Summary
लार ग्रंथि hypofunction स्व-प्रतिरक्षित रोग और विकिरण चिकित्सा का एक लगातार परिणाम है । इन रोगों के माउस मॉडल में लार ग्रंथि समारोह के प्रतिलिपि मूल्यांकन एक तकनीकी चुनौती है । यहाँ चूहों में लार उत्पादन की सटीक और प्रतिलिपि माप के लिए एक सरल विधि बताई गई है ।
Abstract
Sjögren's सिंड्रोम के साथ रोगियों, रिसाव ग्रंथियों को प्रभावित करने वाली एक स्व-प्रतिरक्षित रोग, लार ग्रंथि सूजन का विकास और लार उत्पादन कम हो गया है । इसी तरह, लार उत्पादन गंभीर रूप से सिर और गर्दन के कैंसर के लिए विकिरण उपचार प्राप्त रोगियों में समझौता किया है । कुतर मॉडल, इन नैदानिक स्थितियों की नकल करने के लिए विकसित, रोग रोगजनन की एक समझ की सुविधा और नए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए अनुमति देते हैं । इसलिए, सही ढंग से करने की क्षमता, reproducibly, और पशु मॉडल में लार ग्रंथि समारोह के बार को मापने महत्वपूर्ण है. पहले साहित्य में वर्णित प्रक्रियाओं पर निर्माण, एक विधि विकसित की है कि इन मानदंडों को पूरा करता है और चूहों में लार ग्रंथि समारोह का मूल्यांकन किया गया था । इस नई विधि का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि यह आसानी से महारत हासिल है, और थोड़ा अंतर ऑपरेटर भिंनता है । लार ग्रंथि समारोह राशि (वजन या मात्रा) या pilocarpine उत्तेजना के जवाब में उत्पादित लार की दर (एमएल/मिन) के रूप में मूल्यांकन किया जाता है । एकत्र लार प्रोटीन सामग्री, immunoglobulin सांद्रता, और अंय अणुओं के विश्लेषण के लिए एक अच्छा स्रोत है ।
Introduction
लार ग्रंथियों स्नायविक और यांत्रिक उत्तेजनाओं की एक किस्म के जवाब में लार का उत्पादन1. उत्तेजना ग्रंथि में एड्रीनर्जिक और कोलीनर्जिक रिसेप्टर्स के लिए सहानुभूति और parasympathetic तंत्रिका तंत्र के माध्यम से किया जाता है । Pilocarpine एक कोलीनर्जिक, पैरा-sympathomimetic एजेंट है कि मस्करीनिक रिसेप्टर्स पर मुख्य रूप से कार्य करता है । लार ग्रंथि में, यह मस्करीनिक acetylcholine रिसेप्टर एम 31पर अभिनय से लार के उत्पादन लाती है । लार उत्पादन निंनलिखित pilocarpine प्रशासन लार ग्रंथियों की क्षमता का एक संकेतक को उत्तेजना का जवाब है और सामांयतः लार ग्रंथि समारोह का एक उपाय के रूप में प्रयोग किया जाता है ।
लार उत्पादन का सटीक माप Sjögren's सिंड्रोम2 और विकिरण चोट सिर और गर्दन के कैंसर के उपचार के बाद3सहित लार ग्रंथि रोगों के अध्ययन में महत्वपूर्ण है । कई विभिंन तरीकों को कुतर में लार उत्पादन को मापने के लिए विकसित किया गया है । इनमें निकालनेवाला लार वाहिनी के प्रत्यक्ष cannulation4, वैक्यूम5के तहत मौखिक गुहा से लार का संग्रह, और कांच केशिकाओं6 या एक micropipette7,8का उपयोग कर संग्रह शामिल हैं, 9. लार वाहिनी के प्रत्यक्ष cannulation सबसे सटीक और शुद्ध लार प्रदान करता है । हालांकि, यह एक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया है, और एक ही जानवर से प्रडक्टर चोट precludes दोहराव लार संग्रह के कारण के लिए क्षमता । वैक्यूम के तहत लार एकत्रित करने के लिए ट्यूब से लार के सूखने के कारण चर परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यह नुकसान आगे कम लार के साथ चूहों में अतिरंजित है । कांच केशिकाओं बाद विश्लेषण के लिए लार के संग्रह की अनुमति, तथापि, रोगग्रस्त