Summary
信頼性が高く、再現性のある方法で、pembrolizumab の治療のための肺癌症例の適格性を評価するために世界中の研究所の能力を展開し、我々 は広く使用可能な 22 3 抗体濃縮液を使用してアッセイを開発しました。生検と細胞診標本の免疫組織化学的オスミウム。
Abstract
Pembrolizumab 単独療法は、PD-L1-を表現する高度な非小細胞肺癌 (NSCLC) 患者の最初とセカンド ライン治療に承認されています。PD L1 式 PD L1 免疫組織染色 (IHC) 22 3 コンパニオン診断アッセイのテスト、腫瘍の割合を与えるスコア (TP)、腫瘍組織で検証済み。最適化研究室開発 (LDT) を使用するテスト 22 3 抗体 (Ab) 集中広く利用可能な IHC オスミウムの生検と細胞診標本を開発しました。PD L1 TPS 120 ペア全体腫瘍切片と生検を行ったし、70 を組み合わせて、生検や細胞診のサンプル (気管支洗浄、 n = 40; 胸水, n = 30)。22 3 は濃縮ベース LDT を示した細胞診と生検 (~ 100%) との間の一致率が高い (~ 95%) 標本両方 TPS の PD L1 IHC 22 3 コンパニオン アッセイを用いて PD L1 IHC 式と比較した場合はポイント (≥ 1%: 50%) をカットします。今回紹介した最適化された LDT 22 3 Ab 集中を使用して両方の腫瘍、細胞診、PD L1 式を決定する治療の非小細胞肺癌患者の適格性を評価するために世界中の研究所の能力を拡大します。信頼性が高く、再現性のある方法で単独で pembrolizumab。
Introduction
最近の臨床試験は、ヒト化モノクローナル IgG4 カッパ アイソタイプの抗体 (PD 1) プログラムされた細胞死 1 間の相互作用をブロックする pembrolizumab とその有機配位子、PD L1 と L2-PD 患者の治療の有効性を実証しています。高度な非小細胞肺癌1,2,3,4。
50% や上皮成長因子受容体 (EGFR) や未分化リンパ腫キナーゼ (アルク) ゲノム腫瘍異常3 の PD L1 式 TPS 両方未治療患者の PD L1 表現する非小細胞肺癌の治療のための pembrolizumab の承認現在、以前の PD L1 TPS ≥ 11の患者を治療。
IHC によって検出された PD L1 蛋白質の表現は、アンチ-PD-1/PD-L1 治療予測バイオ マーカーのアッセイとして広く使用されています。Pembrolizumab 臨床試験で、ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織サンプルで得られた PD L1 TPS は PD L1 IHC 22 3 コンパニオン試金5を使用して決定しました。この試金は米国食品医薬品局 (FDA) によって承認されているし、PD L1 TPS5腫瘍によるヨーロッパの CE-マークされています。
LDTs 22 3 抗体濃縮液を使用すると PD L1 TPS の信頼性の高い、高品質の評価のための機関間で追加のグローバル オプションが pembrolizumab の患者の適格性に関する臨床決断をサポートする重要です治療。病理学研究所の大規模な数には、コンパニオン診断 PD L1 IHC 22 3 試金へのアクセスがありません。したがって、信頼性と一貫性のある LDTs 広く利用可能な追加の IHC オスミウム プラットフォームと互換性の開発は不可欠です。
また、非小細胞肺癌患者から頻繁に利用できる唯一の検体の種類は、細胞診サンプルを使用して LDTs を確立する必要があります。気管支腫瘍細胞の 100 が得られます場合にのみ、bronchoscopies、コア針生検、切除 PD L1 IHC 22 3 コンパニオン アッセイが検証されます。上記サンプルの型が得られる頻度が細胞診サンプルより簡単に収集される、いくつかの機関6,7で最も一般的なサンプル タイプです。ただし、現在ありません検証診断アッセイ細胞診サンプルで PD L1 の式の評価に使用できます。細胞診サンプルと互換性のある信頼性の高い LDTs はさらに高品質な PD L1 テストを促進でしょう。
さらに、LDT の臨床的検証を設定した場合、IHC は対応する臨床的に検証された商業テスト8と同様の方法で実行必要があります。例えば、抗体価、溶銑予備処理の遅延、インキュベーション時間増幅システム9などシリアル セクションで同じ信号を取得するいくつかの重要な手順を検証すべき。
我々 は最近、腫瘍生検と細胞診サンプル10,11PD L1 の式を評価する 22 3 抗体濃縮液を使用する最適化された LDT を開発しました。LDT対「ゴールド スタンダード」PD L1 IHC 22 3 試金10,11と高い一致を発見しました。この臨床的に検証されたプロトコルは、信頼性の高い、高品質 PD-L1 グローバル領域でのテストをサポートします。
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Protocol
すべての手順は、倫理委員会によって承認されている (人間研究倫理委員会、センター病院ユニヴェルシテール ・ デ ・ ニース/Tumorothèque BB-0033-00025)。
メモ: このプロトコルが腫瘍生検と細胞診サンプルの調整 (オスミウムここ、材料表を見ると) 市販の自動 IHC テナーの 22 3 抗体濃縮物の使用のため特に。
