Summary
Гипофункция слюнных желез является частое следствие аутоиммунных заболеваний и лучевой терапии. Воспроизводимые оценки функции слюнных желез в моделях мыши этих заболеваний является технической проблемой. Здесь описан простой метод для точного и воспроизводимого измерения производства слюны у мышей.
Abstract
Больных с синдромом Шёгрен на, аутоиммунное заболевание, поражающее экзокринных желез, развивать слюнных желез воспаление и сократили производство слюны. Аналогично производство слюны серьезно подорваны у больных, получавших лучевой терапии рака головы и шеи. Грызунов модели, разработанные для имитации этих клинических условий, содействия пониманию патогенеза заболевания и позволяет для развития новых терапевтических стратегий. Таким образом способность точно, можно воспроизвести и неоднократно измерения функции слюнных желез в животных моделях имеет решающее значение. Опираясь на ранее описанные в литературе, был разработан метод который отвечает этим критериям и была использована для оценки функции слюнной железы у мышей. Дополнительным преимуществом этого нового метода является, что она осваивается легко и имеет небольшие отличия между оператором. Слюнные железы функция вычисляется как сумма (вес или объем) или ставка (мл/мин) слюны производства в ответ на стимуляцию пилокарпин. Собранные слюны является хорошим источником для анализа содержания белка, концентрации иммуноглобулина и других биомолекул.
Introduction
Слюнные железы вырабатывают слюну в ответ на различные неврологические и механических раздражителей1. Раздражители осуществляется через симпатическую и парасимпатическую нервную систему адренергических и холинергических рецепторов в железе. Пилокарпин — холинергических, пункт симпатомиметической агент, который действует преимущественно на мускариновых рецепторов. В слюнной железе он индуцирует выработку слюны, воздействуя на мускариновых ацетилхолиновый рецептор м31. Производство слюны, после пилокарпин администрации является показателем способности слюнных желез реагировать стимуляции и обычно используется как мера функции слюнных желез.
Точное измерение слюны производства имеет решающее значение в изучении слюнной железы болезней, включая синдром Шёгрен на2 и радиационной травмы после лечения рака головы и шеи3. Были разработаны несколько различных методов для измерения слюны у грызунов. К ним относятся прямые катетеризации выделительной Слюнных протоков4, сбора слюны из ротовой полости под вакуумной5и коллекции с помощью стеклянных капилляров6 или7,микропипеткой8, 9. прямой катетеризации Слюнных протоков предоставляет наиболее точную и чистой слюны. Однако это технически сложная процедура, и потенциал для причинения вреда протоковой исключает повторяющихся слюны коллекции от же животных. Сбора слюны под вакуумом может привести к переменной результаты из-за высыхания слюны из трубки. Далее эта потеря преувеличен в мышах с уменьшение слюноотделения. Стеклянные капилляры позволяют сбора слюны для последующего анализа, однако, изменения в вязкость слюны, секретируемых в состоянии больной предотвращает эффективное Заполнение капилляра. Кроме того попытки развертки полости для сбора остаточной слюны может привести к травме. Накапайте метод позволяет для полной коллекции, и за тот же оператор, это удивительно согласуется между экспериментов. Однако по неизвестным причинам, этот метод показывает значительные различия между различными операторами. Таким образом чтобы соответствующие сравнения, становится необходимым, что тот же оператор выполняет все эксперименты, связанные с конкретным проектом. Очевидно это является основным недостатком для лаборатории.
Преодолеть эти проблемы, была разработана процедура, что сочетает в себе методы сбора слюны используется для людей и грызунов. Тампоном, описанный ниже метод для измерения объема пилокарпин индуцированной слюны простой, воспроизводимость, не зависит от оператора и могут выполняться неоднократно в то же самое животное. Кроме того она позволяет сбора слюны для последующего анализа белков, иммуноглобулины или других биомолекул.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол, в описанный ниже был одобрен институциональный уход животных и использования Комитетом и следует этические руководящие принципы, установленные национальными институтами здравоохранения. Все представленные в настоящем докладе данные были получены с помощью самок мышей, которые были в возрасте 10-12 недель. Были использованы следующие штаммы мышей: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S и F1 (B6XA/J). Все мыши были размещены в клетках (5 животных в клетке) барьер в конкретных условиях возбудителя бесплатно и корма и воды ad libitum.
