Summary
pembrolizumab के साथ उपचार के लिए फेफड़ों के कैंसर के साथ रोगियों की पात्रता का आकलन करने के लिए दुनिया भर में प्रयोगशालाओं की क्षमता का विस्तार करने के लिए, एक विश्वसनीय और reproducible तरीके से, हम एक परख है कि 22C3 एंटीबॉडी का उपयोग करता है एक व्यापक रूप से उपलब्ध पर ध्यान विकसित immunohistochemical दोनों बायोप्सी और cytology नमूनों के लिए, दाग ।
Abstract
Pembrolizumab मोनोथेरापी पीडी-L1-एक्सप्रेस उंनत गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC) के साथ रोगियों की पहली और दूसरी लाइन उपचार के लिए अनुमोदित किया गया है । पीडी-L1 immunohistochemistry (आइएचसी) 22C3 साथी नैदानिक परख, जो एक ट्यूमर अनुपात स्कोर (टीपीएस) देता है के साथ पीडी-L1 अभिव्यक्ति के लिए परीक्षण, ट्यूमर ऊतक पर मान्य किया गया है. हम एक अनुकूलित प्रयोगशाला विकसित परीक्षण (LDT) का उपयोग करता है कि 22C3 एंटीबॉडी (Ab) बायोप्सी और cytology नमूनों के लिए एक व्यापक रूप से उपलब्ध आइएचसी के दाग पर ध्यान केंद्रित । पीडी-L1 टीपीएस १२० युग्मित पूरे ट्यूमर ऊतक वर्गों और बायोप्सी नमूनों के साथ और ७० युग्मित बायोप्सी और cytology नमूनों के साथ मूल्यांकन किया गया था (दमा, n = ४०; फुफ्फुस effusions, एन = 30) । 22C3 अब ध्यान केंद्रित LDT आधारित बायोप्सी (~ १००%) और cytology (~ ९५%) नमूनों के बीच एक उच्च सामंजस्य दर दिखाया जब पीडी-L1 आइएचसी अभिव्यक्ति की तुलना में पीडी-L1 आइएचसी 22C3 साथी परख दोनों टीपीएस कट अंक (≥ 1%, ≥ ५०%) अनुकूलित LDT यहां प्रस्तुत किया, 22C3 अटल बिहारी का उपयोग कर दोनों ट्यूमर ऊतक और cytology नमूनों में पीडी-L1 अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए, दुनिया भर में प्रयोगशालाओं की क्षमता का विस्तार करने के साथ इलाज के लिए NSCLC के साथ रोगियों की पात्रता का आकलन करेंगे विश्वसनीय और reproducible तरीके से pembrolizumab मोनोथेरापी ।
Introduction
हाल के नैदानिक परीक्षणों pembrolizumab की प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया है, एक मानव मोनोक्लोनल IgG4 कापा isotype एंटीबॉडी कि ब्लॉक क्रमादेशित सेल मौत 1 के बीच बातचीत (पीडी-1) और उसके लाइगैंडों, पीडी-L1 और पीडी-L2 के साथ रोगियों के उपचार में, नत NSCLC1,2,3,4.
वर्तमान में, pembrolizumab एक पीडी-L1 अभिव्यक्ति टीपीएस ≥ ५०% और कोई एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर (EGFR) या anaplastic लिंफोमा कळेनासे (ALK) जीनोमिक ट्यूमर 3 के साथ दोनों उपचार-भोले रोगियों में पीडी-L1-व्यक्त NSCLC के उपचार के लिए मंजूरी दे दी है और ≥ 1%1के पीडी-L1 टीपीएस के साथ पहले से इलाज रोगियों के लिए.