1. 腫瘍組織試料作製法
- 10% 中性緩衝ホルマリン (NBF) カセットでの腫瘍組織を修正します。
注: 近位肺腫瘍から腫瘍は通常の呼吸器科、または肺専門家によって適度な鎮静下で行った気管支鏡検査によって得られます。末梢病変、びまん性肺疾患、気管支鏡や針生検が示されます。これらの手順は、手術室や集中治療室で通常行われます。 - パラフィンにカセットを埋め込みます。
注: 固定灌流または浸漬直後、解剖によって達成することができますが、通常 8-10 h を必要とします。定着性のボリュームは、検体量より高い 15-20 x をする必要があります。Overfixation を抗原のマスキングを引き起こすので、10 時間以上のための生検組織を修正する勧めしますないです。固定速度は室温で約 1 mm/h です。 - ティッシュ プロセッサにワックスで固定ティッシュ サンプルに潜入 (材料の表を参照してください)。
注: 濃度 70%、85% と 90% の増加と 3 つのアルコール風呂で脱水を行います。水は 3 つの最終絶対アルコール風呂で最終的に削除されます。クリアは 3 つのトルエン浴場やホット ワックスお風呂 (44-60 ° C) でワックス浸透で実行されます。 - 溶融パラフィンでいっぱい金型内部組織を埋め込む (材料の表を参照) と凝固を待ちます。
- ミクロトームで 3 μ m の膜厚でパラフィン埋め込まれたティッシュをセクションします。
- 転送正荷電顕微鏡ガラスにパラフィン リボン スライド (材料の表を参照してください)。
- 37 ° C で 1 時間のスライドを乾燥します。
注: 保存切片 (推奨) 2-8 ° c または室温 25 ° C まで抗原を保持し、断面の 15 d 内を汚します。
2. 細胞診用試料の調製
-
防腐剤溶液中の気管支洗浄液を収集 (材料の表を参照してください)。
メモ: これは、標準的な気管支鏡検査手法が使用されます。- 洗浄サンプリングする気管支の分布。清潔な容器に洗浄を収集します。患者とコンテナーのラベルの最初と最後の名前、生年月日、及び検体の情報。
- 気管支洗浄液を 50 mL の円錐管に転送し、DL ジチオトレイトールの 2 g を追加渦 30 分チューブ (材料の表を参照)、粉体、室温で 5 分間 250 × gで遠心分離します。
- 上澄みを除去し、粘液溶解溶液 10 mL を追加 (材料の表を参照してください)。
- 中速 (レベル 9) で 20 分間サンプルを振るし、部屋の温度で 5 分間 250 × gで遠心分離機します。
- 上澄みを除去し、細胞ペレットを 10% 含有採血管で預金 NBF。
- セル ブロックの調製試薬の 4 滴を追加 (材料の表を参照してください) 細胞ペレットにします。
- 細胞ペレットをカセットに転送、10% でそれを修正 NBF、パラフィン-埋め込むセル ブロックの準備および区分 (1.1 – 1.7 の手順を参照してください)。
3. PD L1 染色法
- オスミウムとコンピューターに切り替えます。
- オスミウムのアイコンをダブルクリックして、ユーザーを選択します。
- '作成ラベル'し、 [プロトコル]をクリックします。
- 22 3 プロトコルをダブルクリックします。
注: プロトコルは、まずコンピューターにインストール オスミウムのプロトコルを作成]をクリックしています。完全なプロトコルは、ファイル 1 の補足として提供されます。 - 患者の ID をラベルに書くし、 「印刷」をクリックします。
- スライドにラベルを貼る。
- 選択されている引き出しのボタンを押すことでスライド] ドロワーを開きます。
- サーマル パッドの上のアップと内側に直面しているラベルでラベル付きのスライドを配置します。
- スライド引き出しを閉じます。
- ディスペンサーからキャップを外し、試薬のラックに試薬を読み込みます。
- テナーのフードを開き、確実な彼らに合う位置に保持する試薬のカルーセルにラックを配置します。
- フードを閉じます。
- ソフトウェア、計測器が使用され、 「実行」をクリックするをクリックしてします。
- IHC プロシージャの終わりには、水道水と洗浄液の一滴か、数秒間スライドをすすいでください。
- エタノール 100% の 1 つの風呂、エタノール 95% の 2 番目用のスライドを数秒間水分補給します。
- Coverslipping マシン、カバーガラスの自動ローディングのためにスライドを配置します。
4. PD L1 染色の解釈
注: 修飾された病理学者は PD L1 ihc の解釈を行ってください。
- 患者の試験片の試験前に、の正と負のコントロールを分析することにより PD L1 染色の品質を評価します。
注: 患者の試料で得られた結果はコントロールの染色が受け入れられない場合は無効と見なされます。 - 腫瘍細胞を顕微鏡で 100 の最小値の存在を確認します。
注: レポートは患者の標本が 100 未満の腫瘍細胞。 - 4 X の低倍率、すべての正と負のよく保存された腫瘍領域を評価します。
注: 低倍率で部分的な膜染色または膜染色強度が弱い (1 +) がありますを認識することは困難。 - 部分的または完全な細胞膜が染色をスコアします。
注: 細胞質染色解釈から除外するとしています。 - 保存状態の良い腫瘍領域内に存在すべての腫瘍細胞に対する PD L1 肯定的な腫瘍細胞の割合を評価することによって、TP を計算します。