1. Подготовка
- Подготовить раствор гидрохлорида пилокарпин, весить 10 мг комплекса и растворить его в 1,776 мл стерильного изотонического раствора, vortexing, чтобы дать Стоковый раствор 5.63 мг/мл. Существует не нужно стерилизовать это решение. Но при желании, процеживают через фильтр 0.2 мкм. Храните этот раствор в нескольких аликвоты в морозильной камере-80 oC на срок до 3 месяцев. Каждый замороженных фондовой предназначен для одноместного размещения. После размораживания, не заморозить пилокарпин решения.
- Возьмите 0,6 мл трубки отцентрифугировать и тщательно пробивают небольшое отверстие в нижней части каждой трубы с подогревом 18-иглы. Задайте эти трубы в 2 мл пробирок. Трубы не должны быть стерильными.
- Используя острые, стерильные лезвия бритвы, разрежьте на куски около 2 см в длину цилиндрических абсорбирующий тампоны. Разрежьте каждый кусок 2 см по диагонали, чтобы дать 2 конической формы тампоны. Поместите один тампон в каждой из трубок отцентрифугировать 0,6 мл.
- Вес 0,6 мл отцентрифугировать тубы с сухим тампоном.
- Передача мышей, чтобы быть изучены в новой чистой клетку с бутылки воды. Держите мышей без пищи в течение по крайней мере за 2 ч до начала сбора слюны для предотвращения загрязнения слюной собранные частицы пищи.
Примечание: Нет необходимости держать 1 мышь в клетке для этой процедуры. Однако количество мышей, размещенных в каждой клетке зависит от конкретного учреждения правила и положения для использования животных. - Незадолго до окончания 2 h для приготовления рабочего раствора пилокарпин (0.0563 мг/мл) путем разбавления Стоковый раствор 100 x в стерильного физиологического раствора. Это не является необходимым для дальнейшей фильтрации стерилизации это решение. Всегда держите пилокарпин рабочего раствора на льду.
Примечание: Таблица 1 дает количество пилокарпин для инъекций для диапазона веса тела мыши дать окончательный дозу 0,375 мг/кг веса тела.
2. процедура
- Вес каждой мыши и определить дозу анестезии смесь для каждой мыши, с помощью таблицы 1. Привнести первая мышь с соответствующим объемом анестезии смесь, внутрибрюшинного маршрут. Установите таймер на 2 мин (большинство штаммов мыши, испытания в данном протоколе идти спать 2 мин). Убедитесь, что мышь должным образом наркозом отсутствием ходить, когда размещены на плоской поверхности. Если мышь еще ходить, ждать еще 2 мин перед переходом к следующему шагу. Примените капли смазочного глазная мазь для обоих глаз для предотвращения высыхания.
Примечание: В таблице 1, доза обезболивающий смеси составляет 0,007 мл/г веса тела. Оптимальный диапазон для выполнения этой процедуры — 0,006 до 0,008 мл/г веса тела. Однако, после 4 мин, если мышь до сих пор пешком или экспонирование отрывистые движения, консультироваться с институциональной ветеринар для надлежащим образом увеличивая дозу анестетика. - Определение дозы пилокарпин для мыши, с помощью таблицы 1 и придать соответствующую сумму внутрибрюшинного маршрутом. Установите таймер на 2 мин и вставьте фиксатор Тюбик 50 мл мыши до тех пор, пока голову и уши палку из конца разреза. Место труб под углом 45 градусов, с головой вниз и вентральной поверхности, обращенной вверх. Лента трубки процедуры Совету держать его от перемещения.
Примечание: Таблица 1 обеспечивает дозировка для мышей, более чем на 17 g, как эта процедура не была предпринята на мышах, весом ниже 17 g. - В конце 2 мин аккуратно вставить пару закрытой микро рассекает щипцами в рот и приподнимите подбородок вверх, чтобы открыть рот. Нажмите щипцы 1-2 мм далее в рот, убедившись, что язык рассматривается отдыхает на верхней рукоятке щипцы. С другой парой тонкой щипцов удерживайте предварительно взвешенный сухим тампоном недалеко от его конический наконечник.
- Аккуратно вставьте конический наконечник тампон в рот. Снять щипцы оставляя кончик тампона в ротовой полости.
- Схватить широкий конец тампоном, расширяя вне полости рта и поверните его, чтобы максимальная площадь контакта с рот. Держите тампон в этом положении в течение 15 мин.
Примечание: Это гарантирует, что тампон остается во рту в течение коллекции. Обратите внимание, что конический наконечник тампон действует как фитиль и более широкой части тампоном остается вне полости рта. - В конце 15 мин осторожно поверните тампон для сбора слюны, который не поглощается и поместите влажный тампон в 0,6 мл отцентрифугировать. Закройте трубку и установите его в 2-мл пробирку, размещены на льду.
