Summary
침 샘 hypofunction는 자가 면역 질환과 방사선 치료의 빈번한 결과 이다. 이러한 질병 마우스 모델에서 침 샘 기능의 재현 평가 기술 도전 이다. 여기, 쥐에 타 액 생산의 정확 하 고 재현 가능한 측정을 위한 간단한 방법을 설명 합니다.
Abstract
Sjögren의 증후군, 전 분 비에 영향을 미치는 면역 질환 환자는 침 샘 염증을 개발 하 고 타 액 생산을 감소 했습니다. 마찬가지로 타 액 생산 머리와 목 암에 대 한 방사선 치료를 받은 환자에서 심각 하 게 손상 됩니다. 설치류 모델, 이러한 임상 조건 모방 개발 질병 pathogenesis의 이해를 촉진 하 고 새로운 치료 전략의 개발에 대 한 허용. 따라서, 정확 하 게, reproducibly, 그리고 반복적으로 동물 모델에서 침 샘 기능을 측정 하는 능력은 중요 합니다. 문학에서 설명한 이전 절차에 건물, 메서드는 이러한 기준을 충족 하 고 쥐에 있는 침 샘 기능을 평가 하는 데 사용 했다 개발 되었다. 이 새로운 방법의 추가적인 이점은 그것 쉽게 마스터 하 고는 작은 간 연산자 변화입니다. 침 샘 기능 (무게 또는 양) 또는 pilocarpine 자극에 대 한 응답에서 생산 하는 타 액의 속도 (mL/min)로 평가 됩니다. 수집 된 타 액 단백질 콘텐츠, 면역 글로불린 농도, 및 다른 생체 분석에 대 한 좋은 소스입니다.
Introduction
침 샘 침 다양 한 신경 및 기계적 자극1에 대 한 응답을 생성합니다. 자극에 선 아드레날린 및 해 수용 체 교감 및 부 교감 신경 신경 시스템을 통해 수행 됩니다. Pilocarpine muscarinic 수용 체에 우위 하 게 작동 해, 파라 sympathomimetic 에이전트입니다. 침 샘에 그것은1M3 muscarinic 아 세 틸 콜린 수용 체에 행동에 의해 타 액의 생산을 유도합니다. Pilocarpine 관리에 따라 타 액 생산 자극에 응답 하는 침 샘의 능력의 지표 이며 침 샘 기능의 측정으로 상용 된다.
타 액 생산의 정확한 측정은 Sjögren의 증후군2 등 방사선 상해 다음 머리와 목 암 치료3침 샘 질환의 연구에 중요 합니다. 여러 가지 다른 방법은 설치류에 타 액 생산을 측정 하기 위해 개발 되었습니다. 4배설 침 덕트, 진공5, 아래 구강에서 타 액의 수집 그리고 유리 모 세관6 또는 micropipette7,8, 를 사용 하 여 컬렉션의 직접적인 cannulation 포함 됩니다. 9. 직접 cannulation 침 덕트의 가장 정확 하 고 순수한 타 액을 제공 합니다. 그러나, 이것은 기술적으로 도전적인 절차, 그리고 ductal 상해를 일으키는 원인이 되기를 위한 잠재력 같은 동물에서 반복적인 침 컬렉션 걸로 하겠습니다. 진공에서 타 액을 수집 튜브에서 타 액의 건조 변수 결과 발생할 수 있습니다. 이 감소는 감소 된 타 액 분 비와 쥐에 더 과장 된다. 그러나 유리 모 세관 후속 분석을 위해 타 액의 컬렉션, 병에 걸린 상태에서 분 비 하는 타 액의 점도 변화는 모 세관의 효율적인 충전을 방지 하는. 또한, 잔여 타 액을 수집 구강 청소 하려고 부상으로 이어질 수 있습니다. 피펫으로 메서드는, 완전 한 컬렉션에 대 한 수 있습니다 하 고 같은 연산자에 대 한 그것은 눈에 띄게 실험 사이. 그러나, 알 수 없는 이유로이 방법은 다른 연산자 사이의 중요 한 변화를 보여줍니다. 따라서, 적절 한 비교를 허용 하려면 동일한 연산자는 특정 프로젝트와 관련 된 모든 실험을 수행 필수적 된다. 명확 하 게,이 실험실을 위한 중요 한 불리를 나타냅니다.
