Summary
Чтобы расширить возможности лабораторий во всем мире для оценки отбора пациентов с раком легких для лечения с pembrolizumab, на основе надежных и воспроизводимых, мы разработали assay который использует 22 c 3 антитела концентрата на широко доступны Иммуногистохимическая autostainer, для цитологии и биопсии образцов.
Abstract
Монотерапия Pembrolizumab был утвержден на первой и второй линии лечения больных с PD-L1-выражая расширенный non-немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ). Тестирование для PD-L1 выражение с диагностики assay PD-L1 иммуногистохимия (IHC) 22 c 3 компаньон, который дает опухоль доля Оценка (TPS), была проверена на опухолевой ткани. Мы разработали оптимизированные лаборатории разработали тест (LDT), использующий 22 c 3 антитела (Ab) концентрат на широко доступны ИХС autostainer для цитологии и биопсии образцов. PD-L1 TPS оценивалась с 120 парных целом опухолевой ткани секций и биопсия и с 70 паре образцы биопсии и цитологии (бронхиальной Моет, n = 40; плеврального излияния, n = 30). Ab 22 c 3, на основе концентрата LDT показал высокий уровень согласованности между биопсии (~ 100%) и цитологии образцов (~ 95%), по сравнению с PD-L1 IHC выражение определено с помощью пробирного 22 c 3 компаньон PD-L1 IHC на обоих TPS сократить пунктов (≥1%, ≥50%). Оптимизированный LDT, представленные здесь, используя 22 c 3 Ab концентрат для определения выражения PD-L1 в обоих опухолевой ткани и цитологии образцов, будет расширяться лабораторий во всем мире возможность оценить отбора больных НМРЛ для лечения с Монотерапия pembrolizumab на основе надежных и воспроизводимых.
Introduction
Последние клинические исследования продемонстрировали эффективность pembrolizumab, гуманизированные моноклональные IgG4 Каппа isotype антитела которое блокирует взаимодействие между запрограммированной смерти клетки 1 (PD-1) и ее лигандов, PD-L1 и PD-L2, в лечении больных с Расширенные НМРЛ1,2,3,4.
В настоящее время pembrolizumab одобрен для лечения НМРЛ PD-L1-выражая в обоих лечения наивно пациентов с выражением PD-L1 TPS ≥50% и не рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) или Анапластическая лимфомы киназы (ALK) геномных опухоли аберраций3 и для ранее лечение пациентов с TPS PD-L1 ≥1%1.
PD-L1 белка выражение определяется IHC широко используется как assay интеллектуального биомаркеров для терапии анти PD-1/PD-L1. В клинических испытаниях pembrolizumab TPS PD-L1, полученные с формалином Исправлена парафин врезанных образцов ткани (FFPE) было определено с помощью анализа компаньон PD-L1 IHC 22 c 35. Этот assay был одобрен в США продуктов питания и медикаментов (FDA) и был CE помечен в Европе для определения опухоли PD-L1 TPS5.
Дополнительные глобальные параметры через учреждения для надежных и качественных оценок PD-L1 TPS с LDTs, которые используют концентрат 22 c 3 антитела необходимы для поддержки клинических решений относительно отбора пациентов для pembrolizumab лечение. Большое количество лабораторий патологии не имеют доступа к Компаньон диагностическое PD-L1 IHC 22 c 3 assay. Таким образом важно развитие надежных и последовательных LDTs совместим с дополнительными, широко доступны ИХС autostainer платформ.
Кроме того существует необходимость в создании LDTs с использованием цитологии образцов, которые являются только образец типа часто доступны от больных НМРЛ. PD-L1 IHC 22 c 3 компаньон пробирного проверяется для резекции, биопсия иглы ядро и бронхоскопии только если бронхоскопии дает 100 опухолевых клеток. Хотя выше типы пример часто получаются, цитологических мазков более легко собираются и являются наиболее широко доступен образец типа в некоторых учреждений6,7. Однако есть в настоящее время нет проверенных диагностических пробирного для оценки выражения PD-L1 в цитологических мазков; надежный LDTs совместим с цитологических мазков облегчило бы высокое качество тестирования PD-L1.
Кроме того при установлении клинические проверки LDT, ИГХ должны выполняться в подобным образом соответствующий клинически проверенных коммерческих тест8. Например чтобы получить тот же самый сигнал в серийный разделы, такие как антитела титрования, предварительной задержки, время инкубации и усиление систем9должны быть проверены несколько важных шагов.
