Summary
このプロトコルでは、操作が簡単です、1 つのテストで複数の核酸の視覚的検出に適用することができます小さなに使えるカセットの製作について説明します。このアプローチでキャピラリー配列は遺伝子組み換えターゲットの多重化・高能率化の検出に使われました。
Abstract
病気の診断、微生物モニタリング、遺伝子組み換え作物 (GMO) 検出でマルチ ターゲット、短時間、および単一のテストを動作するように簡単に複数の核酸の検出のためリソース手頃な方法論が急務とフォレンシック分析。以前 calm (Capillary Array ベースLoop lamp 法核酸のMultiplex の視覚的検出の) プラットフォームを説明しました。ここで、改良試作し、このプラットフォームのパフォーマンス プロセスについて述べる。ここでは、核酸の多重の視覚的検出のためのキャピラリー配列によって組み立てられる小さい、すぐ使えるカセットを適用されます。キャピラリー配列で毛細血管ループ lamp 法 (ランプ) のプライマー セットを修正する前に疎水性と親水性パターンに前処理をされます。読み込みアダプターの組立後ランプ反応混合物が読み込まれ、1 回のピペッティング操作によって毛管力によるそれぞれの毛細血管に分離します。ランプの反応は、毛細血管に並列で実行されます。結果は手持ち UV 懐中電灯照明による視覚的に読み取られます。このプラットフォームを使用すると、頻繁に高い特異性と感度要素と GMO サンプルの遺伝子を登場 8 の監視を紹介します。要約すると、記載プラットフォームは複数の核酸の検出を容易にするものです。高スループット核酸分析が必要な分野で広く適用可能と考えています。
Introduction
臨床診断1,2,3, GMO 検出4などの分野の広い範囲で複数の核酸の同時検出のための低コスト、迅速、かつ使いやすいシステムが急務します。 5,6、微生物、特にポイント ・ オブ ・ ケア検査 (POCTs)、フォレンシック分析10,11,7,8,9の監視リソース通常限られた12,13,14はします。
ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)、リアルタイム PCR およびマルチプレックス PCR 派生メソッドを含む、これらのフィールドで検出するための最も広く応用テクニックです。ただし、これらの方法通常のみ検出ターゲットを 1 つ 1 つテスト15で、電気と高度な専門機器を要求します。
核酸を検出するための別の有望な技術はループ lamp 法 (ランプ) は最初に 2000年16で説明します。ランプは、高効率遺伝子検出法です。理論的には、一定温度、(すなわち60-65 ° C の間) で行うすべて 1 時間以内 amplicons 109枚に 1 コピーから増幅することができますそれ。成功した増幅は不溶性副産物ピロリン酸の大量を生産し、濁度17を直接肉眼で観測することができるの変化を引き起こします。金属イオンや水酸基ナフトール ブルー20や核酸色素19、18カルセインの蛍光染料添加による色の変化がご覧いただけます。高感度の利点と操作の利便性のためランプが広く核酸の検出に適用されています。
現在、マルチプレックスアッセイ ランプの主に 2 つの方法があります。複数のランプを持っていることによって複数のランプの試金を実行することです 1 つ 1 つの管21,22,23のプライマーを設定します。しかし、多様性と増幅効率は、本質的な干渉と異なるプライマー セット間の競争によって制限でしょう。さらに、同じ反応の異なるランプ製品を識別するために困難になることができます。別の戦略は、物理的な分離に基づいています。個々 の小型コンパートメントに隔離された異なるプライマー セットと複数のランプの反応が同時に実行されます24,25。マイクロ流体チップに基づいています一般的に、これらのアプローチは、高スループット ランプ反応の潜在的なソリューションを提供します。しかし、チップの製造とプライマー セットの多重塗装の前処理は複雑で、コストが増加して再現性を減少させる可能性があります。
