Summary
Spytkirtel hypofunction er en hyppig følge af autoimmune sygdomme og stråling terapi. Reproducerbare evaluering af spytkirtel funktion i musemodeller af disse sygdomme er en teknisk udfordring. Her beskrives en simpel metode til nøjagtig og reproducerbar måling af spyt produktion i mus.
Abstract
Patienter med Sjögrens syndrom, en autoimmun sygdom, der påvirker eksokrine kirtler, udvikle spytkirtel betændelse og har reduceret spyt produktion. På samme måde, spyt produktion er alvorligt kompromitteret i patienter, der får strålebehandling for hoved og hals kræft. Gnavere modeller, udviklet til at efterligne disse kliniske tilstande, lette forståelsen af sygdom patogenese og mulighed for udvikling af nye terapeutiske strategier. Derfor er evne til præcist, reproducerbar, og gentagne gange måle spytkirtel-funktion i dyremodeller kritisk. Bygning på procedurer tidligere beskrevet i litteraturen, blev en metode udviklet som opfylder disse kriterier og blev brugt til at evaluere spytkirtel funktion i mus. En yderligere fordel ved denne nye metode er at det er let behersker, og har lidt Inter operator variation. Spytkirtel funktion er vurderet som den mængde (vægt eller volumen) eller sats (mL/min) af spyt fremstillet i svar til pilocarpin stimulation. De indsamlede spyt er en god kilde til analyser af proteinindholdet, immunoglobulin koncentrationer og andre biomolekyler.
Introduction
Spytkirtlerne producerer spyt som svar på en række forskellige neurologiske og mekaniske stimuli1. Stimuli sker gennem det sympatiske og parasympatiske nervesystem til de adrenerge og kolinerge receptorer i kirtlen. Pilocarpin er en kolinerge, para-sympatomimetisk middel, der virker overvejende på muskarine receptorer. I spytkirtel inducerer det produktionen af spyt ved at handle på muskarine acetylcholin receptor M31. Spyt produktion efter pilocarpin administration er en indikator for evne til spytkirtlerne til at reagere på stimulering og er almindeligt anvendt som en foranstaltning af spytkirtel-funktion.
Nøjagtig måling af spyt produktion er kritisk i studiet af spytkirtel sygdomme herunder Sjögrens syndrom2 og stråling skade efter hoved og hals kræft behandling3. Flere forskellige metoder har været udviklet til at måle spyt produktion i gnavere. Disse omfatter direkte cannulation af ekskretionsorganerne spyt kanal4, samling af spyt fra mundhulen under vakuum5og samling ved hjælp af glas kapillærer6 eller en mikropipette7,8, 9. direkte cannulation af spyt kanalen giver den mest præcise og rene spyt. Men dette er en teknisk udfordrende procedure, og potentialet for duktalt skade udelukker gentagne spyt samlinger fra de samme dyr. Indsamling spyt under vakuum kan føre til varierende resultater som følge af tørring af spyt fra røret. Dette tab er yderligere overdrevet i mus med nedsat spytsekretion. Glas kapillærer tillader indsamling af spyt for efterfølgende analyser, men ændringer i viskositeten af spyttet udskilles i den syge tilstand forhindrer effektiv fyldning af kapillar. Yderligere, forsøg på at feje mundhulen for at indsamle resterende spyt kan føre til skade. Med pipette overfoeres metode giver mulighed for komplet samling, og til den samme importør, det er bemærkelsesværdigt konsekvente mellem eksperimenter. Af ukendte årsager viser denne metode dog betydelig variation mellem forskellige operatører. Derfor for at foretage passende sammenligninger, bliver det bydende nødvendigt, at den samme operatør udfører alle eksperimenter relateret til et bestemt projekt. Klart, dette udgør en stor ulempe for et laboratorium.