이러한 문제를 해결 하려면 프로시저 결합 타 액 수집 방법 인간과 설치류에 대 한 사용 개발 되었다. Pilocarpine 유도 침 볼륨 측정에 대 한 아래 설명 하는 면봉 방법을 간단 하 고, 재현성, 연산자에 의해 영향을 받지 이며 같은 동물에 반복적으로 수행할 수 있습니다. 또한, 단백질, 면역 글로불린, 또는 다른 생체의 후속 분석을 위해 타 액을 수집 하는 수 있습니다.
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Protocol
아래에 설명 된 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다 그리고 그것은 건강의 국가 학회에 의해 설립 하는 윤리적인 지침을 따릅니다. 이 보고서에 제공 된 모든 데이터는 10-12 주 나이의 여성 쥐를 사용 하 여 생성 되었습니다. 쥐의 다음 긴장 사용 했다: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S, 및 (B6XA/J) F1. 모든 마우스 장에 장벽 (5 동물 케이지 당) 특정 병원 체 자유로운 조건에서 지 내게 되었고 먹이 물 ad libitum 제공.
1입니다. 준비
- Pilocarpine 염의 재고 솔루션을 준비, 화합물의 10 밀리 그램의 무게 그리고 vortexing, 5.63 mg/mL의 재고 솔루션을 제공 하 여 살 균 isotonic 식 염 수의 1.776 mL에 녹이 지. 이 솔루션을 소독 아무 필요도 없다. 하지만 원하는 경우 0.2 µ M 필터를 통해 필터링. 최대 3 개월까지-80 oC 냉장고에 여러 aliquots에서이 재고 솔루션을 저장 합니다. 각 냉동된 주식은 단일 사용 됩니다. 일단 해 동, pilocarpine 솔루션을 refreeze 하지 마십시오.
- 0.6 mL microfuge 관을 신중 하 게 온수 18 게이지 바늘으로 각 튜브의 하단에 작은 구멍을 펀치. 이러한 튜브 2 mL 튜브로 설정 합니다. 튜브 살 균 될 필요가 없습니다.
- 샤 프, 메 마른 면도칼 블레이드를 사용 하 여 조각 길이 약 2 ㎝ 원통형 흡수 성 면봉 잘라. 2 원뿔 모양의 면봉에 게 대각선 각 2 cm 조각 잘라. 각 0.6 mL microfuge 관 한 면봉을 배치 합니다.
- 무게 0.6 mL microfuge 관 마른 면봉을 포함 하는.
- 전송으로 새로운 깨끗 한 물 병 공부 하 쥐. 수집 타 액 오염에서 음식 입자를 방지 하기 위해 타 액 컬렉션의 시작 이전에 적어도 2 시간에 대 한 음식 없이 마우스를 유지.
참고: 그것은이 절차에 대 한 감 금 소 당 1 마우스를 유지 하는 데 필요한 아니다. 그러나, 각 장에 배치 하는 쥐의 수는 특정 기관의 규칙 및 동물 사용에 대 한 규정에 따라 다릅니다. - 2 h의 끝의 바로 전에 멸 균 식 염 수에 재고 솔루션 100 배 희석 하 여 작업 pilocarpine 솔루션 (0.0563 mg/mL)을 준비 합니다. 추가 필터를 필요는 없습니다이 솔루션을 소독. 항상 작업 pilocarpine 솔루션 얼음에 보관 합니다.
주: 표 1 pilocarpine 마우스 몸 무게 줄 마지막 복용량 0.375 mg/kg의 체중의 범위에 대 한 주입을 금액을 제공 합니다.
