Summary
Hypofunction الغدة اللعابية نتيجة متكررة للعلاج بالإشعاع وأمراض المناعة الذاتية. التقييم استنساخه من وظيفة الغدة اللعابية في نماذج الماوس لهذه الأمراض تحديا تقنيا. وهنا يتم وصف طريقة بسيطة لقياس دقيق واستنساخه لإنتاج اللعاب في الفئران.
Abstract
المرضى الذين يعانون من المتلازمة في سيورغن، أحد أمراض المناعة الذاتية التي تؤثر في إفرازات الغدد، تطوير التهاب الغدة اللعابية وخفضت إنتاج اللعاب. وبالمثل، يتم إنتاج اللعاب لخطر شديد في المرضى الذين يتلقون العلاج الإشعاعي لسرطان الرأس والعنق. تسهيل فهم إمراضية المرض نماذج القوارض، وضعت لتقليد هذه الشروط السريرية، والسماح لوضع استراتيجيات علاجية جديدة. ولذلك، القدرة على دقة، وتكاثر، ومرارا وتكرارا قياس وظيفة الغدة اللعابية في نماذج حيوانية أمر بالغ الأهمية. وبناء على الإجراءات المذكورة سابقا في الأدب، وضعت أسلوب يفي بهذه المعايير وكان يستخدم لتقييم وظيفة الغدة اللعابية في الفئران. ميزة إضافية لهذا الأسلوب الجديد هو أنه يتقن بسهولة، وقد تباين بين المشغل صغيرة. يتم تقييم الدالة الغدة اللعابية كمبلغ (الوزن أو الحجم) أو معدل اللعاب تنتج استجابة للتحفيز pilocarpine (مل/دقيقة). تجمع اللعاب مصدر جيد لتحليل محتوى البروتين، وتركيزات الغلوبولين المناعي، والجزيئات الحيوية الأخرى.
Introduction
تنتج الغدد اللعابية اللعاب في الاستجابة لمجموعة متنوعة من المحفزات العصبية والميكانيكية1. ويجري من خلال النظام العصبي متعاطفة والجهاز السمبتاوي مستقبلات ادريناليه واتروبين في الغدة المحفزات. بيلوكاربيني هو عامل اتروبين، الفقرة--مقلدات الذي يعمل أساسا على المستقبلات المسكارينيه. في الغدة اللعابية، فإنه يحفز إنتاج اللعاب بالنيابة على مستقبلات أستيل المسكارينيه M31. مؤشرا لقدرة الغدد اللعابية للاستجابة لتحفيز إنتاج اللعاب بعد الإدارة pilocarpine ويستخدم عادة كمقياس لوظيفة الغدة اللعابية.
القياس الدقيق لإنتاج اللعاب أمر بالغ الأهمية في دراسة أمراض الغدة اللعابية بما في ذلك متلازمة في سيورغن2 وإصابة الإشعاع عقب الرأس والرقبة علاج السرطان3. وقد وضعت عدة طرق مختلفة لقياس إنتاج اللعاب في القوارض. وتشمل هذه كانوليشن مباشرة من القناة اللعابية مطرح4، وجمع من اللعاب من تجويف الفم تحت فراغ5، وجمع باستخدام الزجاج الشعيرات الدموية6 أو7،ميكروبيبيتي8، 9-المباشر يوفر كانوليشن للقناة اللعابية اللعاب أكثر دقة ونقية. ومع ذلك، هذا إجراء تحديا من الناحية التقنية، ويحول دون إمكانية التسبب في إصابة الأقنية مجموعات اللعاب المتكررة من الحيوان نفسه. جمع اللعاب تحت فراغ يمكن أن يؤدي إلى نتائج متغير بسبب جفاف اللعاب من الأنبوب. زيادة مبالغ هذه الخسارة في الفئران مع انخفاض اللعاب. الزجاج الشعيرات الدموية تسمح جمع اللعاب للتحاليل اللاحقة، ولكن يمنع التغييرات في لزوجة اللعاب يفرز في حالة المريضة ملء الكفء شعري. علاوة على ذلك، محاولة اكتساح تجويف الفم لجمع بقايا اللعاب يمكن أن تؤدي إلى إصابات. الأسلوب بيبيت يسمح لمجموعة كاملة، والمشغل نفسه، أنها متسقة ملحوظ بين التجارب. ومع ذلك، لأسباب غير معروفة، هذا الأسلوب يظهر تباينا كبيرا بين مختلف العاملين. ولذلك، تسمح بإجراء مقارنات مناسبة، يصبح من المحتم أن المشغل نفسه ينفذ جميع التجارب ذات الصلة بمشروع معين. ومن الواضح أن هذا يمثل عائقا رئيسيا لمختبر.