Мы недавно разработали оптимизированные LDT, использующий 22 c 3 антитела концентрат для оценки выражения PD-L1 биопсий опухоли и цитологии образцы10,11. Мы нашли высоким согласования с LDT против «золотой стандарт» PD-L1 IHC 22 c 3 пробирного10,11. Этот клинически проверенных протокол будет поддерживать надежный, высококачественный PD-L1, тестирование в регионах во всем мире.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были утверждены Комитетом по местным этики (человека Комитет по этике исследований, центр больничного университетский de Nice/Tumorothèque BB-0033-00025).
Примечание: Этот протокол специально приспособлен для использования 22 c 3 антитела сосредоточиться на коммерчески доступных автоматизированных IHC Стайнер (упоминаемый как autostainer здесь, смотрите Таблицу материалов) для биопсии опухоли и цитологических мазков.
1. Подготовка образцов ткани опухоли
- Исправьте опухолевой ткани в нейтральных буферизации формалина 10% (NBF) в кассету.
Примечание: Как правило опухолевой ткани от опухоли легких проксимальной получается бронхоскопии, пульмонолог, или пульмонолога, выполняются умеренный седативный эффект. Для периферического поражения и заболевания легких, диффузный указывается биопсии трансбронхиальную или иглы. Эти процедуры обычно делается в хирургии комнате или в отделении интенсивной терапии. - Вставить кассету в парафин.
Примечание: Фиксация может быть достиган перфузии или погружения, сразу после вскрытия и обычно требуется 8-10 ч. Фиксаторные объем должен быть выше, чем объем образца x 15 – 20. Чтобы исправить биопсия тканей для более чем 10 h, не рекомендуется, поскольку overfixation может вызвать маскировки антигена. Фиксация скорость составляет около 1 мм/ч при комнатной температуре. - Проникновения образца фиксированной ткани с воском в ткани процессора (см. Таблицу материалы).
Примечание: Обезвоживания осуществляется в три ванны алкоголя с увеличением концентрации 70%, 85% и 90%. Вода удаляется наконец три ванны окончательный абсолютного алкоголя. Очистка выполняется в три бани толуола и проникновение воск горячий воск бани (44-60 ° C). - Внедрить ткани внутри формы заполнены с расплавленным парафином (см. Таблицу материалы) и ждать затвердевания.
- В разделе парафин врезанных тканей при толщине 3 мкм на микротома.
- Передача, парафин ленты к положительно заряженному Микроскоп стекла слайд (см. Таблицу материалы).
- Сухие слайд за 1 ч при 37 ° C.
Примечание: Хранить в разделах ткани на 2-8 ° C (предпочтительно) или при комнатной температуре до 25 ° C для сохранения антигенностью и пятна в пределах 15 d секционирование.
2. Подготовка цитологических мазков
-
Собирать бронхиальной мойки в консервант раствор (см. таблицу материалы).
Примечание: Для этого используется техника стандартные бронхоскопии.- Промывание распределение бронха для выборки. Соберите мыть в чистую емкость. Этикетке контейнера с пациентом первый и фамилия, Дата рождения и образец источника.
- Передача бронхиальной стирок 50 мл Конические трубки и добавить 2 g DL-Дитиотреитол порошок (см. Таблицу материалы), вихревой трубки для 30 минут и затем центрифуги на 250 x g 5 мин при комнатной температуре.
- Удалить супернатант и добавить 10 мл раствора Муколитические (см. Таблицу материала).
- Shake образца для 20 минут на средней скорости (уровень 9) и центрифуги на 250 x g 5 мин при комнатной температуре.
- Удалить супернатант и депозитные ячейки Пелле в коллекции пробирки, содержащие 10% NBF.
- Добавьте 4 капли реагента подготовки ячейки блока (см. Таблицу материалы) клетки Пелле.
- Перенесите ячейки Пелле кассету, исправить это в 10% NBF и парафин вставлять его ячейку блока подготовки и секционирование (см. шаги 1.1-1.7).
3. PD-L1 пятнать Assay
- Перейдите на autostainer и на компьютере.
- Дважды щелкните на значке autostainer и выберите пользователя.
- Нажмите на «Создать ярлык» , а затем на «Протокол».
- Дважды щелкните протокол 22 c 3.
Примечание: Протокол впервые установлена на компьютере autostainer, нажав на «создать протокол». Полный протокол предоставляется в качестве дополнительных файлов 1. - Введите ID пациента на этикетке и нажмите на «Печать».