For at overvinde disse problemer, blev en procedure udviklet at kombinerer spyt samling metoder anvendes til mennesker og gnavere. Vatpind metode, beskrevet nedenfor til at måle pilocarpin-induceret spyt volumen er enkel, reproducerbar, ikke påvirket af operatøren, og kan udføres flere gange i den samme dyr. Derudover gør det muligt at indsamle spyt for efterfølgende analyser af proteiner, immunglobuliner eller andre biomolekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen beskrevet nedenfor blev godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg og det følger de etiske retningslinier af National Institutes of Health. Alle data præsenteres i denne rapport blev genereret ved hjælp af kvindelige mus, der var 10-12 ugens i alder. De følgende stammer af mus blev anvendt: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S og (B6XA/J) F1. Alle mus blev opstaldet i barriere bure (5 dyr pr. bur) i specifikt patogenfrie betingelser og leveret foder og vand ad libitum.
1. forberedelse
- For at forberede en stamopløsning af pilocarpin hydrochlorid, 10 mg af sammensat og opløses det i 1.776 mL steril isotonisk saltvand ved vortexing, at give en stamopløsning 5.63 mg/ml. Der er ingen grund til at sterilisere denne løsning. Men hvis det ønskes, filtrere det gennem en 0,2 µM filter. Gemme denne stamopløsning i flere delprøver i en-80 oC fryser i op til 3 måneder. Hver frosne bestand er til engangsbrug. Når optøet, ikke genfryses pilocarpin løsning.
- Tage 0,6 mL mikrofuge rør og omhyggeligt punch et lille hul i bunden af hvert rør med en opvarmet 18-gauge kanyle. Sæt disse rør i 2 mL rør. Rør behøver ikke at være steril.
- Ved hjælp af en skarp, steril barberblad skæres cylindrisk absorberende svaberprøver i stykker ca 2 cm i længden. Skær hver 2 cm stykke diagonalt for at give 2 konisk formede svaberprøver. Placer en vatpind i hver af de 0,6 mL mikrofuge rør.
- Veje 0,6 mL mikrofuge rør indeholdende tør svaber.
- Overføre mus til at blive undersøgt i en ny ren bur med vandflasker. Holde mus uden mad i mindst 2 timer før starten af spyt samling at forhindre fødevarer partikler fra forurener spyt indsamlet.
Bemærk: Det er ikke nødvendigt at holde 1 mus pr. bur for denne procedure. Antallet af mus placeret i hvert bur afhænger imidlertid den konkrete institution regler og forskrifter for brug af dyr. - Lige før slutningen af 2 h, forberede pilocarpin brugsopløsning (0.0563 mg/mL) ved fortynding af stamopløsningen 100 x i sterilt saltvand. Det er ikke nødvendigt at yderligere filter sterilisere denne løsning. Altid holde pilocarpin brugsopløsning på is.
Bemærk: Tabel 1 giver mængden af pilocarpin sprøjtes for en række mus kroppen vægte til at give en sidste dosis af 0.375 mg/kg kropsvægt.
2. procedure
- Vejer hver mus og bestemme dosis bedøvelsesmiddel mix for hver mus ved hjælp af tabel 1. Injicere den første mus med den passende mængde bedøvelsesmiddel mix af ruten intraperitoneal. Indstil timer i 2 min. (de fleste mus stammer testet i denne protokol gå til at sove ved 2 min). Sikre, at musen er korrekt bedøvede af manglende gå når det placeres på en flad overflade. Hvis musen stadig gå, skal du vente yderligere 2 min før du fortsætter til næste trin. Påfør en dråbe af smøremiddel oftalmologiske salve til begge øjne til at forhindre udtørring.
Bemærk: I tabel 1er dosis bedøvelsesmiddel mix 0.007 mL/g kropsvægt. Den optimale interval for denne procedure er 0,006 til 0,008 mL/g kropsvægt. Men efter 4 min, hvis musen stadig gå eller udstiller rykvise bevægelser, rådføre sig med den institutionelle dyrlæge for passende øge dosis af narkose. - Fastlægge dosis af pilocarpin for musen ved hjælp af tabel 1 og injicere den passende mængde af intraperitoneal rute. Angiv timer for 2 min og sæt musen i 50 mL Tilbageholderen røret indtil hoved og ører holde sig ud af den afskårne ende. Placer røret i en 45 graders vinkel, med hovedet ned, og den ventrale overflade opad. Tape rør til procedure bord til at holde det fra at flytte.