最近では、いくつかの研究は、マイクロ流体チップの複雑な加工をバイパスして、低コストの検出26,27を達成している毛細血管で実行するランプの反応を説明しています。ただし、ハイスループット分析に関してこれらの毛細血管に似ている PCR ストリップ管のミニチュア版サンプルと反応試薬 (異なるプライマー セットを含む) する必要がありますであるため個別に準備および別に配信毛細血管内の反応ユニット。並列とマルチプレックス解析を達成するために追加の機器、たとえばマルチ チャンネルのシリンジ ポンプはサンプルや試薬の並列読み込みに必要。
核酸の多重検出のための現在の方法に関連付けられている制限を克服するためには、キャピラリー配列とビジュアルのランプ技術を組み合わせた小型のプラットフォームを行った。このプラットフォームは、マルチ ターゲット、コンパクト サイズ、低コスト、および28を動作するように簡単です。ここで、キャピラリー アレイを作製し、配列のランプ反応を実行する方法の詳細について述べる。モデルとして遺伝子組み換え作物 (GMO) の検出を使用してここで説明されているプロトコルが標準化されました。重要なは、このプロトコルは、他の核酸ターゲットのハイスループット検出にも使用できます。
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Protocol
注: このプロトコルは、目的のマイクロ チャネルおよび読み込みアダプターの形状のベアリング ステンレス鋼の金型が既に行われたこと前提としています (3 D ファイル 補足のファイル 1 として提供されますと 2。).このプロトコルはまた植物の DNA の隔離が行われて既に前提としています
。1 キャピラリー アレイ ・ ベースに使えるカセットの作製
- きれいにステンレス鋼モールド。。
- 潜在的な汚染物質を除去するために洗浄洗剤、エタノール、脱イオン水、ステンレス鋼の金型。窒素による金型をドライします 。
- 毛細血管をきれい
- 摩耗安全ゴーグル、ラボと制服と化学防護手袋 。
- ビーカーに場所の毛細血管。有機物を削除する 5 分の 30 mL のアセトンで毛細血管をきれいにし、脱イオン水で毛細血管を洗い流しします
。 注意: ヒューム フードにアセトンを処理します 。
- は、H 2 O 2 の 10 mL をビーカーに注ぎ、ため遅くなることと H 2 O 2 に 4 の過熱を防ぐために揺れに、H 2 の 30 mL を追加します。(ピラニア溶液) が完全に少なくとも 30 分の毛細血管をカバーを確認してください
: 注意ピラニア ソリューションの処理中 (H 2 SO 4/H 2 O 2 = 3:1、v/v) .ピラニア ソリューションをこぼした場合大量の水を迅速にソリューションを洗い流すし、ペーパー タオルで表面を拭く
。 注: は毛細血管の徹底的なクリーニング ランプ反応の成功を確保する重要なポイントの一つです。、毛細血管で気泡を除去するクリーニング処理中に酸のシリンダーを振るべきだし、きれい時間は、必要なときにも拡張できます。 - はピラニア ソリューション大量の水で洗い流します。エタノールと 5 分の脱イオン水で毛細血管を洗います。乾燥乾燥オーブンで毛細血管 。
- ポリジメチルシロキサン (PDMS) を注ぐ
- 50 mL のチューブに 1:1 の比率と PDMS ベースと硬化試薬を重量。通常、エラストマーに 5 g 硬化剤エラストマーの基本の 5 g をミックスします 。
- は、徹底的にガラス棒で約 5 分のための混合物をかき混ぜなさい。脱気のため 30 分間真空ベルジャーの PDMS 管を配置します 。
- は、ステンレス鋼の金型のシリンダーに、PDMS をゆっくり注ぐ。60 ° C で乾燥オーブンで 3 時間を治すため PDMS を許可
注: PDMS を注ぐときに空気の泡を避けるために注意してください。5 分自然の PDMS の気泡の除去用スタンド注ぐ PDMS 後 。
- PDMS から金型を削除
- 、PDMS を硬化後シリンダーと金型を抜き金型を削除します。PDMS をシリンダーからメスと金型の余白を切断することによって削除します 。 3 回エタノールと脱イオン水洗浄 PDMS を
- 。窒素乾燥、PDMS サポートします 。