- Вставить метку на слайде.
- Откройте слайд, нажав на кнопку ящик, который был выбран.
- Место помечены слайд на термальная пусковая площадка с этикеткой вверх и внутрь.
- Закройте ящик слайда.
- Снимите крышки из автоматов и загрузить реагентов на реагенты стойки.
- Открыть капот ситечко и место стойки на карусель реагентов, убедившись, что они подходят и держать в положении.
- Закройте капот.
- На программное обеспечение нажмите на инструмент, который будет использоваться и нажмите на «Запуск».
- В конце процедуры IHC промойте слайд в течение нескольких секунд с водопроводной водой и одной каплей моющего раствора.
- Увлажняет слайд с одной ванной 100% этанола и второй ванной этанола 95% в течение нескольких секунд.
- Место слайда в coverslipping машину для автоматической загрузки coverslip.
4. толкование пятнать PD-L1
Примечание: Квалифицированный врач-патологоанатом должен выполнить толкование результатов испытания IHC PD-L1.
- Оцените качество окрашивания PD-L1, анализируя положительной и отрицательной контроля до осмотра пациента образца.
Примечание: Результаты, полученные на пациента образца, считаются недействительными, если окрашивание элементов управления не является приемлемым. - Подтвердите наличие минимум 100 жизнеспособных опухолевых клеток под микроскопом.
Примечание: Отчет, когда пациента образец имеет меньше чем 100 опухолевых клеток. - На низкий масштаб 4 X оцените все районы хорошо сохранились позитивные и негативные опухоли.
Примечание: При низком увеличении, частичное мембраны пятнать или окрашивание мембраны слабой интенсивности (1 +) может быть трудно признать. - Оценка частичной или полной клеточной мембраны пятнать.
Примечание: Цитоплазматический окрашивание имеет будут исключены из толкования. - Рассчитайте TPS, оценки доли PD-L1 позитивных опухолевых клеток по отношению к все опухолевые клетки присутствуют в районах хорошо сохранившийся опухоли.
Примечание: Следует только жизнеспособные опухолевых клеток. Все другие клеточные элементы, например иммунные клетки, отмершие клетки, нормальные клетки и артефакты, должны быть исключены из рассмотрения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью процедуры, представленные здесь и как описано подробно в недавней публикации этой группы10,11, оптимизированный LDT был клинически апробирован с 120 архивных FFPE NSCLC биопсии образцов от пациентов, перенесших хирургическое Резекция или биопсия в больнице университета Пастера, Ницца, между марта 2007 года и марта 2016 года. Кроме того, для оценки выражения PD-L1 цитологических мазков, TPS оценивалось в 70 образцы биопсии парных тканей и клеток блоков, которые были подготовлены от бронхиальной Моет (n = 40) или плеврального излияния (n = 30) (собраны в Пастера Университетская больница, Ницца, между июля 2014 года и ноября 2016). Все слайды были свежие cut и окрашенных в течение 24 часов.
Представитель, окрашивание шаблон с биопсией, проявленную образцов с использованием антител 22 c 3 концентрата (LDT), по сравнению с assay PD-L1 IHC 22 c 3 компаньон (золотой стандарт) в Рисунок 1A и 1B. С помощью TPS ≥1%, 54/120 случаев (45 процентов) были PD-L1 положительным, при использовании TPS ≥50%, 29/120 случаев (24%) были рассмотрены положительные для PD-L1.
Внутриклассовой коэффициент корреляции (ICC) используется для измерения корреляции TPS Оценка как непрерывной переменной было 99% между LDT и золотой стандарт. С помощью обоих TPS сократить точки ≥1% и ≥50%, κ ноты для interpathologist соглашения были равны 1 в рамках платформы LDT.
Представитель пятнать шаблон с цитологии, образцов, используя антитело 22 c 3 сосредоточиться на LDT, по сравнению с PD-L1 IHC 22 c 3 комплекта (золотой стандарт) показан на рисунке 1 c и 1 D. Уровень соответствия 70 пар цитологии и биопсии образцов с LDT, используя либо один из TPS сократить точки ≥1% и ≥50% был больше чем 95% и МТП, с использованием TPS Оценка как непрерывной переменной между 0,88 и 0.90. Этот вывод согласуется через каждый тип образца цитологии (плеврит против. бронхиальной мыть) или опухоли Гистологическая картина (аденокарцинома против. плоскоклеточный рак) с ICC между 0,82 и 0,96. При сравнении PD-L1 TPS 37 (из 70) пар цитологических мазков с LDT биопсии образцы с золотой стандарт, уровень согласования с помощью ≥1% TPS или ≥50% сократить точки TPS была больше, чем 97% и ICC между 0,93 и 0,95.