2입니다. 절차
- 각 마우스 무게 고 각 마우스를 사용 하 여 표 1에 대 한 마 취 혼합의 복용량을 결정 합니다. 복 경로 의해 마 취 혼합의 적절 한 볼륨으로 최초의 마우스를 주사. (대부분 마우스 긴장이이 프로토콜에서 테스트로 이동 자 2 분) 2 분 타이머를 설정 합니다. 마우스가 제대로 걷는 때 평평한 표면에 배치의 부족에 의해 마 취를 확인 합니다. 마우스는 여전히 걷고, 다음 단계로 진행 하기 전에 추가 2 분 동안 기다립니다. 건조를 방지 하기 위해 두 눈을 윤 활 유 안과 연 고의 한 방울을 적용 합니다.
참고: 테이블 1의 마 취 혼합의 복용량은 0.007 mL/g 몸 무게. 이 절차에 대 한 최적의 범위 0.006 0.008 mL/g 몸 무게는. 그러나, 4 분, 마우스는 여전히 산책을 하거나 육 포의 움직임을 전시 하는 경우 적절 하 게 증가 하는 마 취의 복용량에 대 한 제도적 수 의사와 상담 후. - 표 1 을 사용 하 여 마우스에 대 한 pilocarpine의 복용량을 결정 하 고 복 경로 의해 적절 한 금액을 투입. 2 분 타이머를 설정 하 고 머리와 귀 스틱 컷된 쪽으로 때까지 50 mL restrainer 튜브에 마우스를 삽입 합니다. 장소, 머리는 45도 각도로 튜브 및 위 복 부 표면. 이동에서 계속 절차 보드 튜브 테이프.
주: 표 1 제공 합니다 복용량을 17 g 보다는 마우스에 대 한이 절차가 쥐 17 g 아래의 무게에 시도 하지 않은. - 2 분의 끝에, 부드럽게 입으로 집게를 해 부 마이크로의 닫힌된 쌍을 삽입 하 고 입 열을 위쪽으로 아래 턱을 들어. 입, 혀는 집게의 최고 팔에 볼 다는 것을 확인에 집게를 1-2 m m 더를 밀어. 또 한 쌍의 좋은 집게, 원뿔 끝 가까이 미리 무게 마른 면봉 붙.
- 부드럽게 입으로는 면봉의 원뿔 끝을 밀어. 구강에는 면봉의 끝 동안에 집게를 철회 한다.
- 입 밖으로 확장 하는 면봉의 넓은 끝을 잡고 그것을 회전 입과의 접촉의 최대 영역을 허용 하도록. 15 분 동안이 자리에는 면봉을 유지.
참고: 이렇게 하면 면봉 컬렉션 동안 입안에 남아 있습니다. 면봉의 원뿔 끝 역할 심지와 면봉의 넓은 부분을 참고 입 밖으로 남아 있습니다. - 15 분의 끝에, 부드럽게 흡수 되지 어떤 타 액을 수집에 면봉을 회전 하 고 0.6 mL microfuge 관에서 젖은 면봉을 배치. 튜브를 닫고 얼음에 2 mL 튜브에 그것을 설정 합니다.
참고:이 시점에서 구강 점 막이 나타납니다 완전히 건조. 마우스 이제 이동할 수 있습니다 다시 그것의 감 금으로 마 취에서 회복을 위한. - 장에 마우스를 전송 합니다. 빠른 재 수 있도록 타 액 수집 후 장에 moistened 음식 펠 릿을 놓습니다.
참고: 쥐를 컬렉션의 끝 후 10 분 이내를 시작. 0.2 mL 미리 따뜻하게 isotonic 식 염 수의 피하 주사도 회복을 가속 화 하기 위해 주어진 수 있습니다. - 다음 마우스를 이동 합니다. 모든 그들은 완전히 복구 될 때까지 모니터링 해야 하는 쥐와는 보 행.
