Summary
För att expandera laboratorier världen över förmåga att bedöma stödberättigande för patienter med lungcancer för behandling med pembrolizumab, på ett sätt som tillförlitliga och reproducerbara, utvecklade vi ett test som använder 22C 3 antikropp koncentratet på en allmänt tillgänglig immunhistokemisk autostainer, för både biopsi och cytologi exemplar.
Abstract
Pembrolizumab monoterapi har godkänts för första och andra linjens behandling av patienter med PD-L1-uttryck för avancerad icke-småcellig lungcancer (NSCLC). Test för PD-L1-uttryck med PD-L1 immunhistokemi (IHC) 22C 3 följeslagare diagnostiska analysen, vilket ger en tumör andel Poäng (TPS), har validerats på tumörvävnad. Vi utvecklat en optimerad laboratorium utvecklade test (LDT) som använder 22C 3 antikropp (Ab) koncentratet på en allmänt tillgänglig IHC autostainer för biopsi och cytologi exemplar. PD-L1 TPS utvärderades med 120 Parade hela-tumörvävnad sektioner och biopsiprover och 70 ihopkopplade biopsi och cytologi prover (bronkial tvättar, n = 40; pleural utgjutningar, n = 30). Den 22C 3 Ab koncentrat-baserade LDT visade en hög överensstämmelse mellan biopsi (~ 100%) och cytologi (~ 95%) exemplar jämfört med PD-L1 IHC uttryck bestäms med PD-L1 IHC 22C 3 följeslagare analys på båda TPS skär punkter (≥1%, ≥50%). Den optimerade LDT som presenteras här, använder 22C 3 Ab koncentratet för att bestämma de PD-L1-uttrycket i både tumörvävnad och cytologi exemplar, kommer att expandera laboratorier världen över möjlighet att bedöma huruvida patienter med NSCLC för behandling med pembrolizumab monoterapi i ett tillförlitligt och reproducerbart sätt.
Introduction
Senaste kliniska studier har visat effekt av pembrolizumab, en humaniserad monoklonal IgG4 kappa isotypen antikropp som blockerar interaktionen mellan programmerad celldöd 1 (PD-1) och dess ligander, PD-L1 och PD-L2, vid behandling av patienter med avancerad NSCLC1,2,3,4.
För närvarande är pembrolizumab godkänt för behandling av PD-L1-uttryckande NSCLC i båda behandlingsnaiva patienter med en PD-L1-uttryck TPS av ≥50% utan epidermal tillväxtfaktor (EGFR) eller Anaplastisk lymfom Kinas (ALK) genomisk tumör avvikelser3 för tidigare behandlade patienter med en PD-L1 TPS ≥1%1.
PD-L1 proteinuttryck upptäcks av IHC har använts som en Prediktiva biomarkörer test för anti-PD-1/PD-L1 terapier. I pembrolizumab kliniska prövningar bestämdes PD-L1 TPS erhålls med formalin-fast paraffin-inbäddat (FFPE) vävnadsprover med hjälp av PD-L1 IHC 22C 3 följeslagare assay5. Denna analys har godkänts av den amerikanska Food and Drug Administration (FDA) och har varit CE-märkt i Europa för att fastställa tumörens PD-L1 TPS5.
Ytterligare globala alternativ över institutioner för tillförlitlig och högkvalitativ utvärderingar av PD-L1 TPS med LDTs som använder 22C 3 antikropp koncentratet är viktigt att stödja kliniska besluten gällande patientens behörighet för pembrolizumab behandling. Ett stort antal patologi laboratorier har inte tillgång till följeslagare diagnostiska PD-L1 IHC 22C 3 analysen. Utveckling av tillförlitliga och konsekventa LDTs som är kompatibelt med ytterligare, allmänt tillgängliga IHC autostainer plattformar är därför viktig.
Dessutom finns det ett behov av att upprätta LDTs med cytologi prover som är den enda exemplar typ ofta tillgängliga från NSCLC patienter. PD-L1 IHC 22C 3 följeslagare analysen är validerad för resektioner, nålbiopsi och bronchoscopies endast om bronkoskopi ger 100 tumörceller. Även om ovanstående provtyper erhålls ofta, cytologi prover samlas in lättare och är oftast tillgängliga provtypen i vissa institutioner6,7. Det finns dock för närvarande inga validerade diagnostiska test för utvärdering av PD-L1-uttryck i cytologi prover; pålitlig LDTs kompatibel med cytologi prover skulle ytterligare underlätta högkvalitativa PD-L1 testning.