Рисунок 1: представитель пятнать узор на цитологии и биопсии образцов, используя антитела 22 c 3 концентрата (LDT), по сравнению с PD-L1 IHC 22 c 3 комплекта (золотой стандарт). (A) Эта панель показывает проба PD-L1 IHC 22 c 3 используется на биопсии опухоли. (B) Эта группа показывает оптимизированный LDT, используя антитела 22 c 3 концентрата на последовательных участках от же биопсия опухоли как в группе Aпроанализированы. (C) Эта группа показывает проба PD-L1 IHC 22 c 3 в блоке клеток. (D) этой группы показывает, оптимизированный LDT, используя антитело 22 c 3 сосредоточиться на серийный разделов из одного блока ячеек, как анализ в группе C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы подтвердили оптимизированный LDT, используя 22 c 3 PD-L1 антитела концентрат, сравнивая его с соответствующей клинически проверенных коммерческих тест10,11. 22 c 3 сосредоточены на основе антител LDT, показали высокий уровень согласования между образцы цитологии (~ 95%) по сравнению с PD-L1 IHC выражение определено с помощью проба PD-L1 IHC 22 c 3 ≥1% TPS и ≥50% TPS, вырезать точек и биопсия (~ 100%). Как недавно рекомендованный Международной ассоциации по изучению рака легких, PD-L1 позитивные районы должны быть одинаковыми для приблизительно 10 PD-L1 негативные проб, 10 PD-L1 положительных примеров и 20 охватывающих линейный динамический диапазон клинически проверены PD-L1 IHC тест8. Мы провели исследование проверки на 120 биопсии и 70 цитологических мазков. В целом согласования был высоким, независимо от TPS отсечки для позитивности, тип образцов, или опухоли Гистологическая картина. Представленные здесь выводы согласуются с теми из других предыдущих исследований, показывающих высокую скорость согласования для ткани и цитологии образцов12,13,14,15.
В этом исследовании, все образцы были установлены в 10% NBF. Мы не проводили оценки воздействия других фиксаторов, а влияние на PD-L1 пятная других не формалин фиксативов такие как на спиртовой основе фиксаторы в настоящее время-неисследованной. Присутствие иммунных клеток, выражая PD-L1, особенно макрофаги, требует тщательной интерпретации цитологии образцов. Эти образцы должны быть оценены со ссылкой на последовательный гематоксилином и эозином слайд, и, в некоторых сложных случаях, могут выполняться дополнительные пятна для оценки иммунные клетки для исключения любого неправильного толкования выражения PD-L1 в опухолевых клетках только.
Это исследование содержит ряд ограничений, в том числе ретроспективный анализ на одно учреждение и тот факт, что ни один пациент лечился с pembrolizumab для оценки клинических исходов. Кроме того незначительные ограничения LDT здесь представлены проблемы гранулированных окрашивание шаблон, который наблюдался иногда при использовании усиление систем, которые могут затруднить их интерпретации. Кроме того окрашивание шаблон иммунных клеток является несколько более интенсивным, чем наблюдается с золотой стандарт. Подготовке патологов необходима для получения правильной интерпретации PD-L1 окрашивание с МГС. 16
В клинических условиях, надежность LDTs необходимо поддерживать со временем путем сертификации и аккредитации, следующих стандартных оперативных процедур и регулярно участвуя в внешнего качества оценки схемы8. Гарантия клинических прогнозирования производительности может быть обеспечен только тогда, когда эти условия будут выполнены8.
Протокол здесь представлены адреса острую необходимость PD-L1 LDTs цитологии и биопсии образцов при анализе на широко доступны autostainer по географическим регионам, которые не могут быть оснащены assay золотой стандарт. LDT, представленные здесь, который был оптимизирован с помощью 22 c 3 антитела концентрат, может использоваться для оценки выражения PD-L1 по цитологии и биопсии образцы от больных НМРЛ. Это позволит значительно расширить количество лабораторий, которые могут предложить высокое качество PD-L1 тестирование для выявления пациентов с НМРЛ, которые имеют право на лечение с pembrolizumab монотерапия, на основе надежных и воспроизводимых.