- 疎水性する PDMS サポートの下の面を扱います。ソーク、PDMS サポート超疎水性は室温で 10 分間それを 1 s. ドライのコートします 。 PDMS サポートにキャピラリーを挿入
- 洗浄 4 mm 毛細血管を PDMS サポートの穴に挿入し、PDMS サポートの上面外毛細血管の 0.5 mm のまま。毛細血管の両端が同じレベルを確認してください 。
- 毛細血管の外側表面とする疎水性 PDMS サポートの上面を扱う。
- 、PDMS の上面に追加 15 μ L の超撥水コートをサポートします。注意: コーティング上面毛管力によって (PDMS サポートの上面および毛細血管の露出部分の外面を含む) 中すぐに広がる 。
- 空気乾燥超疎水性の修正したキャピラリー配列 。
- キャピラリー配列のプライマーを修正
- プライマー ソリューションを準備します。0.65 g のキトサンを重量 (分子式: (C 6 H 11 4) n) 〜 4.5 5.5 1.3% のキトサン濃度を達成するために酢酸で pH を調整することで 50 mL の脱イオン水に溶解します。表 1 に従ってプライマー コンポーネント ミックスを準備します。プライマーの 補足表 1 を参照してください
- 1 セットの定義済み順序に従ってキャピラリー配列の 1 つの対応する毛細血管を埋めるためのプライマーの混合物の追加 1.6 μ L.
注: 残り 2 つ空白毛細血管がネガティブ コントロールとして設定します 。
- 標準平底 96 ウェル プレートの透明よく配列を固定し少なくとも 2 h. 60 ° C で配列を乾燥
| ランプ プライマー ミックス コンポーネント (初期濃度) を修正 | ボリューム (μ L) |
| ddH 2 O | 17.0 |
| キトサン (1.3%) | 1.0 |
| FIP/BIP プライマー (20 μ M) | 2.0/2.0 |
| LoopF/LoopB プライマー (20 μ M) | < td> 1.0/1.0|
| F3/B3 プライマー (20 μ M) | 0.5/0.5 |
| 容量 | 25.0 |
テーブル 1: ランプのコンポーネント試薬を固定プライマー。ミックスを固定ランプ プライマーのコンポーネント テーブルの左側の列にリストされ、各コンポーネントのボリュームは右の列に記載されています
。- は、次のようにカセットを組み立てます。固定配列の上に読み込みアダプターを置きます。アダプターの皿がちょうどすべて 10 毛細血管 (参照してください 図 1) の露出部分をカバーを確認してください 。
図 1: カセット作製とアセンブリ。(、) ステンレス金型と、PDMS をサポートします。金型は、3 つの部分で構成されています: シリンダー、ダム板と柱プレート。PDMS の回路図 (b) サポートの加工及び組立キャピラリのカセット。全体のプロセスには 5 つのステップが含まれています: 1。 PDMS、注いで 2。 削除、3 型。 キャピラリーを挿入する、表面コーティング、4。 プライマーを修正し 5。カセットを固定します。1. 鋳型のシリンダーに PDMS を注ぐ2. PDMS から金型を削除するダム、ボードをプッシュをサポート;3. コート PDMS の下面をサポートし、PDMS に毛細血管を挿入をサポートして、最後に PDMS サポートの上部の表面をコート、毛細血管を公開します。太い青線を示す超撥水コート;4. 個々 の毛細血管にプライマーを読み込む5. キャピラリー配列内の単一の 96 ウェル プレートを固定し、その上にアダプターを読み込むサンプルをインストールします。詳細は、プロトコルの手順 1.1 1.9 で記載されています。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください
2 キャピラリー アレイでパフォーマンスのランプ反応
- 反応混合物の準備
- T ができる 2 に従ってランプ反応混合物の準備。 。
- 5 の テーブル 2 と渦反応混合物のように選択した順序に従って混合物に追加試薬 s カルセインを追加した後。穏やかにvert Bst ポリメラーゼ後 20 回チューブが追加されます 。