ووضعت إجراء للتغلب على هذه المشكلات، أن يجمع بين أساليب جمع اللعاب تستخدم للبشر والقوارض. طريقة مسحه، الموصوفة أدناه لقياس حجم اللعاب الناجم عن بيلوكاربيني هو بسيط، واستنساخه، لا تتأثر بالمشغل، ويمكن أن يؤديها مرارا وتكرارا في الحيوان نفسه. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه يسمح جمع اللعاب للتحاليل اللاحقة من البروتينات المناعية أو الجزيئات الحيوية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأقر البروتوكول، المذكورة أدناه برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة وأنه يتبع المبادئ التوجيهية الأخلاقية التي وضعتها "المعاهد الوطنية للصحة". جميع البيانات الواردة في هذا التقرير تم إنشاؤها بواسطة استخدام الفئران الإناث التي كانت الأسابيع 10-12 من العمر. واستخدمت السلالات التالية من الفئران: C57BL/6، بالب/ج، DBA1، 129S، و F1 (B6XA/ي). جميع الفئران يسكنون في أقفاص الحاجز (5 الحيوانات في قفص) في ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض وتوفير الأعلاف والمياه ad متواصلة.
1-إعداد
- لإعداد حل أسهم هيدروكلوريد pilocarpine، تزن 10 مغ المجمع وحل في 1.776 مل من المحلول الملحي متساوي التوتر العقيمة التي فورتيكسينج، تعطي حلاً أسهم من 5.63 mg/mL. ليس هناك حاجة لتعقيم هذا الحل. ولكن إذا رغبت في ذلك، تصفية عن طريق فلتر 0.2 ميكرون. تخزين هذا الحل الأسهم في مختبرين متعددة في ثلاجة-80 سج لمدة تصل إلى 3 أشهر. كل الأسهم المجمدة للاستخدام مرة واحدة. وبمجرد مذاب، لا تجميد الحل بيلوكاربيني.
- تأخذ 0.6 مل [ميكروفوج] أنابيب ولكمه ثقب صغير في الجزء السفلي من كل أنبوبة بعناية مع إبرة عيار 18 ساخنة. قم بتعيين هذه الأنابيب في أنابيب 2 مل. لا يلزم أن يكون الأنابيب معقمة.
- استخدام شفرة حلاقة حادة، عقيمة، قطع مسحات ماصة أسطواني إلى قطع طولها حوالي 2 سم. قص كل قطعة 2 سم قطرياً لإعطاء 2 مسحات على شكل مخروطي. ضع مسحه واحدة في كل من 0.6 مل [ميكروفوج] أنابيب.
- وزن 0.6 مل [ميكروفوج] أنابيب تحتوي على مسحه جافة.
- نقل الفئران دراستها في قفص نظيفة جديدة مع زجاجات المياه. تبقى الفئران دون طعام ح 2 على الأقل قبل بدء جمع اللعاب للحيلولة دون تلوث اللعاب جمع جزيئات الغذاء.
ملاحظة: ليس من الضروري للحفاظ على الماوس 1 كل قفص لهذا الإجراء. ومع ذلك، عدد الفئران التي وضعت في كل قفص يعتمد على المؤسسة المحددة في القواعد والأنظمة للاستخدام الحيواني. - فقط قبل نهاية ح 2، تعد الحل pilocarpine العامل (0.0563 mg/mL) بتمييع الحل الأسهم x 100 في المحلول الملحي المعقم. فإنه ليس من الضروري لمواصلة تصفية تعقيم هذا الحل. دائماً الحل pilocarpine العامل على الجليد.
ملاحظة: ويورد الجدول 1 مقدار بيلوكاربيني بالحقن لمجموعة من أوزان الجسم الماوس إعطاء جرعة نهائي 0.375 مغ/كغ من وزن الجسم.