Dessutom när du upprättar klinisk validering av en LDT, bör IHC utföras på ett liknande sätt till den motsvarande kliniskt validerade kommersiella test8. Exempelvis bör flera kritiska steg kontrolleras för att erhålla samma signal i seriell sektioner såsom titrering av antikroppar, förbehandling förseningar, inkubationstiden och förstärkning system9.
Vi har nyligen utvecklat en optimerad LDT som använder 22C 3 antikropp koncentratet för att utvärdera de PD-L1-uttrycket på tumör biopsier och cytologi prover10,11. Vi hittade en hög samstämmighet med den LDT kontra den ”gyllene standarden” PD-L1 IHC 22C 3 assay10,11. Detta kliniskt validerade protokoll kommer att stödja tillförlitliga, högkvalitativa PD-L1 testning över regioner globalt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden har godkänts av den lokala etiska kommittén (mänskliga forskningsetisk kommitté, Centre Hospitalier Universitaire de Nice/Tumorothèque BB-0033-00025).
Obs: Detta protokoll justeras specifikt för användning av 22C 3 antikropp koncentratet på ett kommersiellt tillgängliga automatiserade IHC stainer (som avses som autostainer här, se Tabell för material) för tumör biopsier och cytologi prover.
1. beredning av tumör vävnadsprover
- Fixa tumörvävnad i 10% neutral buffrad formalin (NBF) i en kassett.
Obs: Tumörvävnad från proximala lungtumörer erhålls vanligtvis genom bronkoskopi, utförs under måttlig sedering av en pulmonologist eller lung specialist. För perifera lesioner och diffus lungsjukdom indikeras en transbronchial eller nål biopsi. Dessa procedurer görs oftast i kirurgi rum eller intensivvårdsavdelning. - Bädda in kassetten i paraffin.
Obs: Fixering kan uppnås genom perfusion eller nedsänkning omedelbart efter dissektion, och vanligtvis kräver 8 – 10 h. Fixativ volymen bör vara 15 – 20 x högre än volymen exemplar. Det rekommenderas inte att fixa biopsi vävnad för mer än 10 h, eftersom overfixation kan orsaka maskering av antigenet. Fixering hastigheten är ca 1 mm/h i rumstemperatur. - Infiltrera den fasta vävnadsprov med vax i vävnad processorn (se Tabell för material).
Obs: Uttorkning utförs i tre alkohol-bad med ökande koncentrationer 70%, 85% och 90%. Vatten tas slutligen bort genom tre slutliga absolut alkohol bad. Röjningen utförs i tre toluen bad och vax infiltrationen i heta vax bad (44 – 60 ° C). - Bädda in vävnaden inuti en mögel fyllas med smält paraffin (se Tabell av material) och vänta för stel.
- Avsnitt paraffin-inbäddat vävnaden vid en tjocklek av 3 μm på en mikrotom.
- Överföring menyfliken paraffin till ett positivt laddade Mikroskop glas Skjut (se Tabell för material).
- Torka i bilden för 1 h vid 37 ° C.
Obs: Förvara avsnitten vävnad vid 2 – 8 ° C (föredras) eller vid rumstemperatur upp till 25 ° C att bevara antigenicitet, och färga inom 15 d i snittning.
2. beredning av prover för cytologi
-
Samla bronkial sköljvattnet i en konserverande lösning (se tabell för material).
Obs: För detta, standard bronkoskopi teknik används.- Lavage fördelningen av de luftrör som skall provtas. Samla in tvätten i en ren behållare. Etiketten behållaren med patienten första och efternamn, födelsedatum, och preparatet källa.
- Överför de bronkial tvättar till en 50 mL konisk tub och tillsätt 2 g av DL-Ditiotreitol pulver (se Tabell för material), vortex röret i 30 min och sedan Centrifugera det 250 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 10 mL av en mucolytic lösning (se Tabell av Material).
- Skaka provet för 20 min på medellång hastighet (nivå 9) och centrifugera det 250 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten och insättning cellpelleten i samlingen rör innehållande 10% NBF.
- Tillsätt 4 droppar en cell block förberedelse reagens (se Tabell för material) till cellpelleten.
- Överföra cellpelleten till en kassett, fixa det i 10% NBF, och paraffin-bädda in det för cell block förberedelse och snittning (se steg 1,1 – 1,7).
3. PD-L1 färgning Assay
- Slå på datorn och autostainer.
- Dubbelklicka på ikonen autostainer och välj användaren.
- Klicka på 'Skapa etikett' och sedan på 'Protokoll'.