पीडी-L1 प्रोटीन अभिव्यक्ति आइएचसी द्वारा पाया गया है व्यापक रूप से विरोधी पीडी-1/पीडी-L1 चिकित्सा के लिए एक भविष्यवाणी के रूप में मार्कर परख के रूप में इस्तेमाल किया गया है । pembrolizumab नैदानिक परीक्षणों में, पीडी-L1 टीपीएस formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड (FFPE) ऊतक नमूनों के साथ प्राप्त पीडी-L1 आइएचसी 22C3 साथी परख5का उपयोग कर निर्धारित किया गया था । यह परख अमेरिका के खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित किया गया है और CE-ट्यूमर पीडी-L1 टीपीएस5के निर्धारण के लिए यूरोप में चिह्नित किया गया है ।
LDTs जो 22C3 एंटीबॉडी ध्यान का उपयोग के साथ पीडी L1 टीपीएस के विश्वसनीय और उच्च गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए संस्थानों में अतिरिक्त वैश्विक विकल्प pembrolizumab के लिए रोगी पात्रता के बारे में किए गए नैदानिक फैसलों का समर्थन करने के लिए आवश्यक हैं उपचार. बड़ी संख्या में पैथोलॉजी प्रयोगशालाओं के पास साथी डायग्नोस्टिक पीडी-L1 आइएचसी 22C3 परख तक नहीं पहुंच पाते हैं । इसलिए, विश्वसनीय और सुसंगत LDTs के साथ संगत के विकास के अतिरिक्त, व्यापक रूप से उपलब्ध आइएचसीer प्लेटफार्मों के लिए आवश्यक है ।
इसके अलावा, वहां एक cytology नमूनों का उपयोग कर LDTs स्थापित करने की जरूरत है कि केवल नमूना प्रकार अक्सर NSCLC रोगियों से उपलब्ध हैं । पीडी-L1 आइएचसी 22C3 साथी परख लकीरें, कोर सुई बायोप्सी के लिए मान्य है, और bronchoscopies केवल अगर ब्रोंकोस्कोपी पैदावार १०० ट्यूमर कोशिकाओं. हालांकि उपरोक्त नमूना प्रकार अक्सर प्राप्त कर रहे हैं, cytology नमूने और अधिक आसानी से एकत्र कर रहे हैं और कुछ संस्थानों में सबसे अधिक उपलब्ध नमूना प्रकार हैं6,7. हालांकि, वर्तमान में कोई मान्य नैदानिक परख cytology नमूनों में पीडी-L1 अभिव्यक्ति के मूल्यांकन के लिए उपलब्ध है; cytology नमूनों के साथ संगत विश्वसनीय LDTs उच्च गुणवत्ता पीडी-L1 परीक्षण की सुविधा होगी.
इसके अलावा, जब एक LDT के नैदानिक सत्यापन की स्थापना, आइएचसी इसी तरह के एक ही रास्ते में किया जाना चाहिए नैदानिक व्यावसायिक परीक्षण8की पुष्टि की । उदाहरण के लिए, कई महत्वपूर्ण कदम ऐसे एंटीबॉडी अनुमापन के रूप में धारावाहिक वर्गों में एक ही संकेत प्राप्त करने के लिए सत्यापित किया जाना चाहिए, इलाज देरी, मशीन समय, और प्रवर्धन प्रणाली9।
हमने हाल ही में एक अनुकूलित LDT का उपयोग करता है कि 22C3 एंटीबॉडी ट्यूमर बायोप्सी और cytology नमूने पर पीडी-L1 अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए ध्यान केंद्रित10,11. हम "गोल्ड मानक" पीडी-L1 आइएचसी 22C3 परख10,11 बनाम LDT के साथ एक उच्च सामंजस्य पाया । इस नैदानिक सत्यापित प्रोटोकॉल दुनिया भर में क्षेत्रों में विश्वसनीय, उच्च गुणवत्ता पीडी-L1 परीक्षण का समर्थन करेंगे.
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Protocol
सभी प्रक्रियाओं को स्थानीय नैतिकता समिति (मानव अनुसंधान नैतिकता समिति, केंद्र Hospitalier Universitaire de Nice/Tumorothèque बीबी-0033-00025) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
नोट: यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्वचालित आइएचसी दाग पर ध्यान केंद्रित 22C3 एंटीबॉडी के उपयोग के लिए समायोजित किया गया है (यहां के रूप में दाग, सामग्री की मेजदेखें) ट्यूमर बायोप्सी और cytology नमूनों के लिए ।
1. ट्यूमर ऊतक नमूनों की तैयारी
- एक कैसेट में 10% तटस्थ बफर formalin (NBF) में ट्यूमर ऊतक फिक्स ।