2-الإجراء
- تزن كل الماوس وتحديد جرعة مزيج مخدر لكل الماوس باستخدام الجدول 1. حقن أول ماوس بحجم مناسب لمزيج مخدر عن طريق داخل. تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 2 دقيقة (معظم سلالات الماوس اختبارها في هذا البروتوكول الذهاب إلى النوم قبل 2 دقيقة). تأكد من أن الماوس يتم تخديره بشكل صحيح بسبب الافتقار إلى المشي عند وضعه على سطح مستو. إذا كان الماوس لا يزال يسير، انتظر 2 دقيقة إضافية قبل المتابعة إلى الخطوة التالية. تطبيق قطره من زيوت التشحيم مرهم العيون لكلتا العينين لمنع التجفيف.
ملاحظة: في الجدول 1، جرعة مزيج مخدر مل 0.007/غرام من وزن الجسم. النطاق الأمثل لهذا الإجراء مل 0.006 إلى 0، 008/غرام من وزن الجسم. ومع ذلك، بعد دقيقة 4، إذا كان الماوس لا يزال المشي أو نستعرض الحركات متشنج، أن يتشاور مع الطبيب البيطري المؤسسية لزيادة جرعة المخدر على نحو ملائم. - تحديد جرعة pilocarpine للماوس باستخدام الجدول 1 وحقن كمية مناسبة من داخل المسار. تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 2 دقيقة وأدخل الماوس في أنبوب 50 مل ريسترينير حتى الرأس والاذنين عصا من نهاية قص. ضع الأنبوب بزاوية 45 درجة، مع الرأس إلى أسفل، والسطح البطني الأعلى. الشريط على أنبوب للمجلس الداخلي لمنعها من التحرك.
ملاحظة: يوفر الجدول 1 الجرعة للفئران أكثر من 17 ز، كما لا محاولة هذا الإجراء على الفئران وزنها أدناه ز 17. - في نهاية 2 دقيقة، إدراج زوج مغلقة من تشريح الملقط في الفم الصغير برفق ورفع الفك السفلي إلى الأعلى لفتح الفم. ادفع الملقط 1-2 ملم زيادة في الفم، والتأكد من أن ينظر اللسان يستريح في أعلى الذراع الملقط. مع زوج آخر من الملقط غرامة، عقد مسحه جافة قبل موزون قريبة من طرفها المخروطي.
- حرك المخروطية تلميح المسحة برفق في الفم. سحب الملقط مع ترك الحافة المسحة في تجويف الفم.
- فهم أوسع نهاية مسحه تمتد خارج الفم وتدوير للسماح الحد الأقصى للمساحة للاتصال مع الفم. الاحتفاظ المسحة في هذا المنصب لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: وهذا ما يضمن أن يبقى المسحة في الفم للمدة جمع. لاحظ أن تلميح المخروطية المسحة بمثابة الفتيل والجزء الأوسع من مسحه ما زال خارج الفم. - في نهاية مدة 15 دقيقة، تدوير مسحه لجمع أي اللعاب التي استوعبت لا برفق ووضع مسحه الرطب في 0.6 مل [ميكروفوج] أنابيب. إغلاق الأنبوب ووضعه في أنبوب 2 مل على الجليد.
ملاحظة: في هذا الوقت، سوف تظهر الغشاء المخاطي للفم جافة تماما. الماوس يمكن الآن نقل العودة إلى قفصة للتعافي من التخدير. - نقل الماوس في القفص. مكان مبلل الكريات الغذاء في القفص بعد جمع اللعاب للمساعدة الإماهة أسرع.
ملاحظة: الفئران يستيقظ داخل 10 دقيقة بعد نهاية المجموعة. قد تمنح أيضا تحت الجلد حقن المحلول الملحي متساوي التوتر تحسنت قبل 0.2 مل لتسريع الانتعاش. - المضي قدما بالماوس القادم. الجميع ينبغي أن ترصد الفئران حتى أنهم استعادوا تماما وهي الإسعافية.
3-القياسات
- في نهاية كافة المجموعات، تزن أنابيب 0.6 مل مع مسحه الرطب. حساب الفرق بين الوزن الرطب والوزن الجاف للحصول على وزن اللعاب المنتجة. ضع الأنبوب 0.6 مل مع اللعاب إلى أنبوب 2 مل.
- قطع قبعات أنابيب 2 مل. ثم الطرد المركزي أنابيب 2 مل لمدة 2 دقيقة في ز 7500 x، في 4oC في أجهزة الطرد مركزي الصغرى لاسترداد اللعاب. قياس حجم اللعاب الحصول عليها باستخدام ميكروبيبيتي.