- Dubbelklicka på 22C 3 protokollet.
Obs: Protokollet installeras första gången på den autostainer's dator genom att klicka på ' skapa Protocol'. Det fullständiga protokollet tillhandahålls som kompletterande fil 1. - Skriva patientens ID på etiketten och klicka på 'Skriv ut'.
- Fast etiketten på bilden.
- Öppna lådan bild genom att trycka på knappen för den låda som har valts.
- Placera den märkta bilden på termisk pad med etiketten vänd uppåt och inåt.
- Stäng lådan slide.
- Ta bort locken från automater och ladda reagenserna på reagenserna rack.
- Öppna huven på Infärgaren och placera rack på reagenserna carrousel att göra att det passar och att de håller i position.
- Stäng huven.
- Programvaran, klicka på det instrument som ska användas och klicka på 'Kör'.
- I slutet av förfarandet IHC, skölj bilden i flera sekunder med kranvatten och en droppe av en rengöringslösning.
- Rehydrera i bilden med en bad av etanol 100% och andra bad etanol 95% i flera sekunder.
- Placera bilden i täckglasapplicering maskinen för en automatiserad lastning av täckglaset.
4. tolkning av PD-L1 färgningen
Obs: En kvalificerad patolog bör utföra tolkningen av PD-L1 IHC testet.
- Bedöma kvaliteten på PD-L1 färgningen genom att analysera de positiva och negativa kontrollerna före granskningen av patientens exemplar.
Obs: Resultaten på patientens preparat anses ogiltig om färgningen av kontroller inte är acceptabel. - Bekräfta förekomsten av minst 100 livskraftiga tumörcellerna under ett mikroskop.
Obs: Rapport när patientens exemplaret har mindre än 100 tumörceller. - Vid låg förstoring 4 X, bedöma alla välbevarade positiva och negativa tumör områden.
Obs: Vid låg förstoring, partiell membran färgning eller membran färgning av svag intensitet (1 +) kan vara svårt att känna igen. - Poäng helt eller delvis cellmembranet färgning.
Obs: Den cytoplasmisk färgning har undantas från tolkning. - Beräkna TPS genom att bedöma andelen PD-L1-positiva tumörceller i förhållande till alla tumörceller i områdena välbevarad tumör.
Obs: Endast livskraftiga tumörcellerna bör undersökas. Alla andra cellulära element, såsom immunceller, nekrotiska celler, normala celler och artefakter, måste uteslutas från prövningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använda proceduren presenteras här, och som beskrivs i detalj i gruppens senaste publikationer10,11, var den optimerade LDT kliniskt validerade med 120 arkivens FFPE NSCLC biopsiprover från patienter som genomgick kirurgiska resektion eller en biopsi vid Pasteur Universitetssjukhuset, Nice, mellan mars 2007 och mars 2016. Dessutom för utvärdering av PD-L1-uttryck av cytologi prover, TPS utvärderades i 70 Parade biopsi vävnadsprover och cell block som var beredda från bronkial tvättar (n = 40) eller pleural utgjutningar (n = 30) (samlas in på Pasteur Universitetssjukhuset, trevligt, mellan juli 2014 och November 2016). Alla bilder var färska skär och målat inom 24 timmar.
En representant färgningsmönster med biopsi prov med 22C 3 antikropp koncentratet (LDT), jämfört med PD-L1 IHC 22C 3 följeslagare analys (gold standard) visas i figur 1A och 1B. Använder en TPS ≥1%, 54/120 fall (45%) var PD-L1-positiva, medan du använder en TPS av ≥50% 29/120 fall (24%) ansågs positivt för PD-L1.
Intraklass korrelationskoefficienten (ICC) används för att mäta sambandet mellan TPS Poäng som en kontinuerlig variabel var 99% mellan LDT och guldmyntfoten. Använda både TPS skära ≥1% och ≥50%, κ poängen för interpathologist avtal var lika med 1 inom LDT-plattformen.
En representant färgningsmönster med cytologi exemplar med den 22C 3 antikroppen koncentrera sig på de LDT jämfört med PD-L1 IHC 22C 3 kit (gold standard) visas i figur 1 c och 1 D. Concordance andelen 70 par biopsi och cytologi provtagning med den LDT som använder antingen en av TPS skär pekar av ≥1% och ≥50% var större än 95% och ICC med TPS Poäng som en kontinuerlig variabel var mellan 0,88 och 0,90. Detta fynd var konsekvent mellan varje typ av cytologi prov (pleurautgjutning vs. bronkial wash) eller tumör histologi (adenocarcinom vs. skivepitelcancer) med en ICC mellan 0,82 och 0,96. När man jämför PD-L1 TPS 37 (av 70) par cytologi prover med LDT biopsi prov med gold standard, andelen concordance använder antingen på ≥1% TPS eller på ≥50% TPS skär punkt var större än 97% och ICC var mellan 0,93 och 0,95.