राज्य में स्रावित लार की चिपचिपापन में परिवर्तन केशिकाओं के कुशल भरने को रोकता है । इसके अलावा, के लिए मौखिक गुहा झाडू को अवशिष्ट लार इकट्ठा प्रयास चोट के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । प्लास्टिक विधि पूरा संग्रह के लिए अनुमति देता है, और एक ही ऑपरेटर के लिए, यह उल्लेखनीय प्रयोगों के बीच संगत है । हालांकि, अज्ञात कारणों के लिए यह विधि विभिंन ऑपरेटर्स के बीच महत्वपूर्ण भिंनता दिखाता है । इसलिए, उचित तुलना की अनुमति देने के लिए, यह आवश्यक हो जाता है कि एक ही ऑपरेटर एक विशिष्ट परियोजना से संबंधित सभी प्रयोगों का प्रदर्शन करता है । जाहिर है, यह एक प्रयोगशाला के लिए एक प्रमुख नुकसान का प्रतिनिधित्व करता है ।
इन मुद्दों पर काबू पाने के लिए एक प्रक्रिया विकसित की गई जो मनुष्यों और कुतर के लिए प्रयुक्त लार संग्रह विधियों को संयोजित करती है । pilocarpine-प्रेरित लार की मात्रा को मापने के लिए नीचे वर्णित झाड़ू विधि, सरल, प्रतिलिपि, ऑपरेटर से प्रभावित नहीं है, और एक ही जानवर में एक बार किया जा सकता है । इसके अलावा, यह प्रोटीन, इम्युनोग्लोबुलिन, या अंय अणुओं के बाद के विश्लेषण के लिए लार इकट्ठा करने की अनुमति देता है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
नीचे वर्णित प्रोटोकॉल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और यह नैतिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा स्थापित दिशा निर्देशों के बाद । इस रिपोर्ट में प्रस्तुत सभी आंकड़ों में मादा चूहों का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था जो कि 10-12 सप्ताह की आयु के थे. चूहों के निम्नलिखित उपभेदों का उपयोग किया गया: C57BL/6, बालब/c, DBA1, 129S, and (B6XA/J) F1. सभी चूहों बाधा पिंजरों में स्थित थे (पिंजरे प्रति 5 पशुओं) विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त शर्तों में और फ़ीड और पानी विज्ञापन libitum प्रदान की है ।
1. तैयारी
- pilocarpine हाइडरोक्लॉराइड का एक शेयर समाधान तैयार करने के लिए, 10 यौगिक के मिलीग्राम वजन और इसे भंग करके बाँझ isotonic खारा के १.७७६ मिलीलीटर में घुल, ५.६३ मिलीग्राम/एमएल के एक शेयर समाधान देने के लिए । इस समाधान को निष्फल करने की आवश्यकता नहीं है । लेकिन अगर वांछित, यह एक ०.२ µ एम फिल्टर के माध्यम से फिल्टर । एक-८० oC फ्रीजर में 3 महीने तक के लिए इस स्टॉक समाधान को एकाधिक aliquots में संग्रहीत करें । प्रत्येक जमे हुए शेयर एकल उपयोग के लिए है । एक बार गल, pilocarpine समाधान reफ्रीज़ नहीं है ।
- ०.६ मिलीलीटर microfuge ट्यूबों ले लो और ध्यान से एक गर्म 18 गेज सुई के साथ एक ट्यूब के नीचे में एक छोटा सा छेद पंच । इन ट्यूबों को 2 मिलीलीटर ट्यूबों में सेट करें । ट्यूबों बाँझ नहीं की जरूरत है ।
- एक तेज, बाँझ उस्तरा ब्लेड का प्रयोग, टुकड़े में बेलनाकार शोषक झाड़ू के बारे में लंबाई में 2 सेमी काट । 2 शंकु आकार के झाड़ू देने के लिए तिरछे प्रत्येक 2 सेमी टुकड़ा काट । ०.६ मिलीलीटर microfuge ट्यूबों में से प्रत्येक में एक झाड़ू प्लेस ।
- ०.६ मिलीलीटर microfuge ट्यूब सूखी झाड़ू युक्त वजन ।
- चूहों का स्थानांतरण पानी की बोतलों के साथ एक नए स्वच्छ पिंजरे में अध्ययन किया जा करने के लिए । चूहों के लिए भोजन के बिना रखें से कम 2 ज लार संग्रह की शुरुआत करने के लिए पहले से खाद्य कणों को रोकने के लिए एकत्र लार दूषित करने से ।