Bemærk: Tabel 1 giver dosering for mus i mere end 17 g, som denne procedure ikke har været forsøgt på mus vejer under 17 g. - Enden af 2 min forsigtigt indsætte et lukket par micro dissekere pincet ind i munden og løft den nederste kæbe opad for at åbne munden. Skubbe pincet 1-2 mm længere ind i munden, og sørg for, at tungen er set hviler på den øverste gren af pincet. Med et andet par af fine pincet, hold præ vejes tør svaber tæt på dens koniske tip.
- Blidt skub den koniske spids af podepinden ind i munden. Trække pincet mens spidsen af svaber i mundhulen.
- Forstå den brede ende af podepinden udvidelse uden for munden og rotere det til at tillade den maksimale areal af kontakt med munden. Holde svaber i denne position i 15 min.
Bemærk: Dette sikrer, at podepinden forbliver i munden for varigheden af samlingen. Bemærk, at den koniske spids af podepinden fungerer som en væge og den bredere del med svaber forbliver uden for munden. - For enden af 15 min forsigtigt rotere vatpind for at indsamle enhver spyt, der ikke er blevet absorberet og placere den våde svaber i 0,6 mL mikrofuge tube. Luk røret og sæt den i 2 mL tube anbringes på is.
Bemærk: På dette tidspunkt, vil mundslimhinden vises helt tørt. Musen kan nu flyttes tilbage i sit bur til nyttiggørelse fra anæstesi. - Overføre musen i buret. Sted fugtet mad pellets i buret efter spyt samling for at hurtigere rehydrering.
Bemærk: Mus vågne op inden for 10 min efter slutningen af samlingen. Subkutan injektion af 0,2 mL pre varmede isotonisk saltvand kan også gives til at fremskynde inddrivelsen. - Gå videre til den næste mus. Alle musene skal monitoreres, indtil de har fuldstændigt tilbagebetalt og er ambulant.
3. målinger
- For enden af alle samlinger veje 0,6 mL rør med den våde svaber. Beregn forskellen mellem våd vægt og tørvægt at få vægten af spyt fremstillet. Sted 0,6 mL tube med spyt tilbage ind i 2-mL-rør.
- Afbrød caps 2 ml rør. Derefter centrifugeres 2 mL rør i 2 min på 7500 x g, på 4oC i en mikro centrifuge at inddrive spyt. Måle volumen af spyt fremstillet ved hjælp af en mikropipette.
- Udtrykke resultaterne som spyt vægt (mg)10 over 15 min eller som et forhold af spyt vægt (mg) / mus kropsvægt (g).
Bemærk: Hvis mængden af spyt udvundet af podepinden er blevet målt, udtrykke resultaterne som mængden af spyt inddrevet (mL) eller forholdet mellem spyt volumen (mL) / mus kropsvægt (g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I modelsystemer eksperimentelle musen bruges evnen til at producere spyt som svar på pilocarpin stimulation som en indikator for spytkirtel-funktion. Spyt produktion blev målt i 11 uger gamle C57BL/6 hunmus af metoden vatpind. I figur 1A, er resultaterne udtrykt som mængden af spyt (mg) indsamlet efter stigende doser af pilocarpin. På dosis af 1 mg/kg legemsvægt begyndte nogle af mus, udstiller nød (ufrivillig rysten og skælven). Dermed blev højere doser af pilocarpin, ud over 1 mg/kg kropsvægt ikke testet i denne undersøgelse. I figur 1B, er resultaterne repræsenteret som forholdet mellem spyt vægt (mg) til musen kropsvægt (g). Kollektivt, viser disse data en god dosis svar forholdet mellem pilocarpin beløb og spyt produktion. Mængden af spyt inddrives fra svaber var også måles. Som vist i figur 1 c, er der et betydeligt sammenfald mellem spyt vægt og volumen hvor 1 mg af spyt er lig med 0,001 mL.