| ランプのコンポーネント(初期濃度) | ボリューム (μ L) |
| ddH 2 O | 11.6 |
| MgSO 4 (100 mM) | 2.0 |
| dNTPs (25 mM) | 1.4 |
| ベタイン (5 M) | 4.0 |
| (10 倍) をバッファー | 2.5 |
| カルセイン (1.25 mM) | 0.5 |
| MnCl 2 (25 mM) | 0.5 |
| Bst ポリメラーゼ (8 U/μ L) | 1.5 |
| 植物の DNA (10 ng/μ L) | 1.0 |
| 容量 | 25.0 |
表 2: キャピラリー配列ランプの反応システムです。 キャピラリー配列ランプのコンポーネントの反応システムのコンポーネントは、左側の列に記載されて、各部のボリュームが右側の列に記載されています
。- 試薬をロードしカセットのシール
- ピペット 20 μ L ランプ反応混合物と標準的な 100 μ L チップ。それをロックする読み込みアダプターの入口に先端を挿入します。優しくアダプター; の皿に反応混合物を注入します。反応混合物はすぐに皿を満たし、毛管力によって自動的に毛細血管を読み込んで 。
- ロックの先端にアダプターを削除してよく PCR 互換の透明シール フィルムで封止する
。 注: 親水性の皿に反応混合物に触れて毛細血管のみが満たされることが。だからすべての毛細血管の上部が同じ高さ (参照してください 図 2) を確認してください 。
図 2: サンプルの読み込み読み込みアダプターを使用しての図。画像は、例として青色の溶液を用いた読み込みプロセスを示しています。入口に先端を挿入、ゆっくりと、アダプターにサンプルを注入、ロック先端アダプターを取り外します。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください
- 加温 1 h. 63 ° C でインキュベーターでキャピラリー配列
3 結果の読み出しやデータ分析
- 蛍光性の放出の画像を取得します。。
- 可視光をフィルターに小さな手持ち UV LED 懐中電灯の上面に UV フィルターを修正します 。
- UV 懐中電灯と蛍光を放出する解離カルセインを刺激します。デジタル カメラやスマート フォン、キャピラリー配列の上からイメージをキャプチャします 。
- 画像を撮るときはカメラを高品質を取得するには、画像をオフに可能な限りの毛細血管のエリアにズームインを確認します 。
- 結果を分析
- 画像、画像解析ソフトウェアを開き、[" 画像 > 金型 > グレースケール > はい " と " 画像 > 金型 > 16 ビット > はい "。選択 " ファイル > として保存 > 形式 > TIFF " 16 ビット TIFF 形式に画像を変換にします 。
- は、マイクロ アレイ解析ソフトウェア蛍光強度
- オープンの値を抽出します。ソフトウェアのインターフェースに 16 ビットの TIFF 形式の画像をドラッグし、波長を選択 " 532 nm " との色 " 緑 " イメージを表示します 。
- 毛細血管から蛍光信号を検索する新しいブロックを作成します。選択 " ツール > 新しいブロック " として行と列の数を入力し、" 1; 1 " と " 2; 5 " で、' ブロック ' と ' 機能 ' インターフェイスを個別にします 。
- を右クリックし、選択 " 機能 " モデル、場所および毛細血管の蛍光領域に合わせて直径を調節します。選択 " 分析 " の蛍光強度の値を抽出します 。
- 選択 " ファイル > として設定を保存 " ブロックの文書を保存し、選択 " ファイル > として結果を保存 " 蛍光強度の結果を保存します。ランプが毛細血管に正常に実行するかどうかを定義する sn 比を計算します
。 注: 毛細血管の信号はスポットと信号対ノイズ比 (Snr) の灰色の値は、2 つの負のフォア グラウンド信号の平均値を平均するターゲットのフォア グラウンド信号の平均値の比として定義された記録によって得られました。制御します。肯定的な信号を決定するためのカットオフは、SNR として設定された > 2.