नोट: समीपस्थ फेफड़े के ट्यूमर से ट्यूमर ऊतक आम तौर पर ब्रोंकोस्कोपी द्वारा प्राप्त की है, एक फुफ्फुसीय, या फेफड़े के विशेषज्ञ द्वारा उदारवादी बेहोशी के तहत प्रदर्शन किया । परिधीय घावों और फैलाना फेफड़ों की बीमारी के लिए, एक transbronchial या सुई बायोप्सी संकेत दिया है । इन प्रक्रियाओं को आमतौर पर एक शल्य चिकित्सा कक्ष या गहन देखभाल इकाई में किया जाता है । - तेल में कैसेट एंबेड ।
नोट: निर्धारण छिड़काव या विसर्जन के तुरंत बाद विच्छेदन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, और आम तौर पर 8-10 एच की आवश्यकता है । निर्धारण मात्रा 15-20x नमूना मात्रा से अधिक होना चाहिए । यह 10 से अधिक एच के लिए बायोप्सी ऊतक को ठीक करने के लिए अनुशंसित नहीं है, क्योंकि अधिक निर्धारण प्रतिजन के मास्किंग पैदा कर सकता है । निर्धारण की गति कमरे के तापमान पर लगभग 1 मिमी/ - ऊतक प्रोसेसर में मोम के साथ फिक्स्ड ऊतक नमूने घुसपैठ ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
नोट: निर्जलीकरण ७०%, ८५%, और ९०% सांद्रता बढ़ाने के साथ तीन शराब स्नान में किया जाता है । पानी अंत में तीन अंतिम निरपेक्ष शराब स्नान द्वारा निकाल दिया जाता है । समाशोधन तीन टोल्यूनि स्नान में प्रदर्शन किया है, और गर्म मोम स्नान में मोम घुसपैठ (44-60 डिग्री सेल्सियस) । - पिघला हुआ तेल से भरा मोल्ड के अंदर ऊतक एंबेड ( सामग्री की तालिकादेखें) और solidification के लिए रुको ।
- धारा एक microtome पर 3 माइक्रोन की मोटाई पर आयल एंबेडेड ऊतक ।
- एक सकारात्मक चार्ज माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड के लिए आयल रिबन स्थानांतरण ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
- ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए स्लाइड सूखी ।
नोट: antigenicity को संरक्षित करने के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस (पसंदीदा) या कमरे के तापमान पर 25 डिग्री सेल्सियस तक के टिशू सेक्शन को स्टोर करें, और सेक्शनिंग के 15 डी में दाग दें ।
2. Cytology नमूनों की तैयारी
-
एक परिरक्षक समाधान में दमा धोने लीजिए (सामग्री की तालिका देखें) ।
नोट: इस के लिए, मानक ब्रोंकोस्कोपी तकनीक का प्रयोग किया जाता है ।- लेवेज का वितरण कर श्वसनी का नमूना लिया जाए । एक साफ कंटेनर में धो लीजिए । रोगी के प्रथम और अंतिम नाम, जंम तिथि, और नमूना स्रोत के साथ कंटेनर लेबल ।
- एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए और 2 जी के डीएल-Dithiothreitol पाउडर ( सामग्री की तालिकादेखें), भंवर ट्यूब 30 मिनट के लिए, और फिर यह कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए २५० x g पर यह केंद्रापसारक में जोड़ें ।
- supernatant निकालें और एक mucolytic समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
- मध्यम गति (9 स्तर) में 20 मिनट के लिए नमूना शेक और यह २५० x जी पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
- supernatant निकालें और 10% NBF युक्त संग्रह ट्यूबों में सेल गोली जमा ।
- सेल गोली करने के लिए एक सेल ब्लॉक तैयारी रिएजेंट ( सामग्री की तालिकादेखें) के 4 बूंदें जोड़ें ।
- एक कैसेट के लिए सेल गोली स्थानांतरण, यह 10% NBF में ठीक है, और आयल-यह सेल ब्लॉक तैयारी और अनुभाग के लिए एंबेड (कदम 1.1-1.7 देखें) ।
3. पीडी-L1 धुंधला परख
- फिर से दाग और कंप्यूटर पर स्विच करें ।
- डबल-दाग आइकन पर क्लिक करें और उपयोगकर्ता चुनें ।
- ' लेबल बनाएं ' पर क्लिक करें और फिर ' प्रोटोकॉल' पर ।
- 22C3 प्रोटोकॉल पर डबल-क्लिक करें ।
नोट: प्रोटोकॉल पहले ' प्रोटोकॉल बनाएं 'पर क्लिक करके ' दाग ' कंप्यूटर पर स्थापित है । पूर्ण प्रोटोकॉल अनुपूरक फ़ाइल 1के रूप में प्रदान की जाती है । - लेबल पर मरीज की आईडी लिखें और ' प्रिंट 'पर क्लिक करें ।
- स्लाइड पर लेबल चिपकाएं ।
- चुना गया है कि दराज के बटन पर दबाकर स्लाइड दराज खोलें.