नोट: यह इस प्रक्रिया के लिए पिंजरे प्रति 1 माउस रखने के लिए आवश्यक नहीं है । हालांकि, प्रत्येक पिंजरे में रखे चूहों की संख्या पशु उपयोग के लिए विशिष्ट संस्था के नियमों और विनियमों पर निर्भर करती है । - बस 2 एच के अंत से पहले, काम pilocarpine समाधान तैयार (०.०५६३ मिलीग्राम/एमएल) बाँझ खारा में स्टॉक समाधान 100x कमजोर द्वारा । यह आगे फिल्टर इस समाधान निष्फल करने के लिए आवश्यक नहीं है । हमेशा बर्फ पर वर्किंग pilocarpine सॉल्यूशन रखें ।
नोट: तालिका 1 pilocarpine की मात्रा के लिए माउस शरीर के वजन की एक सीमा के लिए इंजेक्शन की एक अंतिम खुराक देने के लिए देता है ०.३७५ मिलीग्राम/
2. सामा य
- प्रत्येक माउस तौलना और प्रत्येक माउस के लिए संवेदनाहारी मिश्रण की खुराक का निर्धारण तालिका 1का उपयोग कर । intraperitoneal मार्ग से संवेदनाहारी मिश्रण की उचित मात्रा के साथ पहले माउस इंजेक्षन । 2 मिनट के लिए टाइमर सेट (सबसे माउस इस प्रोटोकॉल में परीक्षण उपभेदों 2 मिनट से सो जाओ) । सुनिश्चित करें कि माउस ठीक से चलने की कमी से anesthetized है जब एक सपाट सतह पर रखा । यदि माउस अभी भी चल रहा है, अगले चरण पर आगे बढ़ने से पहले अतिरिक्त 2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें । दोनों आंखों को स्नेहक नेत्र मरहम की एक बूंद लागू करने के लिए सुखाने को रोकने ।
नोट: तालिका 1में, संवेदनाहारी मिश्रण की खुराक ०.००७ मिलीलीटर/जी शरीर के वजन है । इस कार्यविधि के लिए इष्टतम श्रेणी ०.००६ है ०.००८ मिलीलीटर/g शरीर के वजन के लिए । हालांकि, 4 मिनट के बाद, अगर माउस अभी भी चल रहा है या मरोड़ते आंदोलनों का प्रदर्शन, उचित संवेदनाहारी की खुराक में वृद्धि के लिए संस्थागत पशुचिकित्सा के साथ परामर्श करें । - माउस के लिए pilocarpine की खुराक का निर्धारण तालिका 1 और intraperitoneal मार्ग द्वारा उचित मात्रा में सुई । 2 मिनट के लिए टाइमर सेट और सिर और कान कट अंत से बाहर रहना जब तक ५० मिलीलीटर निरोधक ट्यूब में माउस डालें । एक ४५ डिग्री के कोण पर ट्यूब प्लेस, सिर के नीचे के साथ, और ventral सतह ऊपर की ओर का सामना करना पड़ । इसे चलती से रखने के लिए ट्यूब को प्रक्रिया पटल पर टेप करें ।
नोट: तालिका 1 17 g से अधिक चूहों के लिए खुराक प्रदान करता है, क्योंकि इस प्रक्रिया में 17 ग्राम से नीचे वजनी चूहों पर प्रयास नहीं किया गया है । - 2 मिनट के अंत में, धीरे मुंह में सूक्ष्म विदारक संदंश की एक बंद जोड़ी डालें और मुंह खोलने के लिए निचले जबड़े ऊपर उठा । संदंश 1-2 mm आगे मुंह में पुश, यकीन है कि जीभ संदंश के शीर्ष हाथ पर आराम कर देखा है बना । ठीक संदंश की एक और जोड़ी के साथ, पूर्व अपने शंकु टिप के पास सूखा झाड़ू पकड़ तौला ।
- धीरे मुंह में झाड़ू के शंकु टिप स्लाइड । मौखिक गुहा में झाड़ू की नोक छोड़ संदंश को वापस ले ।
- मुंह के बाहर फैली झाड़ू के व्यापक अंत को समझ और मुंह के साथ संपर्क के अधिकतम क्षेत्र की अनुमति के लिए इसे घुमाएगी । इस स्थिति में झाड़ू को 15 मिनट के लिए रखें ।
नोट: यह सुनिश्चित करता है कि झाड़ू संग्रह की अवधि के लिए मुंह में रहता है । ध्यान रखें कि झाड़ू की नोक एक बाती के रूप में कार्य करती है और झाड़ू का व्यापक भाग मुंह के बाहर रहता है । - 15 मिनट के अंत में, धीरे से किसी भी लार कि अवशोषित नहीं किया गया है इकट्ठा करने के लिए झाड़ू को घुमाएगी और ०.६ मिलीलीटर microfuge ट्यूब में गीला झाड़ू जगह है । ट्यूब बंद करें और बर्फ पर रखा 2 मिलीलीटर ट्यूब में यह सेट ।