注: 腫瘍細胞のみを調べる必要があります。その他携帯電話の要素成果物、正常細胞や壊死細胞免疫細胞などは試験から除外する必要。
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Representative Results
このグループの最近の出版物10、11、詳細に記載されているこのトピックの手順を使用して、最適化された LDT が臨床的に手術を受けた患者から 120 のアーカイブ FFPE 非小細胞肺癌の生検サンプルと検証されました。切除やパスツール大学病院で生検 2007 年 3 月、2016 年 3 月の間、ニース。また、細胞診サンプルの PD L1 の式の評価のため、TPS は、70 対組織生検、気管支洗浄から作製したセルのブロックで評価した (n = 40) または胸水 (n = 30) (、パスツールで収集大学病院、ニース、2014 年 7 月から 11 月の 2016 年までの間)。すべてのスライドは新たに切って、24 時間以内に染色します。
生検標本 PD L1 IHC 22 3 コンパニオン アッセイ (金本位) と比較して 22 3 抗体の集中 (LDT) を使用して、図 1 aおよび1 bに示すように、パターンを染色代表。≥ 1% の TP を使用して、54/120 例 (45%), PD L1 正: 50% の TP を使用している間 29/120 例 (24%) と考えられていた肯定的な PD L1 の。
内相相関係数 (ICC) 連続変数として TPS のスコアの相関関係を測定するために使用、LDT と金本位制の 99% であった。≥ 1%: 50% のポイント両方 TPS を使用してカット、interpathologist 契約の κ スコア LDT プラットフォーム内で 1 に等しかった。
細胞診標本 22 3 抗体を用いた PD L1 IHC 22 3 キット (金本位) に比べ LDT に集中染色代表は、図 1と1 Dに表示されます。生検と細胞診検体 TPS のいずれかを使用して LDT 70 ペアの一致率は ≥ 1% のポイントを切り取って: 50% は 95%、および連続変数は 0.88 と 0.90 の間、TPS のスコアを使用して ICC より大きかった。この発見は各種細胞診サンプルの間で一貫していた (胸水vs。 気管支洗浄) や腫瘍の組織学 (腺癌vs。 扁平上皮癌) 0.82 と 0.96 ICC と。(70) のうち 37 の PD L1 TPS を比較するときは、金本位、≥ 1 %tp または: 50% カット ポイント TPS を使用して一致率と生検する LDT と細胞診サンプルのペアは 97% を超えるし、ICC は 0.93 と 0.95 の間。
図 1: 22 3 抗体の集中 (LDT) を用いた生検と細胞診標本上のパターンを汚す代表に比べ PD L1 IHC キット 22 3 (金本位).このパネル (A) 腫瘍生検上 PD L1 IHC 22 3 試金で使用を示しています。(B) このパネルはパネルAの分析と同じ腫瘍生検の結果から連続切片上 22 3 抗体濃縮を使用して最適化された LDT を示しています。(C) このパネルは、セル ブロックの PD L1 IHC 22 3 試金を示しています。(D) このパネルは、22 3 抗体を用いた最適化の LDT 集中同じセル ブロックから連続切片パネルCの分析を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
対応する臨床的に検証された商用試験10,11と比較して 22 3 PD L1 抗体濃縮を使用して最適化された LDT を検証しました。22 3 には、生検 (~ 100%) と (~ 95%) 細胞診 ≥ 1 %tps で: 50% カット ポイント TPS PD L1 IHC 22 3 アッセイを用いて PD L1 IHC 式に比べて高い一致率を示した抗体を用いた LDT が集中しています。最近肺がんの研究のための国際協会によって推奨どおり、PD L1 正例領域は約 10 PD L1 負サンプル、10 PD L1 の肯定的なサンプル、および 20 のサンプルの線形ダイナミック レンジをカバーのための同じをする必要があります、PD L1 IHC テスト、8 を臨床的に検証します。120 生検と細胞診サンプルを 70 に有効性の検証を行った。全体的にみて、コンコー ダンスが高い陽性、標本の腫瘍組織型のカットオフの TPS とは無関係。成果をここで発表は組織や細胞診標本12,13,14,の高い一致率を示す他の前の研究者に一致して、15 。
本研究ではすべての標本は 10% に固定された NBF。PD L1 はアルコール ベースの定着剤は現在探検など他の非ホルマリン定着剤の染色に及ぼす中、他の定着剤の影響評価されなかったこと。特にマクロファージ、PD L1 を発現する免疫細胞の存在は、細胞診標本の注意深い解釈を保証します。シリアル ヘマトキシリンとエオシン スライドを参照してこれらのサンプルを評価されなければならない、いくつかの困難な場合、腫瘍細胞のみで PD L1 の式の解釈を除外するため免疫細胞を評価するために相補的な汚れが行われます。