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Representative Results
このメソッドは、サンプルの読み込み中に別の毛細血管の間で交差汚染を防止することが重要です。このため、個々 の毛細血管でプライマーを保持できるキトサンは導入されました。それが働いたかどうかどうかをテストするため我々 固定済み"T"と"U"のパターンで毛細血管のカセットに設定 ADH1 (トウモロコシの遺伝子内因性参照) プライマーのよう図 3 a。予想通り、毛細血管に含まれるプライマーのみ設定表示肯定的な信号 (図 3 b)。
図 3: キャピラリー結果の例です。(、) キャピラリー配列のレイアウト。緑色の斑点は、ADH 1 プライマー セットが毛細血管で事前に固定されることを示します。(b) 蛍光ランプ後 2 つのキャピラリー配列の写真。緑の色は、肯定的なランプ増幅を発表しました。重複して試験を行った。正常な拡大のみプライマー固定毛細血管で、空白の毛細血管の中で汚染なしを提示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
さらに遺伝子組み換えを監視する能力を評価するため選んだ 7 頻繁に使用される形質転換要素の商業化された遺伝子組み換えイベント 〜 75% をカバーする (すなわち、P CaMV35S、バー、cp4 epsp、P FMV35S、パット、T nos と nptII) (図 4、レイアウト) を毛細血管数 1-7、トウモロコシ (ADH1) 1 つの内因性の参照の遺伝子に対応します。このメソッドは、3 つの GM イベントの特異性を示す (MON863、MON89034、59122) された選択し、穏やかに適用。結果の分析、蛍光画像はカメラで撮影されプロトコルの手順の説明と分析します。(図 4) のすべてのテストの予想される結果を得た。たとえば、GM トウモロコシ MON863 の肯定的な信号は 1、6、7、および 8 P CaMV35S のターゲットに対応する毛細血管の得られた T nos、nptII、および内因性の参照の遺伝子 ADH1、それぞれ。
図 4: 遺伝子組み換え作物を監視するため特異性。すなわち、異なる DNA サンプルの検出 MON863、MON89034 59122、ミックスすべての上記の 3 つの GM イベント (GMO ミックス)、非 GM トウモロコシおよび純粋な水 (テンプレート コントロールなし、NTC)。1-8: 毛細血管P CaMV35S、バー、cp4 epsp、P FMV35S、パット、T 番 nptIIとADH 1、ランプ プライマー セットを個別に固定済み。9-10、2 つのプライマーのコントロール。テストが重複で行われ、すべての結果が期待と一致したことがわかった。データ分析の補足表 2を参照してくださいこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
実世界のアプリケーションの手法の性能をテストするため 2 つの実用的なトウモロコシのサンプルは穏やかなによって分析のために選ばれました。結果は一貫した (図 5、補足表 2) をしたリアルタイム PCR の結果と比較するしました。
図 5: 2 つのトウモロコシのサンプル テストの結果です。1-8: 毛細血管P CaMV35S、バー、cp4 epsp、P FMV35S、パット、T 番 nptIIとADH 1のランプのプライマー セットを個別に固定済み。9-10、2 つのプライマーのコントロール。重複のテストを行ったし、リアルタイム PCR のそれと比較した結果が一致していた。比較結果の補足の表 3を参照してください。データ解析のための補足の表 2を参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足表 1: リストのランプのプライマー シーケンス。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足テーブル 2: ランプのデータ解析アレイ実験。表の緑の色分けされたセルは、肯定的な結果を示しています。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足テーブル 3: リアルタイム PCR の結果報告フォーム。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
ランプ技術を組み合わせたキャピラリー配列、単一の非常に効果的かつ簡単にテストの操作で複数の GMO 関連遺伝子ターゲットの同時検出を有効に穏やかなプラットフォームは、ここで示します。
カセットで多重ランプ反応を正常に実行、3 つの重要なポイントが注目される必要があります。まず、毛細血管の上側とキャピラリー配列の親水性と疎水性のパターンの同じ高さを達成するため、すべての毛細血管に試薬を同時に読み込むため重要です。読み込みアダプターの皿に読み込まれた反応混合物を触れることができるそれらのすべてのために PDMS サポートに初期挿入後、毛細血管はプレートして配置されます。超撥水コートとキャピラリー配列を扱うときでは、毛細血管の内側の表面に浸るコートは使用できません。PDMS をサポートする毛細血管の上部の部分の外側の面にも波及するコーティングをできるように上部の表面にコートだけをロードすることによって毛細血管の外側の表面を扱います。それは時折すべての毛細血管は試薬が満ちているが発生した場合、特定の毛細血管に直接試薬をロードするが賢明かもしれません。