3입니다. 측정
- 모든 컬렉션의 끝에, 젖은 면봉 0.6 mL 튜브 무게. 젖은 무게와 타 액 생산의 무게를 건조 무게의 차이 계산 합니다. 2 mL 튜브에 다시 타 액 0.6 mL 튜브를 놓습니다.
- 2 ml 튜브의 뚜껑을 잘라. 그런 다음 복구는 타 액을 마이크로 원심 분리기에 4oC에서 7500 x g에서 2 분 동안 2 mL 튜브 원심. micropipette를 사용 하 여 얻은 타 액의 양을 측정 합니다.
- 타 액 무게 (mg)10 15 분 이상 또는 타 액 무게 (mg)의 비율으로 결과 표현/몸 무게 (g) 마우스.
참고: 면봉에서 추출 하는 타 액의 양을 측정 하는 경우 타 액 복구 (mL)의 볼륨 또는 타 액의 양 (mL)의 비율으로 결과 표현 / 몸 무게 (g) 마우스.
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Representative Results
실험 마우스 모델 시스템에서 응답 pilocarpine 자극으로 타 액을 생산 하는 능력은 침 샘 기능의 지표로 서 사용 됩니다. 타 액 생산 면봉 메서드에서 11 주 된 C57BL/6 여성 쥐에서 측정 했다. 그림 1A, 결과 타 액 (mg) 수집된 pilocarpine의 증가 복용량을 다음의 금액으로 표시 됩니다. 체중 1 mg/kg의 복용량에 쥐의 일부 (무의식적인 떨고 고 떨고) 조 난 전시 시작 했다. 따라서 더 높은 복용량의 1 밀리 그램/kg 체중 넘어 pilocarpine 하지이 연구에서 테스트 되었습니다. 그림 1B, 결과 마우스 몸 무게 (g)을 타 액 무게 (mg)의 비로 표시 됩니다. 샨 다, 이러한 데이터 좋은 복용량 응답 관계를 pilocarpine 양과 타 액 생산을 보여줍니다. 면봉에서 회복 하는 타 액의 양을 측정 했다. 그림 1 c에서처럼 타 액 무게와 볼륨 어디 타 액의 1 밀리 그램 = 0.001 mL 사이 중요 한 색인이 있다.
면봉 방법으로 얻은 결과 피 펫 수집 방법으로 얻은 그 비슷합니다. 그림 2A 면봉 메서드 피펫으로 방법에 의해 수집 된 타 액의 평균 금액은 매우 비슷한 차이 없습니다 통계적으로 중요 한 표시 됩니다. 그림 2B 2 C , 2D 표시 면봉 메서드 타 액에 생체의 추정을 영향 하지 않았다. 사실, 피펫으로 메서드를 비교 하 여 면봉 메서드 총 침 단백질 (그림 2C), 침 lysozyme 활동 (그림 2D) 및 타 액 IgA (그림 2E)의 평균 수준에서 전반적으로 높은 경향을 보였다. 그러나, 이러한 차이 했다 통계적으로 뜻깊은.
여기에 설명 된 타 액 수집 방법 다른 마우스 긴장 (그림 3)에 의해 생산 하는 타 액과 침 샘 hypofunction 다른 질병 조건 (그림 4)에 의해 유도 된 금액의 차이 감지할 수 있다. 그림 3A 10 12 주 된 여성 129S6, DBA1/J, BALB/c, C57BL/6 쥐에서 유도 pilocarpine 타 액 생산의 결과 보여 줍니다. 129S6 마우스 다른 긴장에 비해 타 액의 최저 금액을 생산. 이러한 쥐의 몸 무게 차이 하지 않았다고 크게 다른 (그림 3B) 주목 한다. 다음, 면봉 방법은 침 샘 hypofunction를 검출 하기 위하여 사용 되었다 그리고 두 가지 예는 그림 4에 표시 됩니다. 그림 4A 침 샘 hypofunction lipopolysaccharide (LPS)의 주입에 따라 타고 난 면제의 활성화에 의해 유도 된의 대표적인 결과 보여줍니다 (10 µ g/마우스, intraperitoneally). 컨트롤 마우스 염11주입 했다. LPS 처리 마우스 컨트롤에 비해 타 액에 뜻깊은 하락을 표시 합니다. 반응 Sjögren의 증후군 항 원 A와 항 체의 수동 전송/Ro52 유도 침 샘 hypofunction, 그리고이 모델 Sjögren의 증후군9의 특정 측면을 모방. 그림 4B같이 마우스 주입 보조 졸업생 플러스 안티-Ro52 항 체 함께 다루어지지 않은 쥐에 비해 크게 낮은 타 액 생산 또는 마우스 졸업생만 취급 합니다.
