEG-Band) 9 finden .
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Representative Results
Wenn die obigen chirurgischen Eingriffe ordnungsgemäß durchgeführt werden, wird eine Neuzugriffs-EEG-Aufzeichnung mit einer Kanal-Ratte erfolgreich durchgeführt. 10 min nach der KA-Injektion entstand ein regelmäßiges Muster von Verhaltenszeichen in Form von unregelmäßigen Bewegungen und Kratzen, Zittern und Verlust des Gleichgewichts. Abbildung 2 zeigt die repräsentativen Roh-EEG-Spuren und interictalen, ictal-tonischen und ictal-clonic-expandierten Spuren. Wiederkehrende interictale und ictale EEG-Entladungsmuster begannen 15-60 min (30 ± 5,2 min, Mittelwert ± SEM) nach KA-Injektion (Abbildung 2A und 2B ). Fig. 2D und 2E stellen die tonisch-klonischen Anfälle dar, die der häufigste Typ sind. Die ictal-tonische Dauer dauerte 15,2 ± 0,9 s ( Abbildung 2D ). Die repräsentativen Ergebnisse zeigten, daß tonische Entladungen von klonischen Bursts folgten ( Fig. 2B, 2D und 2E ).
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Abbildung 1: Abbildung des chirurgischen Implantationsprotokolls. ( A ) Kleine Computerstifte ( B ) Buchse (links) und Stecker (rechts). Der Maßstab wird verwendet, um die Länge des weiblichen Stiftes zu messen. ( C ) Verbundener weiblicher und männlicher Stift. ( D ) Explosionsschädel Nr. 1 stellt die Referenzstelle vor, Nr. 2 präsentiert Bregma, Nr. 3 und 4 vorhandene Aufnahmestellen und Nr. 5 präsentiert Lambda. ( E ) Elektrodenimplantation Nr. 1 zeigt die Referenzelektrode, Nr. 3 und 4 die Aufzeichnungselektrode. ( F ) Wiedergewonnener Rattenwelpe (P9). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 2: KA-induzierte neonatale Beschlagnahme. ( A ) Eine repräsentative EEG-Spur von einer P10-Ratte, die mit KA (2 mg / kg, ip) injiziert wurde, zeigte wiederkehrende epileptische Burst-Entladungen. ( B ) Erweiterte Ansicht von einzelnen clusterähnlichen epileptischen Entladungen aus der Box in A. ( C , D und E ) Typische interictale, ictal-tonische und ictal-clonische Spuren erweitert aus der Box in B. ( F ) Zusammengefasste Daten zeigen Die durchschnittliche EEG-Leistung (1 min Zeitfenster) vor und nach der KA-Injektion (Mittelwert ± SEM). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: EEG-Aufnahme-Setup. Repräsentative Spurenaufzeichnung ist shoWn in frei bewegten neonatalen Rattenwelpen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hier berichten wir über chirurgische und Aufzeichnungsverfahren, um EEG in frei bewegten neonatalen Rattenwelpen durch verdrahtete Methode zu erwerben (Abbildung 3 ). Es wurde vorgeschlagen, dass der P7-P12 Rattenwelpe im Entwicklungsalter ist, der einem Vollzeit-menschlichen Neonat 10 , 11 entspricht. Es ist technisch schwierig, bei der Arbeit mit Rattenwelpen in dieser Altersgruppe qualitativ hochwertige EEG-Aufzeichnungsdaten zu erhalten. Darüber hinaus erfordert es spezialisierte Handhabung und große Sorgfalt 8 .
Frühere Studien, die in vivo EEG-Aufnahmen bei Neugeborenen-Ratten untersuchen, wurden unter Verwendung von drahtgebundenen Aufzeichnungslösungen in P12 oder älteren Tieren 12 durchgeführt, aber diese Ansätze sind sehr kostspielig. Indem wir uns auf einfache Elektroden verlassen konnten, konnten wir eine Elektrode ( Fig. 1 ) herstellen, die die Kosten des Experiments auf so wenig wie $ 1 reduziert, während immer noch hochdichtes EEG vorhanden istAufnahmen Die chirurgische Implantation in dieser Methode kann bis zu 10 min dauern, abhängig von der Komplexität der Chirurgie.
Die kritischen Schritte in diesem Protokoll sind die Implantation von Elektroden. Es sollte sorgfältig gemacht werden. Um einen konstanten Kontakt der Elektrode mit dem Schädel aufrechtzuerhalten, sind die folgenden Schritte wichtig zu berücksichtigen. Zuerst entfernen Sie die Gewebe Schutt auf dem Schädel mit Hilfe von sterilisierten Wattestäbchen, weil es die Elektrode aus dem Schädel auseinander setzen kann. Zweitens verwenden Cyanoacrylat richtig, um die Elektrode mit dem Schädel zu befestigen. Drittens die ausreichende Viskosität des Zahnzements beibehalten. Es ist besser, Dentalzement in zwei Schichten anzuwenden; Die erste Schicht sollte ein wenig dicht sein, um den Schädel zu bedecken, während die zweite Schicht ein wenig laufend sein sollte, um die Ecken der ersten Schicht zu bedecken. Den Zinn mit einer Pipettenspitze vorsichtig abtupfen, um ihn festzulegen, um die starke Klebeverbindung zu machen. Wenn es zu wässrig ist, kann es eine isolierende Schicht unter dem elektrOde, und wenn es zu dicht ist, wird der Dentalzement leicht vom Schädel wegen seines eigenen Gewichts fallen. Es ist auch wichtig, die Körpertemperatur des Welpen bei 37 ° C während der Operation zum Überleben aufrechtzuerhalten.
Die Anwendung dieses Verfahrens ist auf die Aufzeichnung von EEG in neonatalen Rattenwelpen zwischen dem Alter von P8 und P15 beschränkt, da die wachsenden Welpen den Dentalzement und die Elektrode aus ihrem Schädel entfernen können. In Bezug auf weitere Anwendungen kann dieses Verfahren auch verwendet werden, um die elektrische Aktivität von erwachsenen Ratten und Mäusen nach einer geringfügigen Modifikation aufzuzeichnen. Darüber hinaus eignet sich diese Methode gut, um in verschiedenen Verhaltens-Experimente, wie die erhöhte plus Labyrinth verwenden.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (31171355) und der Naturwissenschaftlichen Stiftung von Guangdong (S2011010003403, 2014A030313440) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer pin | |||
| Pincer | DELI Group Co., Ltd. | ||
| 502 super glue | DELI Group Co., Ltd. | 7144 | |
| Drying oven | Boxun | GZX-9140MBE | |
| Isofluorane | RWD Life Science | 902-0000-522 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 900-0068-507 | |
| Anesthesia apparatus | RWD Life Science | 902-0000-510 | |
| Homeothermic Heating Device | Harvard Apparatus | K 024509 | |
| Amplifier Model 3000 | A-M Systems | 61558 | |
| Micro1401 Analog Digital converter | Cambridge Electronic Design Ltd. | 4383 | Data acquisition unit |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Ltd. |
References
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