De opnåede resultater med metoden vatpind er magen til dem, der opnås med pipette samling metode. Figur 2A viser, at den gennemsnitlige mængde af spyt indsamlet af metoden svaber og metoden med pipette overfoeres er meget lignende og forskellene er statistisk signifikant. Figur 2B 2 C og 2D Vis metoden vatpind ikke påvirkede estimering af biomolekyler i spyt. Faktisk, i sammenligning med metoden med pipette overfoeres metoden vatpind viste en samlet set højere tendens i de gennemsnitlige samlede spyt protein (figur 2 c), spyt lysozym aktivitet (figur 2D) og spyt IgA (figur 2E). Dog var disse forskelle statistisk signifikante.
Spyt samling metode beskrevet her er i stand til at opdage forskelle i mængden af spyt fremstillet af forskellige mus stammer (figur 3) og spytkirtel hypofunction induceret af forskellige sygdomstilstande (figur 4). Figur 3A viser resultaterne af pilocarpin induceret spyt produktion fra 10-12-uge-forhenværende kvindelig C57BL/6, BALB/c, DBA1/J og 129S6 mus. 129S6 mus produceret det laveste beløb af spyt sammenlignet med de andre stammer. Det skal bemærkes, at forskellene i kroppen vægte af disse mus ikke var signifikant forskellige (figur 3B). Næste, svaber metode blev brugt til at registrere spytkirtel hypofunction, og to eksempler er vist i figur 4. Figur 4A viser et repræsentativt resultat af spytkirtel hypofunction induceret af aktivering af medfødt immunitet efter injektion af LPS (LPS) (10 µg/mus, intraperitoneal). Control mus blev sprøjtet med saltvand11. LPS-behandlede mus viser et betydeligt fald i spyt sammenlignet med kontrol. Passiv overførsel af antistoffer reaktivt med Sjögrens syndrom antigen A/Ro52 inducerer spytkirtel hypofunction, og denne model efterligner visse aspekter af Sjögrens syndrom9. Som vist i figur 4B, musene injiceret med adjuverende alun plus anti-Ro52 antistoffer havde sammen betydeligt lavere spyt produktion i forhold til ubehandlede mus eller mus behandlet med alun.
Vatpind metode er enkel at implementere og operatør uafhængige. Figur 5 viser spyt produktion fra 10-13-uge-forhenværende kvindelig C57BL/6 mus, i eksperimenter udført på 6 forskellige tidspunkter af 2 forskellige operatører. Operatøren jeg startede med kun 2 måneder for musen håndtering erfaring, mens operatøren II havde 6 måneders forudgående mus håndtering erfaring, men var kun indført til metoden spyt indsamling for en uge. Disse data blev genereret i forsøg udført næsten et år fra hinanden, ved hjælp af 0.375 mg/kg pilocarpin dosis. Spyt nøgletal opnået ved såvel operatører viser et udvalg af behandlinger (1,84 til 5,87). Operatøren jeg eksperimenter strakte sig over en periode på 10 uger mens operatør II eksperimenter blev udført over 3 på hinanden følgende dage næsten et år senere (figur 5A). Navnlig, spyt nøgletal opnået over tid var ikke signifikant forskellige (p = 0.064; Kruskal-Wallis test). For yderligere at sammenligne Inter operator variationer, nøgletal af spyt vægt pr. g kropsvægt fra 3 forsøg for hver importør blev samlet og er vist i figur 5B. Spyt nøgletal fremstillet af operatøren (mean + SEM; 4,45 + 0,152, n = 38) er ikke signifikant forskellig fra operatøren 2 (mean + SEM; 4,21 + 0.169; n = 25; p = 0.296 af Mann-Whitney test).