Figur 1: representant färgningsmönster på biopsi och cytologi exemplar med 22C 3 antikropp koncentratet (LDT), jämfört med de PD-L1 IHC 22C 3 kit (gold standard). (A) denna panel visar PD-L1 IHC 22C 3 analysen används på en tumör biopsi. (B) i denna panel visas de optimerade LDT med 22C 3 antikropp koncentratet på seriell avsnitt från samma tumör biopsi som analyseras i sidopanelen A. (C), denna panel visar PD-L1 IHC 22C 3 analysen i en cell block. (D) i denna panel visas de optimerade LDT med den 22C 3 antikroppen koncentreras seriell avsnitt från samma cell block som analyseras i panel C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har validerat en optimerad LDT använder 22C 3 PD-L1 antikropp koncentratet, genom att jämföra det med motsvarande kliniskt validerade kommersiella test10,11. Den 22C 3 koncentrerade antikroppsbaserade LDT visade en hög överensstämmelse mellan biopsi (~ 100%) och cytologi (~ 95%) exemplar jämfört med PD-L1 IHC uttrycket bestäms med PD-L1 IHC 22C 3-analys på både ≥1% TPS och ≥50% TPS skär punkter. Som nyligen rekommenderas av den internationella sammanslutningen för studie av lungcancer, områdena för PD-L1-positiva bör vara samma för ungefär 10 PD-L1-negativa prover, 10 PD-L1-positiva prover och 20 prov som täcker det linjära dynamiska omfånget av den PD-L1 IHC kliniskt validerade och testa8. Vi genomförde en valideringsstudie på 120 biopsier och 70 cytologi prover. Sammantaget var Concordancen hög, oberoende av TPS cutoff för positivitet, typ av prover eller tumör histologi. Resultaten presenteras här är överens med andra tidigare studier visar en hög concordance skattesats för både vävnad och cytologi exemplar12,13,14,15.
I denna studie, alla exemplaren var fast i 10% NBF. Vi inte utvärdera effekterna av andra fixativ, medan effekten på PD-L1 färgning av andra icke-formalin fixativ såsom alkohol-baserade fixativ är för närvarande outforskade. Förekomsten av immunceller som uttrycker PD-L1, särskilt makrofager, garanterar en försiktig tolkning av cytologi exemplar. Dessa prover måste bedömas med hänvisning till den seriella hematoxylin och eosin bild, och i vissa svåra fall, kompletterande fläckar att bedöma immunceller kan utföras för att utesluta eventuella feltolkningar av PD-L1-uttryck i tumörceller endast.
Denna studie har ett antal begränsningar, inklusive en retrospektiv analys på en enda institution, och det faktum att ingen patient behandlades med pembrolizumab att utvärdera det kliniska resultatet. Dessutom presenteras en mindre begränsning av LDT här oro granulat färgning mönstret som observerades ibland när använder amplification system, vilket kan försvåra deras tolkning. Färgning mönstret av immunceller är dessutom något mer intensiv än den som observerades med guldmyntfot. Utbildning av patologer är nödvändigt att få en korrekt tolkning av PD-L1 färgning med IHC. 16
I den kliniska inställningen måste robustheten av LDTs upprätthållas över tid genom att söka certifiering och ackreditering, följande standardrutiner och genom att regelbundet delta i externa kvalitet bedömning system8. Garantin för kliniska prediktiv prestanda kan säkerställas endast när dessa förutsättningar är fulländad8.
Protokollet presenteras här adresser kritiska behovet av PD-L1 LDTs på både biopsi och cytologi prover när analyseras på en allmänt tillgänglig autostainer över geografiska regioner som inte får vara utrustade med guldmyntfot-analys. Den LDT presenteras här, vilken var optimerad använder 22C 3 antikropp koncentratet, kan användas för att utvärdera de PD-L1-uttrycket på både biopsi och cytologi prover från patienter med NSCLC. Detta kommer att avsevärt utöka antalet laboratorier som kan erbjuda hög kvalitet PD-L1 tester för att identifiera patienter med NSCLC som är berättigade till behandling med pembrolizumab monoterapi, på ett sätt som tillförlitliga och reproducerbara.