면봉 메서드를 구현 하 여 독립적인 연산자 간단 하다. 그림 5 는 10 13 주 된 여성 C57BL/6 쥐, 2 다른 연산자 6 다른 시간 지점에서 수행한 실험에서 타 액 생산을 보여줍니다. 연산자 연산자 II 이전 마우스 경험, 처리의 6 달 했지만 1 주일만 타 액 수집 방법 도입 되었다 하는 동안 경험을 처리 하는 마우스의 단지 2 개월을 시작 했습니다. 이러한 데이터는 거의 1 년 떨어져, 0.375 mg/kg pilocarpine 복용량을 사용 하 여 수행 하는 실험에서 생성 되었다. 두 연산자에 의해 얻은 타 액 비율 수치 (1.84 5.87)의 범위를 표시 합니다. 연산자의 실험 스팬 10 주 기간 동안 연산자 II의 실험은 3 일 연속 거의 1 년 후 (그림 5A)를 실시 했다. 특히, 시간이 지남에 따라 얻은 타 액 비율 크게 다른 없었다 (p = 0.064; Kruskal-Wallis 테스트). 더 간 연산자 유사 비교, 각 연산자에 대 한 3 실험에서 g 몸 무게 당 침 무게의 비율 풀링된 했다 고 그림 5B에 표시 됩니다. 타 액 비율 연산자에 의해 얻은 나 (평균 + SEM; 4.45 + 0.152, n = 38)는 크게 다른 연산자 2 (평균 + SEM; 4.21 + 0.169; n = 25; p = 0.296 맨 휘트니 테스트).
그림 1: 타 액 생산 pilocarpine 복용량에 따라 달라 집니다. C57BL6/J 쥐 (11 주 된 여성, 그룹 당 5) pilocarpine (0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg 및 1.0 mg/kg 체중)의 다른 복용량으로 주입 했다 및 타 액의 생산 15 분 (A) 에 대 한 측정 결과 밀리 타 액 금액 (평균 ± SEM)으로 표시 됩니다. (B) 데이터 평균 타 액 비율 (g 마우스 몸 무게 당 mg 침)으로 표시 됩니다. 11 주 된 여성 C57BL/6 쥐에서 타 액 (C) (n = 5) 면봉 방법에 의해 수집 된. Pilocarpine 0.375 mg/kg 몸 무게의 복용량에 사용 되었다. 젖은 면봉 mg에서 생산 하는 타 액의 양을 측정 하는 몸 무게 했다. 면봉에 타 액, 원심 분리에 의해 다음 복구 하 고 복구 된 타 액의 양을 측정 했다. 중요 한 계약 µ L.와 타 액에에서 침 무게 사이 볼은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 면봉 메서드 침에서 생체 분석 영향을 주지 않습니다. 11 주 된 여성 C57BL/6 마우스의 2 그룹에서 침 (n = 그룹 당 5 쥐), 면봉 메서드 또는 micropipet 메서드에서 수집 했다. 타 액 (A), 단백질 (B)의 평균 금액 평균 볼륨 차이 lysozyme 활동 (C)의 양을 의미 하 고 2 그룹 사이 양의 없습니다 통계적으로 중요 한 의미. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 쥐의 다른 긴장에 의해 베이스 라인 타 액 생산에 차이 감지 하는 타 액 컬렉션의 면봉 메서드. (A) 여성 (10-12 주 된) 마우스에서 타 액 15 분 0.375 mg/kg 체중의 pilocarpine 복용량을 사용 하 여 수집 되었다. (B) 쥐의 그룹 사이 평균 몸 무게 크게 다르지 않았다. 