Примечание: В настоящее время слизистой появится полностью сухой. Мыши могут теперь быть перемещены обратно в его клетке для восстановления от анестезии. - Перенесите мышью в клетке. Место, смоченным гранул пищи в клетке после сбора слюны, чтобы помочь быстрее регидратации.
Примечание: Мышей, Звонок в течение 10 мин после окончания коллекции. Подкожно подогретым 0,2 мл изотонического раствора может также предоставляться для ускорения восстановления. - Перейти к следующему мыши. Все мыши должны быть проверены до тех пор, пока они полностью восстановлены и являются амбулаторный.
3. измерения
- В конце всех коллекций вес 0,6 мл трубки с мокрой тампоном. Вычислите разницу между сырого веса и сухой вес, чтобы получить вес слюны производства. Место 0,6 мл трубки слюной обратно в 2-мл пробирку.
- Отрежьте шапки 2 мл пробирок. Затем центрифуга 2 мл пробирок для 2 мин на 7500 x g, при 4oC в микро центрифуги для восстановления слюны. Измерьте объем слюны, полученные с помощью микропипеткой.
- Экспресс результаты как слюна вес (мг)10 свыше 15 мин или как отношение веса слюны (мг) / мыши веса тела (g).
Примечание: Если был измерен объем слюны, извлеченные из тампоном, выразить результаты как объем слюны восстановленные (мл) или отношение объема слюны (мл) / мыши веса тела (g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В экспериментальной мыши модель системы способность производить слюны в ответ на стимуляцию пилокарпин используется как показатель функции слюнных желез. Слюны производства была измерена в самок мышей C57BL/6 11-недельных методом тампоном. На рисунке 1Aрезультаты выражаются как количество слюны (мг), собранные после увеличения дозы пилокарпин. В дозе 1 мг/кг веса тела некоторые из мышей начал выставке дистресс (недобровольное встряхивания и дрожа). Поэтому более высокие дозы пилокарпин, помимо 1 мг/кг веса тела, не были проверены в этом исследовании. В рисунке 1Bкак отношение веса слюны (мг) представлены результаты мыши веса тела (g). В совокупности эти данные показывают хорошую дозу ответ отношения между пилокарпин суммы и слюны производства. Было также измеряется объем слюны, оправился от тампона. Как показано на рисунке 1 c, существует значительный конкорданцию слюны вес и объем, где 1 мг слюны равна 0,001 мл.
Результаты, полученные с помощью метода тампоном похожи на тех, полученные с помощью метода коллекции пипеткой. Рисунок 2A показывает, что среднее количество слюны, собранные тампоном метод и метод накапайте очень похожи и различия статистически не являются существенными. Рисунок 2B 2С и 2D показывают, что метод тампон не влияют оценки биомолекул в слюне. В самом деле по сравнению с методом пипетки, тампоном метод показан выше, общая тенденция в средние уровни общего слюнных белка (рис. 2 c), активность слюнных лизоцима (Рисунок 2D) и слюнных IgA (Рисунок 2E). Однако эти различия статистически не были значительными.
Метод сбора слюны, описанный здесь способен обнаружить различия в размере слюны, производимых различными мыши штаммов (рис. 3) и гипофункции слюнной железы, вызванных условиях различные заболевания (рис. 4). На рисунке 3A показывает результаты пилокарпин индуцированной слюны производства от 10-12-недельных самок мышей C57BL/6, BALB/c, DBA1/J и 129S6. 129S6 мышей производится наименьшее количество слюны, по сравнению с другими напряжениями. Следует отметить, что различия в веса этих мышей были не значительно отличаются (рисунок 3B). Затем тампоном метод был использован для обнаружения слюнной железы гипофункции, и два примера показаны на рисунке 4. На рисунке 4A показывает представитель результат слюнной железы гипофункции, вызванных активации врожденного иммунитета после инъекции липополисахарида (LPS) (10 мкг/мыши, внутрибрюшинно). Мышь управления вводили физиологическим11. LPS-лечение мышей показывают значительное падение в слюне, по сравнению с элементами управления. Пассивной передачи антител реактивной с Шёгрен синдром антигена A/Ro52 индуцирует слюнной железы гипофункции, и эта модель имитирует некоторые аспекты Шёгрен синдром9. Как показано на рисунке 4В, мышей вводят с адъювантом квасцов плюс антител анти Ro52 вместе было значительно меньше слюны, по сравнению с необработанными мышей или мышей обрабатывают только квасцы.