En potentiell framtida riktning är att utvärdera möjligheten att använda andra cytologi provtyper (t.ex., prover från fin nål biopsier, bronkoskopi-guidad FNA, endobronkiala ultraljud-guidade FNA och bronkial borstar) med 22C 3 antikropp koncentrat-baserade LDTs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie var sponsrad av Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA. Finansiärerna spelade ingen roll i den studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NovaPrep HQ1 | Novacyt | NA | Preservative solution for cytology specimens |
| Novaprep® HQ+ B | Novacyt | NA | Mucolytic solution |
| Tissue-Tek VIP 6 | Sakura | 6042 VIP 6 | |
| Tissue-Tek TEC 5 Tissue Embedding Console System | Sakura | 5229 TEC 5 | |
| microscope glass slide SuperFrost Plus | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| DL-Dithiothreitol powder | Sigma-Aldrich | D3801 | |
| Heidolph Multi Reax Vortex Shaker | Thermo Fisher Scientific | 13-889-410 | |
| Shandon Cytoblock | Thermo Fisher Scientific | 7401150 | |
| 22C3 anti-PD-L1 concentrate antibody | Agilent Dako | #M365329 | |
| PD-L1 IHC 22C3 pharmDx | Agilent Dako | SK006 | |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | AS480 | |
| BenchMark ULTRA autostainer | Ventana | #750-600 | |
| OptiView HQ Universal Linker | Ventana | #760-700 | |
| OptiView HRP Multimer | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Amplification H2O2 | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplifier | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplification Multimer | Ventana | #760-100 | |
| OptiView DAB | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Copper | Ventana | #760-700 | |
| Hematoxylin II | Ventana | #790-2208 | |
| Bluing Reagent | Ventana | #760-2037 | |
| Cell Conditioning 1 (CC1) | Ventana | #950-124 | |
| Tissue-Tek Film Coverslipper | Sakura | 4742 |
References
- Garon, E. B., et al. Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 372 (21), 2018-2028 (2015).
- Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
- Reck, M., et al. Pembrolizumab versus Chemotherapy for PD-L1-Positive Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
- Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
- Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).
- Folch, E., Costa, D. B., Wright, J., VanderLaan, P. A. Lung cancer diagnosis and staging in the minimally invasive age with increasing demands for tissue analysis. Translational Lung Cancer Research. 4 (4), 392-403 (2015).
- Padmanabhan, V., et al. Improving Adequacy of Small Biopsy and Fine-Needle Aspiration Specimens for Molecular Testing by Next-Generation Sequencing in Patients With Lung Cancer: A Quality Improvement Study at Dartmouth-Hitchcock Medical Center. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 141 (3), 402-409 (2017).
- Tsao, M. S., et al. IASLC ATLAS of PD-L1 Immunohistochemistry Testing in Lung Cancer. , International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) Press. (2017).
- Thunnissen, E., de Langen, A. J., Smit, E. F. PD-L1 IHC in NSCLC with a global and methodological perspective. Lung Cancer. , 102-105 (2017).
- Ilie, M., et al. Use of the 22C3 anti-PD-L1 antibody to determine PD-L1 expression in multiple automated immunohistochemistry platforms. PLoS One. 12 (8), e0183023 (2017).
- Ilie, M., et al. Use of the 22C3 anti-programmed death ligand 1 antibody to determine programmed death ligand 1 expression in cytology samples obtained from non-small cell lung cancer patients. Cancer Cytopathology. 126 (4), 264-274 (2018).
- Skov, B. G., Skov, T. Paired Comparison of PD-L1 Expression on Cytologic and Histologic Specimens From Malignancies in the Lung Assessed With PD-L1 IHC 28-8pharmDx and PD-L1 IHC 22C3pharmDx. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 25 (7), 453-459 (2017).
- Russell-Goldman, E., Kravets, S., Dahlberg, S. E., Sholl, L. M., Vivero, M. Cytologic-histologic correlation of programmed death-ligand 1 immunohistochemistry in lung carcinomas. Cancer Cytopathology. 126 (4), 253-263 (2018).
- Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
- Stoy, S. P., Rosen, L., Mueller, J., Murgu, S. Programmed death-ligand 1 testing of lung cancer cytology specimens obtained with bronchoscopy. Cancer Cytopathology. 126 (2), 122-128 (2018).
- Ilie, M., Hofman, P. Reproducibility of PD-L1 assessment in non-small cell lung cancer-know your limits but never stop trying to exceed them. Translational Lung Cancer Research. 6 (Suppl 1), S51-S54 (2017).