नोट: इस समय, मौखिक म्यूकोसा पूरी तरह से शुष्क दिखाई देगा । माउस अब संज्ञाहरण से वसूली के लिए अपने पिंजरे में वापस ले जाया जा सकता है । - पिंजरे में माउस स्थानांतरण । जगह लार संग्रह के बाद पिंजरे में खाना छर्रों गीला तेजी से निर्जलीकरण में मदद करने के लिए ।
नोट: चूहों संग्रह के अंत के बाद 10 मिनट के भीतर जाग. ०.२ मिलीलीटर के चमड़े के नीचे इंजेक्शन पूर्व गर्म isotonic खारा भी वसूली में तेजी लाने के लिए दिया जा सकता है । - अगले माउस के लिए आगे बढ़ें । जब तक पूरी तरह से वसूली न हो और एम्बूलेंस हो तब तक सभी चूहों पर नजर रखनी चाहिए ।
3. माप
- सभी संग्रह के अंत में, गीला झाड़ू के साथ ०.६ मिलीलीटर ट्यूबों तौलना । गीला वजन और शुष्क वजन के बीच अंतर की गणना करने के लिए लार का उत्पादन वजन मिलता है । लार के साथ ०.६ मिलीलीटर ट्यूब को वापस 2-एमएल ट्यूब में रखें ।
- 2 मिलीलीटर ट्यूबों की टोपियां काट । फिर, 2 मिलीलीटर ट्यूबों 2 मिनट के लिए ७५०० x g में, 4oC पर एक सूक्ष्म केंद्रापसारक में लार ठीक करने के लिए । एक micropipette का उपयोग कर प्राप्त लार की मात्रा को मापने ।
- (मिलीग्राम) लार वजन के रूप में परिणाम व्यक्त 15 मिनट से अधिक10 या लार वजन (एमजी)/mouse शरीर के वजन (जी) के अनुपात के रूप में ।
नोट: यदि झाड़ू से बाहर निकाली गई लार की मात्रा मापा गया है, लार की मात्रा (एमएल) या लार मात्रा (एमएल)/mouse शरीर के वजन (जी) के अनुपात के रूप में परिणाम व्यक्त करते हैं ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
प्रयोगात्मक माउस मॉडल सिस्टम में, pilocarpine उत्तेजना के जवाब में लार का उत्पादन करने की क्षमता लार ग्रंथि समारोह का एक संकेतक के रूप में प्रयोग किया जाता है । लार उत्पादन 11 में मापा गया था सप्ताह पुराने C57BL/झाड़ू विधि द्वारा 6 महिला चूहों । चित्रा 1aमें, परिणाम pilocarpine की खुराक में वृद्धि के बाद एकत्र लार (एमजी) की राशि के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । 1 मिलीग्राम/किलो शरीर के वजन की खुराक में, चूहों में से कुछ (अनैच्छिक मिलाते हुए और कांप) संकट का प्रदर्शन शुरू कर दिया । इसलिए pilocarpine की अधिक खुराक, परे 1 मिलीग्राम/इस अध्ययन में शरीर के वजन का परीक्षण नहीं किया गया । चित्रा 1bमें, परिणाम (जी) माउस शरीर के वजन के लिए लार वजन (एमजी) के अनुपात के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों pilocarpine राशि और लार उत्पादन के बीच एक अच्छी खुराक प्रतिक्रिया संबंध दिखाते हैं । झाड़ू से बरामद लार की मात्रा भी मापी गई । के रूप में चित्रा 1Cमें दिखाया गया है, वहां लार वजन और मात्रा के बीच एक महत्वपूर्ण सामंजस्य जहां 1 लार के मिलीग्राम ०.००१ मिलीलीटर के बराबर होती है ।
झाड़ू विधि से प्राप्त परिणाम पिपेट संग्रह विधि के साथ प्राप्त करने वालों के समान हैं । चित्र 2a से पता चलता है कि झाड़ू विधि और प्लास्टिक विधि द्वारा एकत्र लार की अर्थ राशि बहुत समान है और मतभेदों को सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं हैं । चित्र b , 2c और 2d पता चलता है कि झाड़ू विधि लार में अणुओं के अनुमान को प्रभावित नहीं किया । वास्तव में, प्लास्टिक विधि के साथ तुलना में, झाड़ू विधि कुल लार प्रोटीन (चित्रा 2c), लार lysozyme गतिविधि (चित्रा 2d) और लार IgA (चित्रा 2E) के माध्य स्तर में एक समग्र उच्च प्रवृत्ति दिखाया । हालांकि, इन मतभेदों को सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं थे ।