本研究は、単一施設で実際に臨床転帰を評価する pembrolizumab と扱われた患者がない回顧分析を含む、制限数を保持しています。また、LDT のマイナーな制限紹介懸念彼らの解釈をより困難にすることができる増幅システムを使用してときに時折みられる粒状の染色パターン。さらに、免疫細胞の染色パターンはややゴールド スタンダードで観察よりも強烈ではありません。病理学者の訓練は、PD L1 染色 IHC の正しい解釈を取得する必要です。16
臨床場面における LDTs の堅牢性は、認証と認定を求めて、次の標準の操作手順および外部品質評価方式8に定期的に参加することで、時間をかけて維持する必要があります。これらの前提条件が、熟練した8の場合にのみ、臨床予測パフォーマンスの保証を確保できます。
プロトコル生検と細胞診の両方のサンプル分析し広く利用可能なオスミウム、金本位アッセイが搭載されている可能性がある地理的地域にまたがるときに PD L1 LDTs の重要な必要性をアドレスここで発表。22 3 抗体濃縮液を使用して最大限に活用された、紹介、LDT は、生検と細胞診標本非小細胞肺癌患者の PD L1 の式を評価する使用できます。これは信頼性が高く、再現性のある方法で pembrolizumab 単独療法による治療の対象となる方高品質 PD-L1 非小細胞肺癌の患者を識別するためにテストを提供することができます研究所数を拡大します。
他の細胞診標本のタイプを使用しての可能性を評価するためには、潜在的な将来の方向性 (例えば、採取したフナ、気管支鏡ガイド下針生検気管支超音波ガイド下、フナと気管支ブラシ) 22 3 抗体濃縮ベース LDTs。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究は、米国ニュージャージー州ケニルワース ・株式会社メルク社によって主催されました。資金提供者は研究デザイン、データの収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備で役割を果たしていません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NovaPrep HQ1 | Novacyt | NA | Preservative solution for cytology specimens |
| Novaprep® HQ+ B | Novacyt | NA | Mucolytic solution |
| Tissue-Tek VIP 6 | Sakura | 6042 VIP 6 | |
| Tissue-Tek TEC 5 Tissue Embedding Console System | Sakura | 5229 TEC 5 | |
| microscope glass slide SuperFrost Plus | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| DL-Dithiothreitol powder | Sigma-Aldrich | D3801 | |
| Heidolph Multi Reax Vortex Shaker | Thermo Fisher Scientific | 13-889-410 | |
| Shandon Cytoblock | Thermo Fisher Scientific | 7401150 | |
| 22C3 anti-PD-L1 concentrate antibody | Agilent Dako | #M365329 | |
| PD-L1 IHC 22C3 pharmDx | Agilent Dako | SK006 | |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | AS480 | |
| BenchMark ULTRA autostainer | Ventana | #750-600 | |
| OptiView HQ Universal Linker | Ventana | #760-700 | |
| OptiView HRP Multimer | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Amplification H2O2 | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplifier | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplification Multimer | Ventana | #760-100 | |
| OptiView DAB | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Copper | Ventana | #760-700 | |
| Hematoxylin II | Ventana | #790-2208 | |
| Bluing Reagent | Ventana | #760-2037 | |
| Cell Conditioning 1 (CC1) | Ventana | #950-124 | |
| Tissue-Tek Film Coverslipper | Sakura | 4742 |
References
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