통계적 의미 분석 Kruskal-월리스에 의해 테스트, 던 다음의 여러 비교 테스트. p < 0.05 중요 하 게 고려 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 면봉 메서드 검색 침 샘 hypofunction. (A) (b 6 X A / J) F1 여성 쥐 중 LPS 솔루션 주입 했다 (0.1 mg/mL, 0.1 mL 당 마우스, intraperitoneally) 또는 염 분, 그리고 타 액 나중 26 h를 측정 했다. 대표적인 실험은 중요 한 보여준다 (p = 0.0079) LPS로 마우스에 타 액 생산에 드롭 (60%) 치료. (B) 침 샘 hypofunction Sjögren의 증후군에 대 한 실험적 마우스 모델 시스템에서 측정 했다. 선 역의 유도 대 한 이전 게시 된 수동 전송 모델 사용된4 몇 가지 수정을 했다. 여성 C57BL/6 마우스 (10-12 주 이전)에 졸업생 보조 제와 함께 주입 했다. 일에 14 그리고 20 쥐 토끼 안티 Ro52 혈 청의 0.05 mL로 주입 했다 및 타 액 생산 후 24 h. 참고 중요 한 측정 되었다 (p = 0.0003) 쥐에 타 액 생산에 드롭 (50%) 졸업생 및 안티 Ro52 혈 청으로 치료. 통계적 의미 분석 Kruskal-월리스에 의해 테스트, 던 다음의 여러 비교 테스트. p < 0.05 중요 하 게 고려 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 면봉 메서드 생성 재현성 결과 시간이 지남에 (A) 및 (B) 연산자 사이. 면봉 메서드 마우스 처리 경험 1 년 이상 실시 하는 실험에서 서로 다른 길이 가진 두 연산자 사이 비교 결과 보여 줍니다. 기준 타 액 생산 C57BL/6 여성 쥐 (나이의 10-13 주)에 각 연산자에 의해 측정 되었다. 결과 타 액 생산 (몸 무게 mg/g)의 중량으로 표현 됩니다. X 축에는 타 액 컬렉션의 날짜와 시간 동안 수집 된 데이터에서 결과 표시 됩니다 (A). 각 데이터 요소 한 마우스를 나타내며 마우스 각 시간에서 분석의 괄호에 표시 됩니다. 3 실험에서 풀링된 기준선 타 액 비율 (평균 + SEM) (B), 표시 하 고 연산자 사이 크게 다른 되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
타 액 생산은 복잡 한 프로세스 이며 많은 요인에 의해 영향을 받습니다. 따라서, 실험실 동물에 침 샘 기능을 측정 하는 것은 도전 될 수 있습니다. 추가 도전 침 샘 기능 같은 동물에서의 반복된 측정은 질병의 발병을 설정 하거나 복구 치료 다음과 설명 필요입니다.
이 보고서에 설명 된 면봉 메서드는 데이터를 표현 하기 위해 여러 옵션을 수행할 수 기술적으로 간단 하다. 얻은 결과 작은 간 연산자 변이로 재현할 수 있습니다. 메서드는 침 샘 기능 장애의 다른 모델에 타 액 생산에 감소를 검색할 수 있습니다. 중요 한 이점은 이다 불활성, 높은 흡수 성 고분자의 사용 및 수 침 생체 측정 수집, 타 액의 효율적인 복구. 이 방법의 또 다른 장점은 하나의 연산자에 의해 한 번에 최대 2 마우스에서 동시에이 절차를 수행 하는 것. 이 한 번에 하나의 마우스에서 수행 됩니다 일부 다른 방법 보다 훨씬 더 효율적입니다.