लार संग्रह विधि यहाँ वर्णित विभिन्न माउस उपभेदों द्वारा उत्पादित लार की मात्रा में अंतर का पता लगाने में सक्षम है (चित्रा 3) और लार ग्रंथि hypofunction विभिन्न रोग की स्थिति (चित्रा 4) द्वारा प्रेरित. चित्रा 3 ए pilocarpine प्रेरित लार उत्पादन के परिणाम से पता चलता है 10-12 सप्ताह पुरानी महिला C57BL/6, बालब/सी, DBA1/जे और 129S6 चूहों । 129S6 चूहों अंय उपभेदों की तुलना में लार की सबसे कम राशि का उत्पादन किया । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इन चूहों के शरीर के भार में अंतर काफी अलग नहीं थे (चित्र बी). अगला, झाड़ू विधि लार ग्रंथि hypofunction का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और दो उदाहरण चित्रा 4में दिखाया गया है । चित्रा 4a lipopolysaccharide (एलपीएस) (10 µ जी/माउस, intraperitoneally) की जन्मजात उन्मुक्ति निम्नलिखित इंजेक्शन के सक्रियकरण द्वारा प्रेरित लार ग्रंथि hypofunction के एक प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है. नियंत्रण चूहों11खारा के साथ इंजेक्शन थे । एलपीएस-इलाज चूहों नियंत्रण की तुलना में लार में एक महत्वपूर्ण गिरावट दिखा । Sjögren's सिंड्रोम प्रतिजन एक के साथ प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी के निष्क्रिय हस्तांतरण Ro52 लाती है लार ग्रंथि hypofunction, और इस मॉडल Sjögren's सिंड्रोम के कुछ पहलुओं की नकल9। के रूप में चित्रा 4Bमें दिखाया गया है, चूहों सहायक फिटकिरी प्लस विरोधी Ro52 एंटीबॉडी के साथ इंजेक्शन के साथ इलाज चूहों या चूहों फिटकिरी के साथ ही इलाज की तुलना में काफी कम लार उत्पादन किया था ।
झाड़ू विधि को लागू करने और स्वतंत्र ऑपरेटर सरल है । चित्रा 5 से पता चलता है लार उत्पादन में 10-13 सप्ताह पुरानी महिला C57BL/6 चूहों, प्रयोगों में 2 अलग ऑपरेटरों द्वारा 6 अलग समय अंक पर प्रदर्शन किया. ऑपरेटर मैं माउस हैंडलिंग अनुभव के केवल 2 महीने के साथ शुरू किया, जबकि ऑपरेटर द्वितीय पहले माउस से निपटने के अनुभव के 6 महीने था, लेकिन केवल एक सप्ताह के लिए लार संग्रह विधि के लिए शुरू की गई थी । इन आंकड़ों के अलावा लगभग एक वर्ष किए गए प्रयोगों में उत्पंन किया गया, ०.३७५ मिलीग्राम/kg pilocarpine खुराक का उपयोग कर । दोनों ऑपरेटरों द्वारा प्राप्त लार अनुपात रीडिंग की एक श्रृंखला दिखा (१.८४ से ५.८७) । ऑपरेटर है मैं प्रयोगों 10 सप्ताह की अवधि में फैले जबकि ऑपरेटर द्वितीय प्रयोगों 3 लगातार दिनों में लगभग एक साल बाद (चित्र 5 ए) पर किए गए । विशेष रूप से, लार अनुपात समय पर प्राप्त काफी अलग नहीं थे (पी = 0.064; Kruskal-वालिस test). आगे अंतर ऑपरेटर रूपों की तुलना करने के लिए, प्रत्येक ऑपरेटर के लिए 3 प्रयोगों से जी शरीर के वजन प्रति लार वजन के अनुपात परित थे और चित्रा 5Bमें दिखाया गया है । लार संचालक द्वारा प्राप्त अनुपात (मतलब + sem; ४.४५ + ०.१५२, n = 38) ऑपरेटर 2 से काफी अलग नहीं हैं (meaning + sem; ४.२१ + ०.१६९; n = 25; p = 0.296 द्वारा मान Whitney test).