Тампоном метод прост в реализации и независимого оператора. Рисунок 5 показывает слюны производства от женщин 10-13-week-old мышей C57BL/6, в экспериментах, выполненных в 6 точках разное время 2 различных операторов. Оператор, я начал с только 2 месяца мыши, обработка опыт, в то время как оператор II было 6 месяцев предварительной обработки опыт мыши, но только был введен метод сбора слюны на одну неделю. Эти данные были получены в экспериментах, проводимых почти один год, с использованием дозы пилокарпин 0,375 мг/кг. Слюна коэффициенты, полученные как операторы показывают широкий спектр показаний (1,84 до 5,87). Оператор экспериментов я в интервале в течение 10 недель в то время как оператор II эксперименты были проведены более 3 дней подряд почти год спустя (Рисунок 5A). Примечательно, слюна коэффициенты, полученные со временем не различались (p = 0.064; Kruskal-Wallis тест). Для дальнейшего сравнения между оператором вариации, соотношения массы слюны в г веса тела от 3 экспериментов для каждого оператора были объединены и показано на рисунке 5B. Слюна соотношения получены оператором я (mean + SEM; 4,45 + 0.152, n = 38) существенно не отличаются от оператора 2 (mean + SEM; 4.21 + 0,169; n = 25; p = 0.296 тест Манна-Уитни).
Рисунок 1: слюны производства зависит от дозы пилокарпин. C57BL6/J мышей (11-недельных самок, 5 для каждой группы) были введены с разными дозами пилокарпин (0,25 мг/кг, 0,5 мг/кг и 1,0 мг/кг массы тела) и слюны производства была измерена на 15 мин (A) результаты представлены как количество слюны мг (среднее ± SEM). (B) данных представлены как отношение средней слюны (мг слюны на g мыши массы тела). (C) слюны из 11-недельных самок мышей C57BL/6 (n = 5) была собрана методом тампоном. Пилокарпин был использован в дозе 0,375 мг/кг веса тела. Влажные салфетки были взвешены для измерения количества слюны производства мг. Слюны в тампоны затем восстановлена центрифугированием, и томов восстановленные слюны были измерены. Важное соглашение рассматривается между слюны вес объема мг и слюны в мкл. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: метод тампон не влияет анализа биомолекул в слюне. Слюна из 2 групп 11-недельных самок мышей C57BL/6, (n = 5 мышей каждой группы), было собрано мазок методом или методом micropipet. Различия в средних объемов слюны (A), среднее количество белка (B), означает количество активность лизоцима (C) и означает, что количество IgA между 2 группами статистически не являются значительными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: тампоном метод сбора слюны обнаруживает различия в базовой линии слюны производства различных штаммов мышей. (A) слюны из самок мышей (10-12-недельных) были собраны за 15 мин с помощью пилокарпин дозы 0,375 мг/кг веса тела. (B) среднего веса между группами мышей не различались. Была проанализирована статистическая значимость Крускала-Уоллиса тест, а затем Данн в множественные сравнения теста. P < 0,05 считался значительным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: тампоном метод обнаруживает слюнной железы гипофункции. (A) (B6 X A / J) самок мышей F1 вводили раствором либо ЛПС (0,1 мг/мл, 0,1 мл на мышь, внутрибрюшинно) или физиологического раствора и слюна измерялась 26 h позже. Представитель эксперимент показывает значительное (p = 0.0079) (60%) падением производства слюны у мышей, получавших LPS. (B) слюнной железы гипофункция была измерена в экспериментальной мыши модель системы Шёгрен на синдром. Ранее опубликованные пассивной передачи модели для индукции железистой дисфункции был используется4 с несколькими изменениями. Самок мышей C57BL/6 (10-12 недель) вводили с адъювантом квасцов. В дни 14 и 20 мышей вводили с 0,05 мл сыворотки кролика анти Ro52 и слюны производства была измерена после 24 ч. отмечаем значительный (p = 0.0003) падение (50%) слюны производства мышей лечение сывороткой квасцов и анти Ro52. Была проанализирована статистическая значимость Крускала-Уоллиса тест, а затем Данн в множественные сравнения теста. P < 0,05 считался значительным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: тампоном метод дает воспроизводимые результаты с течением времени (A) и между операторами (B). Тампоном метод показывает сопоставимые результаты между двумя операторами с различными длинами мыши, обработка опыт работы в экспериментах, проведенных за один год. Базовые слюны в самок мышей C57BL/6 (10-13 недель возраста) был измерен каждого оператора. Результаты выражаются в виде вес слюны производства (мг/г веса тела). Даты сбора слюны на оси x и отображаются результаты из данных, собранных за время (A). Каждая точка данных представляет одну мышь, и количество мышей, анализируются в каждый момент отображается в скобках. Базовые слюны коэффициенты (mean + SEM) пул из 3 эксперименты показываются (B)и не значительно отличаются между операторами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Слюны является сложным процессом и зависит от многих факторов. Таким образом измерения функции слюнных желез в лабораторных животных может быть проблемой. Дополнительной проблемой является то, что повторные измерения функции слюнных желез в то же самое животное необходимо установить начало болезни или продемонстрировать восстановление после лечения.