Потенциального будущего направления заключается в оценке возможности использования других типов образцов цитологии (например, образцы из эндобронхиальная тонкоигольной биопсии, бронхоскопия руководствуясь Фна, УЗИ руководствуясь Фна и кисти бронхо) с 22 c 3 антитела на основе концентрата LDTs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось Merck & Co., Inc., Москва, Нью-Джерси, США. Спонсоры играли никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NovaPrep HQ1 | Novacyt | NA | Preservative solution for cytology specimens |
| Novaprep® HQ+ B | Novacyt | NA | Mucolytic solution |
| Tissue-Tek VIP 6 | Sakura | 6042 VIP 6 | |
| Tissue-Tek TEC 5 Tissue Embedding Console System | Sakura | 5229 TEC 5 | |
| microscope glass slide SuperFrost Plus | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| DL-Dithiothreitol powder | Sigma-Aldrich | D3801 | |
| Heidolph Multi Reax Vortex Shaker | Thermo Fisher Scientific | 13-889-410 | |
| Shandon Cytoblock | Thermo Fisher Scientific | 7401150 | |
| 22C3 anti-PD-L1 concentrate antibody | Agilent Dako | #M365329 | |
| PD-L1 IHC 22C3 pharmDx | Agilent Dako | SK006 | |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | AS480 | |
| BenchMark ULTRA autostainer | Ventana | #750-600 | |
| OptiView HQ Universal Linker | Ventana | #760-700 | |
| OptiView HRP Multimer | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Amplification H2O2 | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplifier | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplification Multimer | Ventana | #760-100 | |
| OptiView DAB | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Copper | Ventana | #760-700 | |
| Hematoxylin II | Ventana | #790-2208 | |
| Bluing Reagent | Ventana | #760-2037 | |
| Cell Conditioning 1 (CC1) | Ventana | #950-124 | |
| Tissue-Tek Film Coverslipper | Sakura | 4742 |
References
- Garon, E. B., et al. Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 372 (21), 2018-2028 (2015).
- Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
- Reck, M., et al. Pembrolizumab versus Chemotherapy for PD-L1-Positive Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
- Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
- Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).
- Folch, E., Costa, D. B., Wright, J., VanderLaan, P. A. Lung cancer diagnosis and staging in the minimally invasive age with increasing demands for tissue analysis. Translational Lung Cancer Research. 4 (4), 392-403 (2015).
- Padmanabhan, V., et al. Improving Adequacy of Small Biopsy and Fine-Needle Aspiration Specimens for Molecular Testing by Next-Generation Sequencing in Patients With Lung Cancer: A Quality Improvement Study at Dartmouth-Hitchcock Medical Center. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 141 (3), 402-409 (2017).
- Tsao, M. S., et al. IASLC ATLAS of PD-L1 Immunohistochemistry Testing in Lung Cancer. , International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) Press. (2017).
- Thunnissen, E., de Langen, A. J., Smit, E. F. PD-L1 IHC in NSCLC with a global and methodological perspective. Lung Cancer. , 102-105 (2017).
- Ilie, M., et al. Use of the 22C3 anti-PD-L1 antibody to determine PD-L1 expression in multiple automated immunohistochemistry platforms. PLoS One. 12 (8), e0183023 (2017).
- Ilie, M., et al. Use of the 22C3 anti-programmed death ligand 1 antibody to determine programmed death ligand 1 expression in cytology samples obtained from non-small cell lung cancer patients. Cancer Cytopathology. 126 (4), 264-274 (2018).
- Skov, B. G., Skov, T. Paired Comparison of PD-L1 Expression on Cytologic and Histologic Specimens From Malignancies in the Lung Assessed With PD-L1 IHC 28-8pharmDx and PD-L1 IHC 22C3pharmDx. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 25 (7), 453-459 (2017).
- Russell-Goldman, E., Kravets, S., Dahlberg, S. E., Sholl, L. M., Vivero, M. Cytologic-histologic correlation of programmed death-ligand 1 immunohistochemistry in lung carcinomas. Cancer Cytopathology. 126 (4), 253-263 (2018).
- Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
- Stoy, S. P., Rosen, L., Mueller, J., Murgu, S. Programmed death-ligand 1 testing of lung cancer cytology specimens obtained with bronchoscopy. Cancer Cytopathology. 126 (2), 122-128 (2018).
- Ilie, M., Hofman, P. Reproducibility of PD-L1 assessment in non-small cell lung cancer-know your limits but never stop trying to exceed them. Translational Lung Cancer Research. 6 (Suppl 1), S51-S54 (2017).