- लेबल की गई स्लाइड को थर्मल पैड पर ऊपर-नीचे की ओर और ऊपर की तरफ रखें ।
- स्लाइड दराज बंद करें ।
- मशीन से टोपियां निकालें और रिएजेंटों रैक पर रिएजेंट लोड ।
- दाग के हुड खोलें और रिएजेंट ' हिंडोला पर रैक जगह यकीन है कि वे फिट और स्थिति में पकड़ बना ।
- डाकू बंद करो ।
- सॉफ्टवेयर पर, उपकरण है कि इस्तेमाल किया जाएगा पर क्लिक करें और ' पर क्लिक ' चल रहाहै ।
- आइएचसी प्रक्रिया के अंत में, नल का पानी और एक सफाई समाधान की एक बूंद के साथ कई सेकंड के लिए स्लाइड कुल्ला ।
- इथेनॉल के एक स्नान के साथ स्लाइड rehydrat १००% और कई सेकंड के लिए ९५% इथेनॉल के एक दूसरे स्नान ।
- coverslip के एक स्वचालित लदान के लिए coverslipping मशीन में स्लाइड प्लेस ।
4. पीडी-L1 धुंधला की व्याख्या
नोट: एक योग्य पैथोलॉजिस्ट पीडी-L1 आइएचसी परीक्षण की व्याख्या प्रदर्शन करना चाहिए ।
- रोगी के नमूने की परीक्षा से पहले सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का विश्लेषण करके पीडी-L1 धुंधला की गुणवत्ता का आकलन करें ।
नोट: नियंत्रण के दाग स्वीकार्य नहीं है, तो रोगी के नमूने पर प्राप्त परिणाम अमान्य माना जाता है. - एक खुर्दबीन के नीचे १०० व्यवहार्य ट्यूमर कोशिकाओं की एक ंयूनतम की उपस्थिति की पुष्टि करें ।
नोट: रिपोर्ट जब रोगी के नमूने से कम १०० ट्यूमर कोशिकाओं है । - 4x की एक कम आवर्धन पर, सभी अच्छी तरह से संरक्षित सकारात्मक और नकारात्मक ट्यूमर क्षेत्रों का मूल्यांकन करें ।
नोट: कम इज़ाफ़ा, आंशिक झिल्ली धुंधला या कमजोर तीव्रता (1 +) के धुंधला झिल्ली को पहचानने के लिए मुश्किल हो सकता है । - आंशिक या पूरा सेल झिल्ली धुंधला स्कोर ।
नोट: cytoplasmic धुंधला करने के लिए व्याख्या से बाहर रखा जाना है । - अच्छी तरह से संरक्षित ट्यूमर क्षेत्रों में मौजूद सभी ट्यूमर कोशिकाओं के सापेक्ष पीडी-L1 सकारात्मक ट्यूमर कोशिकाओं के अनुपात का आकलन करके टीपीएस की गणना ।
नोट: केवल व्यवहार्य ट्यूमर कोशिकाओं की जांच की जानी चाहिए । अन्य सभी सेलुलर तत्वों, जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं, गल कोशिकाओं, सामान्य कोशिकाओं, और कलाकृतियों, परीक्षा से बाहर रखा जाना है ।
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Representative Results
यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करना है, और के रूप में इस समूह के हाल के प्रकाशनों10,11में विस्तार से वर्णित है, अनुकूलित LDT चिकित्सकीय १२० अभिलेखीय FFPE के साथ मांय था NSCLC रोगियों को जो शल्य चिकित्सा से बायोप्सी नमूने लकीर या पाश्चर विश्वविद्यालय अस्पताल में एक बायोप्सी, अच्छा, मार्च के बीच २००७ और मार्च २०१६ । इसके अलावा, cytology नमूनों के पीडी-L1 अभिव्यक्ति के मूल्यांकन के लिए, टीपीएस ७० युग्मित ऊतक बायोप्सी नमूनों में मूल्यांकन किया गया था और कि दमा बहाकर (n = ४०) या फुफ्फुस effusions (n = 30) (पाश्चर पर एकत्र) से तैयार किए गए सेल ब्लॉकों विश्वविद्यालय अस्पताल, अच्छा, के बीच २०१४ जुलाई और २०१६ नवंबर) । सभी स्लाइड में 24 घंटे के अंदर फ्रेश कट और दाग लगे थे ।
22C3 एंटीबॉडी ध्यान (LDT) का उपयोग कर बायोप्सी नमूनों के साथ एक प्रतिनिधि धुंधला पैटर्न, पीडी-L1 आइएचसी 22C3 साथी परख (सोने के मानक) के साथ तुलना में चित्र 1a और 1bमें दिखाया गया है । ≥ 1% के टीपीएस का उपयोग करके, 54/120 मामलों (४५%) पीडी-L1 सकारात्मक थे, ≥ ५०% की एक टीपीएस का उपयोग करते हुए, 29/120 मामलों (24%) पीडी-L1 के लिए सकारात्मक माना जाता था.