- التعبير عن النتائج كاللعاب الوزن (mg)10 أكثر من 15 دقيقة، أو كنسبة من وزن اللعاب (ملغ)/الماوس من وزن الجسم (ز).
ملاحظة: إذا تم قياس حجم اللعاب المستخرجة من أصل المسحة، التعبير عن النتائج كحجم اللعاب المستردة (mL) أو النسبة من حجم اللعاب (mL)/الماوس من وزن الجسم (ز).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في النظم النموذجية التجريبية الماوس، يتم استخدام القدرة على إنتاج اللعاب استجابة للتحفيز بيلوكاربيني كمؤشر لوظيفة الغدة اللعابية. في الفئران الإناث C57BL/6 عمره 11 أسبوع تقاس طريقة مسحه إنتاج اللعاب. الشكل 1A، يتم التعبير عن النتائج بكمية اللعاب (mg) جمعت بعد جرعات متزايدة من بيلوكاربيني. في الجرعة 1 ملغ/كغ من وزن الجسم، بدأ بعض الفئران العارضة الشدة (تهز غير الطوعي ويرتجف). ومن ثم لم يتم اختبار الجرعات العالية من pilocarpine، تتجاوز 1 مغ/كغ من وزن الجسم في هذه الدراسة. الشكل 1B، تمثل النتائج كنسبة وزن اللعاب (mg) على وزن الجسم الماوس (ز). وتوضح هذه البيانات مجتمعة، علاقة استجابة جرعة جيدة بين إنتاج كمية واللعاب pilocarpine. وتم أيضا قياس حجم اللعاب شُفي المسحة. كما هو مبين في الشكل 1، وهناك توافق كبير بين اللعاب الوزن والحجم حيث يساوي 1 مغ لعاب 0.001 مل.
النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام أسلوب مسحه مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام أسلوب جمع ماصة. الشكل 2 (أ) يظهر أن متوسط كمية اللعاب التي تم جمعها بطريقة مسحه وطريقة بيبيت مشابهة جداً والاختلافات ليست هامة إحصائيا. الشكل 2 ، ج 2 و 2D تبين أن الأسلوب مسحه لا يؤثر تقدير الجزيئات الحيوية في اللعاب. في الواقع، بالمقارنة مع الأسلوب بيبيت، الأسلوب مسحه أظهرت اتجاها عموما أعلى في مستويات متوسط مجموع البروتينات اللعابية (الشكل 2)، والنشاط lysozyme اللعابية (الشكل 2D) واللعابيه إيغا (الشكل 2E). غير أن هذه الاختلافات ليست إحصائيا هامة.
طريقة جمع اللعاب الموصوفة هنا قادراً على الكشف عن اختلافات كمية اللعاب التي تنتجها سلالات مختلفة من الماوس (الشكل 3) والغدة اللعابية hypofunction الناجمة عن ظروف المرض مختلفة (الشكل 4). يبين الشكل 3 ألف نتائج pilocarpine الناجمين عن إنتاج اللعاب من الفئران C57BL/6، بالب/ج، DBA1/ي و 129S6 الإناث تبلغ من العمر 10-12 أسبوع. الفئران 129S6 تنتج أقل كمية اللعاب مقارنة بالسلالات الأخرى. تجدر الإشارة إلى أن الفروق في أوزان الجسم هذه الفئران لم تكن تختلف اختلافاً كبيرا (الشكل 3B). بعد ذلك، استخدمت طريقة مسحه للكشف عن الغدة اللعابية hypofunction، واثنين من الأمثلة تظهر في الشكل 4. يظهر الشكل 4A ممثل نتيجة hypofunction الغدة اللعابية الناجمة عن تفعيل الحصانة الفطرية بعد حقن lipopolysaccharide (LPS) (10 ميكروغرام/الماوس، إينترابيريتونيلي). تم حقن الفئران السيطرة المالحة11. الفئران المعالجة بلبس تظهر انخفاضا كبيرا في اللعاب بالمقارنة مع عناصر التحكم. نقل سلبي الأجسام المتفاعلة مع متلازمة مستضد سيورغن A/Ro52 يدفع hypofunction الغدة اللعابية، وهذا النموذج يحاكي جوانب معينة من سيورغن لمتلازمة9. كما هو موضح في الشكل 4 باء، حقن الفئران مع الشب adjuvant بالإضافة إلى الأجسام المضادة Ro52 معا وكان إنتاج اللعاب أقل بكثير مقارنة بالفئران غير المعالجة أو الفئران تعامل فقط مع الشب.