Figur 1: spyt produktion er afhængig af pilocarpin dosis. C57BL6/J mus (11 uger gamle hunner, 5 pr. gruppe) blev sprøjtet med forskellige doser af pilocarpin (0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg og 1,0 mg/kg kropsvægt) og spyt produktion blev målt i 15 min. (A) resultater er repræsenteret som mg spyt beløb (gennemsnit ± SEM). (B) dataene er repræsenteret som betyder spyt ratio (mg spyt pr. g mus kropsvægt). (C) spyt fra 11-uge-forhenværende kvindelig C57BL/6 mus (n = 5) blev indsamlet af metoden vatpind. Pilocarpin blev brugt i en dosis på 0.375 mg/kg kropsvægt. De våde podninger blev vejet for at måle mængden af spyt fremstillet i mg. Spyt i podninger blev derefter inddrives ved centrifugering, og mængderne af de gendannede spyt blev målt. Betydelig aftalen ses mellem spyt vægttab i mg og spyt volumen i µL. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: metoden vatpind påvirker ikke med analysen af biomolekyler i spyt. Spyt fra 2 grupper af 11-uge-forhenværende hunmus C57BL/6 (n = 5 mus pr. gruppe), blev indsamlet ved metoden vatpind eller ved metoden micropipet. Forskelle i gennemsnitlige mængder af spyt (A), gennemsnitlige mængder af protein (B), mener mængder af lysozym aktivitet (C), og betyde beløb af IgA mellem de 2 grupper er statistisk signifikant. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: metoden svaber af spyt collection registrerer forskelle i base line spyt produktion af forskellige stammer af mus. (A) spyt fra (10-12-uge-forhenværende) hunmus blev indsamlet i 15 min. ved hjælp af en pilocarpin dosis af 0.375 mg/kg kropsvægt. (B) de gennemsnitlige kroppen vægte mellem grupper af mus var ikke signifikant forskellig. Statistisk signifikans blev analyseret af Kruskal-Wallis test, efterfulgt af Dunn's flere sammenligninger test. En p < 0,05 blev betragtet som væsentlig. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: svaber metode registrerer spytkirtel hypofunction. (A) (B6 X A / J) F1 hunmus blev sprøjtet med enten LP'ER løsning (0,1 mg/mL, 0,1 mL pr. mus, intraperitoneal) eller saltvand, og spyt blev målt 26 h senere. En repræsentativ eksperiment viser en signifikant (p = 0.0079) dråbe (60%) i spyt produktion i mus behandlet med LP'ER. (B) spytkirtel hypofunction blev målt i en eksperimentel musen modelsystem for Sjögrens syndrom. Den tidligere udgivne passiv overførsel model for induktion af kirtel dysfunktion blev brugt4 med få ændringer. C57BL/6 hunmus (10-12 uger gamle) blev sprøjtet med alun adjuvans. På dage 14 og 20 mus blev sprøjtet med 0,05 mL af kanin anti-Ro52 serum og spyt produktion blev målt efter 24 h. bemærke en betydelig (p = 0,0003) drop (50%) i spyt produktion i mus behandlet med alun og anti-Ro52 serum. Statistisk signifikans blev analyseret af Kruskal-Wallis test, efterfulgt af Dunn's flere sammenligninger test. En p < 0,05 blev betragtet som væsentlig. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: metoden vatpind giver reproducerbare resultater over tid (A) og mellem erhvervsdrivende (B). Metoden vatpind viser sammenlignelige resultater mellem to erhvervsdrivende med forskellige længder af musen håndtering erfaring i forsøg udført i over et år. Baseline spyt produktion i C57BL/6 hunmus (10-13 uger gammel) blev målt ved hver operatør. Resultaterne udtrykkes som vægten af spyt fremstillet (mg/g kropsvægt). Datoer for spyt samling er på x-aksen og resultater fra data indsamlet over tid er vist (A). Hvert datapunkt repræsenterer en mus, og antallet af mus analyseret på hver gang er vist i parentes. Baseline spyt nøgletal (mean + SEM) samles fra 3 forsøg er vist (B), og er ikke signifikant forskellig mellem operatører. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spyt produktion er kompleks og påvirkes af mange faktorer. Måle spytkirtel-funktion i forsøgsdyr kan derfor være en udfordring. En ekstra udfordring er, at gentagne målinger af spytkirtel funktion i de samme dyr er forpligtet til at etablere udbrud af sygdom eller til at demonstrere opsving efter behandling.
Vatpind metode beskrevet i denne betænkning er teknisk simpelt at udføre med flere muligheder for at repræsentere dataene. De opnåede resultater er reproducerbare, med lille Inter operator variation. Metoden kan påvise en reduktion i spyt produktion i forskellige modeller af spytkirtel dysfunktion. En væsentlig fordel er brugen af inert, stærkt absorberende polymerer og effektiv inddrivelse af spyt indsamlet, tillader måling af spyt biomolekyler. En anden fordel ved denne metode er, at det er muligt at udføre denne procedure samtidig i op til 2 mus på et tidspunkt af en enkelt operatør. Dette er betydeligt mere effektiv end nogle af de andre metoder, hvor det er udført i et enkelt museklik ad gangen.