चित्र 1: लार उत्पादन pilocarpine खुराक पर निर्भर है । C57BL6/जे चूहों (11 सप्ताह पुरानी महिलाओं, 5 प्रति समूह) pilocarpine के विभिंन खुराकों के साथ इंजेक्शन थे (०.२५ मिलीग्राम/किलोग्राम, ०.५ मिलीग्राम/और १.० मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) और लार उत्पादन 15 मिनट के लिए मापा गया था । (A) परिणाम मिलीग्राम लार राशि के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं) (मतलब ± SEM) । (ख) डेटा मतलब लार अनुपात के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं (जी माउस प्रति मिलीग्राम लार शरीर के वजन). (ग) 11 सप्ताहीय मादा C57BL से लार/6 चूहों (एन = 5) झाड़ू विधि द्वारा एकत्र किया गया था । Pilocarpine ०.३७५ मिलीग्राम/kg शरीर के वजन की एक खुराक में इस्तेमाल किया गया था । गीला झाड़ू मिलीग्राम में उत्पादित लार की मात्रा को मापने के लिए तौला गया । झाड़ूों में लार तो केंद्रापसारक द्वारा बरामद किया गया था, और बरामद लार की मात्रा मापा गया । महत्वपूर्ण समझौते µ एल में मिलीग्राम और लार मात्रा में लार वजन के बीच देखा जाता है इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: झाड़ू विधि से लार में होने वाले अणुओं के विश्लेषण पर प्रभाव नहीं पड़ता । 11 के 2 समूहों से लार सप्ताह पुरानी महिला C57BL/6 चूहों, (n = प्रति समूह 5 चूहों), या तो झाड़ू विधि द्वारा या micropipet विधि द्वारा एकत्र किया गया था । लार का मतलब मात्रा में अंतर (क), प्रोटीन की मात्रा का मतलब (ख), lysozyme गतिविधि की मात्रा मतलब (ग), और 2 समूहों के बीच IgA की मात्रा मतलब सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: लार संग्रह की झाड़ू विधि चूहों के विभिन्न उपभेदों द्वारा बेस लाइन लार उत्पादन में मतभेद का पता लगाता है. (एक) महिला से लार (10-12 सप्ताह पुराने) चूहों 15 मिनट के लिए ०.३७५ मिलीग्राम/kg शरीर के वजन की एक pilocarpine खुराक का उपयोग करके एकत्र किए गए थे । (ख) चूहों के समूहों के बीच निकृष्ट शरीर का भार काफी अलग नहीं था. सांख्यिकीय महत्व Kruskal-वालिस परीक्षण, डन के कई तुलना परीक्षण के बाद द्वारा विश्लेषण किया गया था । A p < 0.05 महत्वपूर्ण माना गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: झाड़ू विधि लार ग्रंथि hypofunction का पता लगाता है. (a) (B6 X A/F1 मादा चूहों या तो एलपीएस समाधान (०.१ मिलीग्राम/एमएल, ०.१ एमएल प्रति माउस, intraperitoneally) या खारा के साथ इंजेक्शन थे, और लार 26 ज बाद में मापा गया था । एक प्रतिनिधि प्रयोग एक महत्वपूर्ण (पी = 0.0079) ड्रॉप (६०%) एलपीएस के साथ इलाज चूहों में लार उत्पादन में दिखाता है । (ख) लार ग्रंथि hypofunction Sjögren's सिंड्रोम के लिए एक प्रयोगात्मक माउस मॉडल प्रणाली में मापा गया था । ग्रंथियों शिथिलता के प्रेरण के लिए पहले से प्रकाशित निष्क्रिय हस्तांतरण मॉडल कुछ संशोधनों के साथ4 इस्तेमाल किया गया था । मादा C57BL/6 चूहों (10-12 सप्ताह पुराने) फिटकिरी सहायक के साथ इंजेक्ट किया गया. दिन में 14 और 20 चूहों खरगोश विरोधी Ro52 सीरम और लार उत्पादन के ०.