طريقة مسحه بسيط لتنفيذها وعامل مستقل. يبين الشكل 5 إنتاج اللعاب من عمره 10-13 أسبوع الإناث الفئران C57BL/6، في التجارب التي يؤديها في نقاط زمنية مختلفة 6 شركات مختلفة 2. عامل التشغيل بدأت بشهرين فقط من الماوس التعامل مع التجربة بينما المشغل الثاني كان 6 أشهر ماوس السابقة التعامل مع التجربة، ولكن فقط عرض لطريقة جمع اللعاب لمدة أسبوع واحد. وقد تولدت هذه البيانات في التجارب التي أجريت سنة واحدة تقريبا عن بعضها البعض، باستخدام جرعة pilocarpine 0.375 مغ/كغ. نسب اللعاب التي حصل عليها كلا المشغلين تظهر مجموعة من القراءات (1.84 إلى 5.87). عامل أنا للتجارب امتدت فترة 10 أسابيع حين أجريت تجارب "المشغل الثاني" أكثر من 3 أيام متتالية تقريبا بعد عام واحد (الشكل 5A). جدير بالذكر أن اللعاب النسب التي تم الحصول عليها على مر الزمن لم تكن تختلف اختلافاً كبيرا (p = 0.064؛ اختبار كروسكالواليس). كذلك مقارنة الاختلافات بين المشغل، نسب الوزن اللعاب كل غرام من وزن الجسم من 3 تجارب لكل عامل تم تجميعها وترد في الشكل 5B. نسب اللعاب التي أحرزتها المشغل (يعني + وزارة شؤون المرأة؛ 4.45 + 0.152، n = 38) لا تختلف كثيرا عن المشغل 2 (يعني + وزارة شؤون المرأة؛ 4.21 + 0.169; n = 25؛ ف = 0.296 باختبار مان ويتني).
رقم 1: إنتاج اللعاب مرهون بجرعة بيلوكاربيني. تم حقن الفئران C57BL6/ي (5 كل مجموعة من الإناث عمره 11 أسبوع) بجرعات مختلفة من بيلوكاربيني (0.25 مغ/كغ، 0.5 ملغ/كغ و 1.0 مغ/كغ من وزن الجسم) وتم قياس الإنتاج اللعاب عن 15 دقيقة (أ) النتائج التي يتم تمثيلها ملغ اللعاب المبلغ (يعني ± ووزارة شؤون المرأة). (ب) تمثل البيانات كنسبة اللعاب يعني (اللعاب مغ كل ز الماوس من وزن الجسم). (ج) اللعاب من الفئران C57BL/6 أنثى عمرها 11 عاماً في الأسبوع (n = 5) تم تجميعها بواسطة الأسلوب مسحه. واستخدمت بيلوكاربيني بجرعة 0.375 مغ/كغ من وزن الجسم. بوزن مسحات الرطب قياس كمية اللعاب المنتجة في مغ. ثم استرد اللعاب في مسحات بالطرد المركزي، وتم قياس أحجام اللعاب المستردة. ويعتبر الاتفاق الهام بين وزن اللعاب في حجم ملغ واللعاب في ميليلتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: طريقة مسحه لا أثر تحليل الجزيئات الحيوية في اللعاب. اللعاب من مجموعات 2 من عمره 11 أسبوع الإناث الفئران C57BL/6، (n = 5 الفئران كل مجموعة)، جمعت بطريقة مسحه أو بأسلوب ميكروبيبيت. الاختلافات في حجم متوسط من اللعاب (A)، يعني كميات من البروتين (ب)، يعني مبالغ lysozyme النشاط (ج)، ويعني كميات من إيغا بين المجموعات 2 ليست هامة إحصائيا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: طريقة مسحه من جمع اللعاب يكشف الاختلافات في إنتاج اللعاب خط الأساس بسلالات مختلفة من الفئران. (أ) تم جمع اللعاب من الإناث (10-12-أسبوع) الفئران لمدة 15 دقيقة باستخدام جرعة pilocarpine 0.375 مغ/كغ من وزن الجسم. (ب) أوزان الجسم يعني بين مجموعات الفئران لم تكن تختلف اختلافاً كبيرا. وقد تم تحليل الأهمية الإحصائية