타 액 생산 측정의 다양성 모든 타 액 측정 기법의 베인 되었습니다. 변화를 최소화 하기 위해 그것은 프로토콜에 엄격 하 게 준수 하는 것이 중요입니다. 중요 한 단계를 포함: 주입 마 취 제 및 pilocarpine (표 1), 건조 하 고 젖은 면봉의 정확한 무게 레코드의 적절 한 선택 쥐 금식과 타 액을 수집에 대 한 하루 중 같은 시간. 주의 시간 관리는 타 액 컬렉션에 대 한 한 번에 2 마우스까지 설정 해야 합니다.
그림 3에서 보듯이, 마우스에 의해 생산 하는 타 액의 양을 스트레인 종속 이다. 따라서, 긴장, 나이, 그리고 섹스 일치 마우스 컨트롤 사용 해야 적절 한입니다. 특정 스트레인 및 조사, 실험 조건에 대 한 pilocarpine 복용량의 적정이 좋습니다. 비록 0.5 mg/kg을 넘어 pilocarpine의 높은 복용량 유도 선의 hypofunction를 평가 하기 위해 타 액의 생산 증가 낮은 복용량을 사용 하는 것이 좋습니다. 이로써 타 액 생산은 질병 사이 사소한 차이의 식별 및 마우스 제어. 0.5 mg/kg 몸 무게와 0.375 mg/kg 몸 무게의 침 샘 hypofunction를 설명 하기 위해 성공적으로 사용 되었습니다. 그러나, 특정 실험 모델 시스템 보다이 프로토콜에서 설명 하는 컬렉션의 짧은 또는 긴 기간을 요구할 수 있습니다 주목 해야한다. 이것은 각 실험실에 의해 시험 되어야 한다.
이 방법, 그리고 대부분 타 액 측정 방법의 한계는 무감각을 위한 필요 이다. 진공 방법 보고서 마 취5의 사용을 포함 하지 않습니다. 그러나, 마 취의 부재는 쥐에 있는 불안의 다양 한 수준의 유도합니다. 그들은 투쟁 하 고 튜브, 물어 경향이 있고 그에 영향을 미칠 수 타 액 출력 및 수집 효율. 쥐 마 취 Isoflurane 드롭 pilocarpine 유도 타 액 생산12유도합니다. 반면, 케 타 민 공감 자극13기관지와 침 분 비를 증가 시킵니다. 우리와 다른 사람 성공적으로 케 타 민 사용 하 고 xylazine 혼합물 pilocarpine 측정 하기 위한 마 취로 유도 타 액 생산4,7,,89. 수술 마 취에 대 한 권장된 범위는 100-200 mg/kg의 마 취 제 및 xylazine14의 5-16 mg/kg. 0.006 0.008의 복용량 mL/g 몸 무게 (60-80 mg/kg의 마 취 제와 xylazine의 6-8 mg/kg에 해당)이이 방법에 사용 권장된 범위 낮은 끝에 깊은 마 취 없이 동원 정지의 일관 된 수준을 제공 하기 위한 충분 한 .
면봉 메서드는 일상적으로 사용된 micropipet 메서드 대신 설립 되었다. 피펫으로 방법의 주요 불리는 높은 간 연산자 변화 및 한 번에 한 마우스에서 타 액을 수집 하는 필요 이었다. 면봉 메서드는 모두 이러한 문제를 해결합니다. 장점은 통계 분석 및 효율성 향상된에 전력 하는 데 필요한 동물의 수를 제한. 불활성 중합체 면봉으로 교체 면봉 면봉은 생물학적 활성 분자15의 정량에 영향 알려져 있기 때문에 더 나은 옵션을 제공 합니다.
면봉 방법 및 다른 개인 사이 그것의 높은 재현성의 단순 감안할 때, 그것은 기대 면봉 메서드 다른 실험실에서 연구자와 기관 사이의 마우스 모델의 더 나은 비교를 촉진 한다.
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Disclosures
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
연구는 국립 보건원, 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구 (DE025030)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
References
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- Fox, R. I. Sjögren's syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
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- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