०५ मिलीलीटर के साथ इंजेक्शन थे 24 घंटे के बाद मापा गया था एक महत्वपूर्ण (पी = 0.0003) ड्रॉप (५०%) फिटकिरी और एंटी-Ro52 सीरम के साथ इलाज चूहों में लार उत्पादन में. सांख्यिकीय महत्व Kruskal-वालिस परीक्षण, डन के कई तुलना परीक्षण के बाद द्वारा विश्लेषण किया गया था । A p < 0.05 महत्वपूर्ण माना गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5: झाड़ू विधि पैदावार प्रतिलिपि परिणाम पर समय (A) और ऑपरेटरों के बीच (B). झाड़ू विधि दो ऑपरेटरों के बीच तुलनीय परिणामों से पता चलता है एक वर्ष से अधिक किए गए प्रयोगों में माउस हैंडलिंग अनुभव की लंबाई के साथ । C57BL/6 मादा चूहों में आधारभूत लार उत्पादन (10-13 सप्ताह की आयु) प्रत्येक ऑपरेटर द्वारा मापा गया था । परिणाम लार का उत्पादन वजन के रूप में व्यक्त कर रहे है (मिलीग्राम/ लार संग्रह की तिथियाँ X-अक्ष पर हैं और समय के साथ एकत्र किए गए डेटा से परिणाम (A) दिखाए जाते हैं. प्रत्येक डेटा बिंदु एक माउस का प्रतिनिधित्व करता है, और प्रत्येक समय पर विश्लेषण चूहों की संख्या कोष्ठक में दिखाया गया है. आधारभूत लार अनुपात (मतलब + SEM) 3 प्रयोगों से परित दिखाया गया है (B), और ऑपरेटरों के बीच काफी अलग नहीं हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
लार उत्पादन एक जटिल प्रक्रिया है और कई कारकों से प्रभावित है । इसलिए, प्रयोगशाला पशुओं में लार ग्रंथि समारोह को मापने एक चुनौती हो सकती है । एक अतिरिक्त चुनौती है कि एक ही जानवर में लार ग्रंथि समारोह के दोहराया माप रोग की शुरुआत स्थापित करने के लिए या उपचार के बाद वसूली को प्रदर्शित करने के लिए आवश्यक हैं ।
इस रिपोर्ट में वर्णित झाड़ू विधि डेटा का प्रतिनिधित्व करने के लिए एकाधिक विकल्पों के साथ कार्य करने के लिए तकनीकी रूप से सरल है । प्राप्त परिणाम प्रतिलिपि, थोड़ा अंतर ऑपरेटर भिंनता के साथ कर रहे हैं । विधि लार ग्रंथि रोग के विभिन्न मॉडलों में लार उत्पादन में कमी का पता लगा सकते हैं । एक महत्वपूर्ण लाभ निष्क्रिय, अत्यधिक शोषक पॉलिमर और एकत्र लार के कुशल वसूली, लार के अणुओं की माप की अनुमति का उपयोग है । इस विधि का एक और लाभ यह है कि यह प्रक्रिया एक साथ एक समय में 2 चूहों अप करने के लिए एक ही ऑपरेटर द्वारा बाहर ले जाने के लिए संभव है । यह काफी अंय विधियों, जहां यह एक समय में एक ही माउस में किया जाता है की तुलना में अधिक कुशल है ।
लार उत्पादन माप में परिवर्तनशीलता सभी लार माप तकनीक के बने किया गया है । परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, यह प्रोटोकॉल के लिए कड़ाई से पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है । महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं: चूहों उपवास और लार का संग्रह, संवेदनाहारी और pilocarpine (तालिका 1), और सूखी और गीले झाड़ू के सटीक वजन रिकॉर्ड के उचित खुराक के लिए दिन के एक ही समय का चयन । सावधानी समय प्रबंधन लार संग्रह के लिए एक समय में 2 चूहों को स्थापित करने के लिए आवश्यक है ।
के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है, चूहों द्वारा उत्पादित लार की मात्रा तनाव निर्भर है । इस प्रकार, उपयुक्त तनाव, उंर, और सेक्स मिलान चूहों नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए । अनुमापन pilocarpine खुराक के लिए, विशिष्ट तनाव और प्रयोगात्मक हालत की जांच की जा रही के लिए, अत्यधिक की सिफारिश की है । हालांकि ०.५ मिलीग्राम/kg से परे pilocarpine की एक उच्च खुराक लार के उत्पादन में वृद्धि लाती है, ग्रंथियों hypofunction का मूल्यांकन करने के लिए, यह एक कम खुराक का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. यह रोगग्रस्त और नियंत्रण चूहों के बीच लार उत्पादन में भी मामूली अंतर की पहचान के लिए अनुमति देता है । ०.