للاختبار، تليها دن كروسكال-واليس اختبار المقارنات المتعددة. ف < 0.05 اعتبرت هامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: طريقة مسحه بالكشف عن الغدة اللعابية hypofunction. (أ) (A B6 X/J) تم حقن الفئران الإناث F1 بحل لبس أما (0.1 مغ/مل، 0.1 مل في الماوس، إينترابيريتونيلي) أو المالحة، واللعاب وتم قياس ح 26 في وقت لاحق. يظهر تجربة ممثل الكبير (p = 0.0079) انخفاض إنتاج اللعاب في الفئران (60%) تعامل مع لبس. (ب) وتم قياس hypofunction الغدة اللعابية في نظام نموذج تجريبي ماوس لمتلازمة سيورغن. كان نموذج منشورة سابقا السلبي نقل لتحريض خلل غدي المستخدمة4 مع بعض التعديلات. تم حقن الفئران C57BL/6 الإناث (10-12 أسابيع من العمر) مع الشب adjuvant. في أيام تم حقن الفئران 14 و 20 مع 0.05 مل مصل Ro52 مكافحة الأرانب وتم قياس الإنتاج اللعاب بعد حاء 24 ملاحظة هامة (p = 0.0003) انخفاض إنتاج اللعاب في الفئران (50 ٪) تعامل مع الشب ومكافحة Ro52 المصل. وقد تم تحليل الأهمية الإحصائية للاختبار، تليها دن كروسكال-واليس اختبار المقارنات المتعددة. ف < 0.05 اعتبرت هامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: طريقة مسحه غلة النتائج استنساخه على مر الزمن (A) وبين المشغلين (ب)- ويبين الأسلوب مسحه النتائج قابلة للمقارنة بين الشركتين مع أطوال مختلفة التعامل مع التجربة في التجارب التي أجريت في أكثر من سنة واحدة بالماوس. وتم قياس إنتاج اللعاب خط الأساس في الفئران الإناث C57BL/6 (10-13 أسبوعا عمر) بكل عامل. يتم التعبير عن النتائج بوزن لعاب المنتجة (ملغ/غرام وزن الجسم). مواعيد جمع اللعاب على المحور س، وتظهر النتائج من البيانات التي تم جمعها على مر الزمن (A)- وتمثل كل نقطة بيانات واحدة من الماوس، ويرد العدد الفئران التي تم تحليلها في كل وقت في أقواس. الأساس اللعاب نسب (يعني + SEM) تجميع من 3 تجارب تظهر (ب)، ولا تختلف اختلافاً كبيرا بين المشغلين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إنتاج اللعاب هو عملية معقدة، ويتأثر بعوامل عديدة. ولذلك، يمكن قياس وظيفة الغدة اللعابية في الحيوانات المختبرية تحديا. تحديا إضافيا أن القياسات المتكررة لوظيفة الغدة اللعابية في الحيوان نفسه المطلوب لإثبات ظهور المرض أو إظهار الاسترداد بعد العلاج.
الأسلوب مسحه الموصوفة في هذا التقرير بسيطة من الناحية التقنية للقيام بخيارات متعددة لتمثيل البيانات. النتائج التي تم الحصول عليها يتم استنساخه، مع اختلاف بسيط بين المشغل. الأسلوب يمكن الكشف عن انخفاض في إنتاج اللعاب في نماذج مختلفة من اختلال وظيفي في الغدة اللعابية. ميزة كبيرة هي استخدام البوليمرات العالية ماصة خاملة، وكفاءة الاسترداد من اللعاب التي تم جمعها، مما يتيح قياس الجزيئات الحيوية اللعابية. وهناك ميزة أخرى لهذا الأسلوب أنه من الممكن القيام بهذا الإجراء في وقت واحد في الفئران تصل إلى 2 في وقت واحد بعامل واحد. هذا إلى حد كبير أكثر كفاءة من بعض الأساليب الأخرى، حيث أنها تتم في ماوس واحدة في وقت واحد.