第二に、ランプ試薬の調製に注意します。全体のプロセス実施されなければならない慎重かつ迅速にランプの比較的低い反応温度とBstポリメラーゼのもろさのための氷の上。Bstポリメラーゼを追加した後軽くボルテックス チューブの代わりにランプの混合物と反応管を激しく振ることをお勧めします。反応不適切な取扱いに失敗可能性があります。この実験では、ADH1 (トウモロコシの遺伝子内因性参照) は肯定的な制御として、プライマーなし 2 毛細血管が空白のコントロールとして設定します。だから、ランプの混合物が正しく処理される場合肯定的な制御は緑を示すし、テストが実行された後は、空のコントロールは変わらないだろうと。
第三に、ランプ反応の高効率化のためは、偽陽性や持ち越しの汚染は環境の DNA 増幅の微量がある場合に起こることがあります。そのため、常にさまざまな分野で、反応前と反応後の営業プロセスを厳密に区切る必要があり、ランプ製品を厳密に密閉して解析後に破棄する必要があります心に留めておいてください。さらに、空白のコントロールを設定して、ランプの十分な性能を示すください。
本質的に、穏やかな良い柔軟性と拡張性を持つ普遍的なマルチ ターゲット核酸検出法であります。毛細血管でランプ反応は等温増幅法、ローリング サークル増幅 (RCA)29, シュプリンガー ポリメラーゼの増幅 (RPA)30などの他の種類によって簡単に置き換えることができます。また、病原体検出の27と疾患の診断の31など、他の検出の分野で適用することができます。
このメソッドの現在の形式でこのプライマー セット、キトサン、修正済みランプ混合物の準備のプロセスまだ必要ですテストが実行される方法のシンプルさを下げる。これに対処するためは、我々 は毛細血管のランプのすべての試薬をプリロードし、カセットにサンプルをピペットをしようと思います。本手法のもう一つの制限は、核酸抽出不足かもしれませんが、本当の"のサンプルと結果を達成するためにデータ分析、撮影、イメージの自動核酸抽出を併せ持つモバイル ベースのマシンを進めています。"メソッド。
要約すると、キャピラリー配列の多重ランプを統合することにより穏やかなプラットフォームを開発しました。一般的な核酸の検出方法として穏やかなも他核酸解析アプリケーションの広い範囲で可能性がある可能性があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
新世紀優秀な才能のため、国立自然科学財団の中国の補助金 (31370813、3147670、31670831、31600672、)、国民のトランスジェニック植物特別基金 (2016ZX08012-003、005 2016ZX08012)、プログラムによって本研究は一部で賄われて大学、主要研究と中国 (2016YFA0500601) および中国ポスドク科学財団 (2016 M 591667) の開発プロジェクトです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UltraEverDry(super-hydrophobic coat) | UltraTech | 4001 | supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD. |
| PDMS | Dow Corning | 8332557 | |
| Bst polymerase | New England BioLabs | M0275L | |
| betain | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| calcein | Sigma-Aldrich | C0875-5G | |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | MKBP0495V | |
| MgSO4 | New England BioLabs | B1003S | |
| dNTPs | Shanghai Sangon | B804BA0022 | |
| chitosan | Shanghai Sangon | LJ0805S309J | |
| Photoshop 7.0 software | Adobe Systems Inc., CA, USA | Image analysis | |
| GenePix Pro 6.1 | Molecular Devices, CA, USA | microarray analysis software | |
| AutoCAD | Adobe Systems Inc. | 3D construction software | |
| UV filter (ZWB2) | YXSensing | supplier : taobao |
References
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