५ मिलीग्राम/किलो शरीर के वजन और ०.३७५ मिलीग्राम/किलो शरीर के वजन लार ग्रंथि hypofunction को प्रदर्शित करने के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कुछ प्रयोगात्मक मॉडल सिस्टम संग्रह की तुलना में इस प्रोटोकॉल में वर्णित की छोटी या लंबी अवधि की आवश्यकता हो सकती है । यह प्रत्येक प्रयोगशाला द्वारा परीक्षण किया जाना चाहिए ।
इस विधि की एक सीमा है, और सबसे लार मापने के तरीकों संज्ञाहरण के लिए की जरूरत है । वैक्यूम विधि के साथ रिपोर्ट संवेदनाहारी5का उपयोग शामिल नहीं है । हालांकि, संज्ञाहरण के अभाव चूहों में चिंता का स्तर अलग लाती है । वे संघर्ष और टयूबिंग काटने के लिए करते हैं, और है कि बारी में, लार उत्पादन और संग्रह दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं । चूहों में Isoflurane संज्ञाहरण एक बूंद pilocarpine प्रेरित लार उत्पादन में12लाती है । इसके विपरीत, ketamine सहानुभूति उत्तेजना13के माध्यम से दमा और लार स्राव बढ़ जाती है । हम और दूसरों को सफलतापूर्वक pilocarpine प्रेरित लार उत्पादन4,7,8,9को मापने के लिए एक संवेदनाहारी के रूप में ketamine और xylazine मिश्रण का इस्तेमाल किया है । सर्जिकल संज्ञाहरण के लिए सिफारिश की सीमा है 100-200 मिलीग्राम/ketamine और 5-16 मिलीग्राम/xylazine के14किग्रा । इस विधि में प्रयुक्त 0.006-0.008 एमएल/जी शरीर के वजन की खुराक (से मेल खाती है 60-80 मिलीग्राम/किग्रा की ketamine और 6-8 मिलीग्राम/) की सिफारिश की सीमा के निचले छोर में गिर जाता है और गहरी संज्ञाहरण के बिना स्थिरीकरण के एक सुसंगत स्तर प्रदान करने के लिए पर्याप्त है .
झाड़ू विधि नियमित रूप से इस्तेमाल micropipet विधि के लिए एक विकल्प के रूप में स्थापित किया गया था । प्लास्टिक विधि के प्रमुख नुकसान उच्च अंतर ऑपरेटर परिवर्तनशीलता और एक समय में एक चूहे से लार इकट्ठा करने की जरूरत थी । झाड़ू विधि इन दोनों समस्याओं को हल करता है । लाभ के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण और वृद्धि की क्षमता में शक्ति प्राप्त करने की जरूरत पशुओं की संख्या सीमित शामिल हैं । निष्क्रिय बहुलक झाड़ू के साथ कपास झाड़ू की जगह एक बेहतर विकल्प की पेशकश के बाद से कपास झाड़ू को जैविक रूप से सक्रिय अणुओं के quantitation प्रभाव के लिए जाना जाता है15।
झाड़ू विधि और विभिंन व्यक्तियों के बीच अपनी उच्च reproducibility की सादगी को देखते हुए यह आशा व्यक्त की है कि झाड़ू विधि अलग प्रयोगशालाओं और संस्थानों में शोधकर्ताओं के बीच माउस मॉडलों की बेहतर तुलना की सुविधा होगी ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.
Acknowledgments
इस अध्ययन में राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड Craniofacial रिसर्च (DE025030) से अनुदान का समर्थन किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
References
- Proctor, G. B.
- Fox, R. I. Sjögren's syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren's syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Cold Spring Harbor Protocols. Cold Spring Harb Protoc. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2006).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