Variation i spyt produktionen målinger har været bane af alle spyt måleteknikker. For at minimere variation, er det vigtigt at holde sig strengt til protokollen. Kritiske trin omfatter: at vælge det samme tidspunkt på dagen for fastende mus og indsamling spyt, passende dosering af anæstesi og pilocarpin (tabel 1), og nøjagtig vægt poster af tørre og våde podninger. Omhyggelig tidsstyring er forpligtet til at indstille op til 2 mus på et tidspunkt for spyt samling.
Som vist i figur 3, er mængden af spyt fremstillet af mus stamme afhængige. Således passende stamme, alder og køn matchede mus bør bruges som kontrol. Titrering af pilocarpin-dosis for den specifikke stamme og eksperimenterende tilstand ved at blive undersøgt, er stærkt anbefales. Selvom en højere dosis af pilocarpin ud over 0,5 mg/kg inducerer øget produktion af spyt, at evaluere glandulær hypofunction, anbefales det at bruge en lavere dosis. Dette giver mulighed for identifikation af selv små forskelle i spyt produktionen mellem de syge og styrer mus. Doser af 0,5 mg/kg kropsvægt og 0.375 mg/kg kropsvægt har været anvendt med succes til at demonstrere spytkirtel hypofunction. Dog skal det bemærkes, at visse eksperimentel modelsystemer kan kræve kortere eller længere perioder for indsamling end som beskrevet i denne protokol. Dette bør testes hvert laboratorium.
En begrænsning af denne metode, og de fleste spyt målemetoder er behov for anæstesi. Rapporten med vakuum-metoden omfatter ikke brugen af bedøvelsesmiddel5. Men mangel af anæstesi inducerer varierende niveauer af angst i mus. De har tendens til at kæmpe og bide slangen, og som igen kan påvirke spyt produktion og samling effektivitet. Isofluran anæstesi i rotter inducerer en drop-in pilocarpin induceret spyt produktion12. Derimod øger ketamin bronchiale og spyt sekret gennem sympatisk stimulation13. Vi og andre har med held brugt ketamin og xylazin blanding som et bedøvelsesmiddel til måling af pilocarpin induceret spyt produktion4,7,8,9. Det anbefalede område for kirurgisk anæstesi er 100-200 mg/kg af ketamin og 5-16 mg/kg af xylazin14. Dosis af 0,006-0,008 mL/g kropsvægt anvendes i denne metode (svarer til 60-80 mg/kg af ketamin og 6-8 mg/kg af xylazin) forelsker sig i den nederste ende af det anbefalede interval og er tilstrækkelig til at give et ensartet immobilisering uden dyb anæstesi .
Metoden vatpind blev etableret som et alternativ til metoden rutinemæssigt anvendes micropipet. Den store ulempe ved metoden afpipetteres var den høje Inter operator variabilitet og behovet for at indsamle spyt fra en mus på et tidspunkt. Metoden vatpind løser begge disse problemer. Fordelene omfatter begrænsning af antallet af dyr, der er nødvendige for at opnå magt i statistiske analyser og øget effektivitet. Erstatter bomuld svaberprøver med inaktivt polymer svaberprøver tilbyde en bedre løsning da vatsvabere er kendt for at påvirke kvantitering af biologisk aktive molekyler15.
Givet enkelheden af metoden svaber og dens høj reproducerbarhed mellem forskellige individer, er det håbet, at metoden vatpind vil lette bedre sammenligninger af musemodeller mellem forskere i forskellige laboratorier og institutioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.
Acknowledgments
Undersøgelsen blev støttet af en bevilling fra National Institutes of Health, nationale Institut for Dental og Craniofacial forskning (DE025030).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
References
- Proctor, G. B.
- Fox, R. I. Sjögren's syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren's syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Cold Spring Harbor Protocols. Cold Spring Harb Protoc. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2006).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