التغير في قياسات إنتاج اللعاب قد لعنة من جميع تقنيات قياس اللعاب. لتقليل التباين، من المهم أن تتقيد بدقة بالبروتوكول. وتشمل الخطوات الحاسمة: تحديد الوقت نفسه اليوم للصيام الفئران وجمع اللعاب، الاقتضاء جرعات من مخدر و pilocarpine (الجدول 1)، وسجلات دقيقة الوزن من مسحات الجافة والرطبة. إدارة الوقت الدقيق مطلوب لتعيين ما يصل إلى 2 الفئران في وقت واحد لجمع اللعاب.
كما هو موضح في الشكل 3، كمية اللعاب التي تنتجها الفئران من سلالة تعتمد. وهكذا، مناسبة السلالة والعمر والجنس ينبغي أن تستخدم الفئران المتطابقة كعناصر تحكم. معايرة جرعة pilocarpine، لسلالة معينة وشرط التجريبية التي يجري التحقيق فيها، ينصح بشدة. على الرغم من أن يدفع أعلى جرعة pilocarpine تتجاوز 0.5 ملغ/كغ زيادة إنتاج اللعاب، لتقييم hypofunction غدي، يوصي باستخدام جرعة أقل. وهذا ما يسمح للتعرف على الاختلافات الطفيفة حتى في إنتاج اللعاب بين المريضة والتحكم في الفئران. جرعة 0.5 ملغ/كغ من وزن الجسم و 0.375 مغ/كغ من وزن الجسم قد استخدمت بنجاح لإثبات hypofunction الغدة اللعابية. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن بعض النظم النموذجية التجريبية قد تتطلب فترات أقصر أو أطول من مجموعة من تلك الموصوفة في هذا البروتوكول. وينبغي اختبار هذا بكل مختبر.
حد لهذا الأسلوب، ومعظم طرق قياس اللعاب هو الحاجة للتخدير. لا يتضمن التقرير مع أسلوب فراغ استخدام مخدر5. ومع ذلك، نظراً لغياب التخدير الحث على مستويات متفاوتة من القلق في الفئران. أنها تميل إلى النضال ولدغة في الأنابيب، والتي بدورها يمكن أن تؤثر كفاءة الإنتاج وجمع اللعاب. التخدير إيسوفلوراني في الفئران الحث على إنتاج لعاب pilocarpine الناجمين عن إيواء12. وفي المقابل، يزيد الكيتامين إفرازات الشعب الهوائية واللعاب من خلال تحفيز متعاطفة مع13. نحن وآخرون قد استخدمت بنجاح الكيتامين وخليط xylazine كمخدر لقياس pilocarpine الناجمين عن اللعاب إنتاج4،7،،من89. النطاق الموصى به للتخدير الجراحي هو 100-200 ملليغرام/كغم الكيتامين و 5-16 مغ/كغ من إكسيلازيني14. جرعة 0.006-0.008 مل/وزن الجسم ز المستخدمة في هذا الأسلوب (يتوافق مع 60-80 ملليغرام/كغم الكيتامين و 6-8 ملغ/كغ من إكسيلازيني) يقع في الطرف الأدنى من النطاق الموصى بها وهي كافية لتوفير مستوى متناسق للتثبيت دون تخدير عميق .
طريقة مسحه أنشئ كبديل للأسلوب ميكروبيبيت تستخدم بشكل روتيني. وكان العيب الرئيسي للأسلوب بيبيت تباين بين المشغل عالية، والحاجة إلى جمع اللعاب من الماوس واحد في وقت واحد. طريقة مسحه يعالج هذه المشاكل على حد سواء. وتشمل الفوائد الحد من عدد الحيوانات اللازمة للوصول إلى السلطة في التحليلات الإحصائية وزيادة الكفاءة. استبدال مسحات القطن مع مسحات البوليمر خاملة العرض خيار أفضل منذ مسحات القطن معروفة لتأثير كوانتيتيشن من الجزيئات النشطة بيولوجيا15.
ونظرا لبساطة طريقة مسحه وفي إمكانية تكرار نتائج عالية بين مختلف الأفراد، يؤمل أن الأسلوب مسحه سيسهل إجراء مقارنات أفضل نماذج الماوس بين المؤسسات والباحثين في مختبرات مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة منحة من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني لطب الأسنان والجمجمة البحوث (DE025030).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
References
- Proctor, G. B.
- Fox, R. I. Sjögren's syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren's syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Cold Spring Harbor Protocols. Cold Spring Harb Protoc. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2006).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