Тампоном метод, описанный в настоящем докладе является технически простой для выполнения с множеством вариантов для представления данных. Полученные результаты являются воспроизводимость, с небольшим изменением между оператором. Метод может обнаружить снижение производства слюны в различных моделях дисфункции поджелудочной железы. Существенным преимуществом является использование инертных, высоко абсорбирующий полимеров и эффективного восстановления слюны собраны, позволяя измерения слюнных биомолекул. Еще одним преимуществом данного метода является, что это возможно для выполнения этой процедуры одновременно до 2 мышей одновременно одним оператором. Это значительно более эффективным, чем некоторые из других методов, где она выполняется в одной мыши одновременно.
Изменчивость в слюны производства измерений были bane всех методов измерения слюны. Чтобы минимизировать изменчивость, важно строго придерживаться протокола. Важнейшие шаги включают в себя: выбор то же время дня голодания мышей и сбора слюны, соответствующие дозирование анестетика и пилокарпин (таблица 1) и точный вес отчеты о сухих и влажных тампоны. Тщательного время управления требуется задать до 2 мыши во время сбора слюны.
Как показано на рисунке 3, количество слюны производства мышей является штамм зависимых. Таким образом соответствующие штамм, возраст и пол, соответствием мышей должны использоваться как элементы управления. Титрования дозы пилокарпин, для конкретного штамма и экспериментальной состояния проводится расследование, настоятельно рекомендуется. Несмотря на более высокую дозу пилокарпин за 0,5 мг/кг вызывает увеличение производства слюны, чтобы оценить железистые гипофункция, рекомендуется использовать более низкой дозе. Это позволяет выявить даже незначительные различия в слюны производства между больными и контроль мышей. Чтобы продемонстрировать слюнной железы гипофункции успешно используются дозы 0,5 мг/кг веса тела и 0,375 мг/кг веса тела. Следует, однако, отметить, что некоторые экспериментальные модели системы может потребоваться больше или меньше периодов коллекции, чем описанное в настоящем Протоколе. Это должна быть проверена каждой лаборатории.
Ограничением этого метода, и большинство методов измерения слюны является потребность в анестезии. Отчет с методом вакуум не включают в себя использование анестезии5. Однако отсутствие анестезии вызывает различные уровни тревожности у мышей. Они склонны бороться и укусить трубки, и что в свою очередь, может влиять на эффективность производства и сбора слюны. Изофлюрановая анестезии у крыс вызывает падение пилокарпин индуцированной слюны производства12. В противоположность этому кетамин увеличивает секрецию бронхиальных и слюнных через симпатичная(ый) стимуляции13. Мы и другие успешно использовали кетамина и ксилазина смесь как анестетик для измерения пилокарпин индуцированной слюны производства4,,78,9. Рекомендованный диапазон для хирургического наркоза-100-200 мг/кг кетамина и 5-16 мг/кг Ксилазина14. Доза 0,006-0,008 мл/г веса тела используется в этом методе (соответствует 60-80 мг/кг кетамина и 6-8 мг/кг Ксилазина) падает в нижней части рекомендуемого диапазона и достаточно для обеспечения постоянный уровень иммобилизации без глубокого наркоза .
Тампоном метод был создан как альтернатива метод обычно используется micropipet. Основным недостатком метода накапайте был высокая изменчивость между оператором и необходимость сбора слюны из одной мыши одновременно. Тампоном метод решает обе эти проблемы. Преимущества включают в себя ограничение на количество животных, необходимых для достижения власти в статистический анализ и повышение эффективности. Замена ватные тампоны с инертной полимер тампоны предлагают лучший вариант с ватные тампоны, как известно, воздействие количественный биологически активных молекул,15.
Учитывая простоту метода тампоном и его высокая воспроизводимость между разными лицами, предполагается, что метод тампоном облегчит лучшее сравнение моделей мыши между исследователями в различных лабораториях и учреждениями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грант от национальных институтов здравоохранения, Национальный Институт стоматологии и краниофациальных исследований (DE025030).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
References
- Proctor, G. B.
- Fox, R. I. Sjögren's syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren's syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Cold Spring Harbor Protocols. Cold Spring Harb Protoc. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2006).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