intraclass सहसंबंध गुणांक (आईसीसी) एक सतत चर के रूप में टीपीएस स्कोर के सहसंबंध को मापने के लिए इस्तेमाल किया LDT और सोने के मानक के बीच ९९% था । ≥ 1% और ≥ ५०% के टीपीएस कट अंक का उपयोग करना, LDT के मंच के भीतर एक κ के लिए स्कोर 1 के बराबर थे ।
एक प्रतिनिधि cytology नमूने के साथ पैटर्न धुंधला 22C3 एंटीबॉडी पीडी के साथ तुलना में LDT पर ध्यान केंद्रित-L1 आइएचसी 22C3 किट (स्वर्ण मानक) चित्रा 1C और 1 डीमें दिखाया गया है । ≥ 1% और ≥ ५०% के टीपीएस कट अंक में से एक का उपयोग कर LDT के साथ बायोप्सी और cytology नमूनों के ७० जोड़े की सामंजस्य दर ९५% से अधिक था, और एक सतत चर के रूप में टीपीएस स्कोर का उपयोग कर आईसीसी ०.८८ और ०.९० के बीच था. यह खोज cytology नमूना (फुफ्फुस बहाव बनामदमा धोने) या ट्यूमर प्रोटोकॉल (ग्रंथिकर्कटता बनामस्क्वैमस सेल कार्सिनोमा) के प्रत्येक प्रकार के पार के अनुरूप था ०.८२ और ०.९६ के बीच एक आईसीसी के साथ । जब ३७ के पीडी-L1 टीपीएस की तुलना (७० से बाहर) cytology नमूनों के जोड़े सोने के मानक के साथ बायोप्सी नमूनों को LDT के साथ, या तो ≥ 1% टीपीएस या ≥ ५०% टीपीएस कटौती बिंदु का उपयोग कर सामंजस्य दर ९७% से अधिक था और आईसीसी ०.९३ और ०.९५ के बीच था ।
चित्रा 1: प्रतिनिधि बायोप्सी और cytology 22C3 एंटीबॉडी ध्यान केंद्रित (LDT) का उपयोग कर नमूनों पर पैटर्न धुंधला, पीडी-L1 आइएचसी 22C3 किट (स्वर्ण मानक) के साथ तुलना में. (क) इस पैनल के पीडी-L1 आइएचसी 22C3 एक ट्यूमर बायोप्सी पर इस्तेमाल किया परख दिखाता है । (ख) इस पैनल के अनुकूलित LDT का उपयोग 22C3 एंटीबॉडी एक ही ट्यूमर बायोप्सी से धारावाहिक वर्गों पर ध्यान केंद्रित के रूप में पैनल एमें विश्लेषण से पता चलता है । (ग) यह पैनल किसी कोशिका खंड में पीडी-L1 आइएचसी 22C3 परख दिखाता है. (घ) इस पैनल से पता चलता है अनुकूलित LDT का उपयोग कर 22C3 एंटीबॉडी एक ही सेल ब्लॉक से धारावाहिक वर्गों पर ध्यान केंद्रित के रूप में पैनल सीमें विश्लेषण किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
हम एक अनुकूलित LDT 22C3 पीडी-L1 एंटीबॉडी ध्यान केंद्रित का उपयोग कर, यह इसी के साथ तुलना द्वारा चिकित्सकीय सत्यापित वाणिज्यिक परीक्षण10,11। 22C3 केंद्रित एंटीबॉडी आधारित LDT बायोप्सी (~ १००%) और cytology (~ ९५%) नमूनों के बीच एक उच्च सामंजस्य दर दिखाया जब पीडी-L1 आइएचसी अभिव्यक्ति की तुलना में पीडी-L1 आइएचसी 22C3 परख का उपयोग दोनों ≥ 1% टीपीएस और ≥ ५०% टीपीएस कट अंक में निर्धारित किया है । के रूप में हाल ही में फेफड़ों के कैंसर के अध्ययन के लिए इंटरनेशनल एसोसिएशन द्वारा सिफारिश की, पीडी-L1 सकारात्मक क्षेत्रों लगभग 10 पीडी-L1 नकारात्मक नमूने, 10 पीडी-L1 सकारात्मक नमूने, और के रैखिक गतिशील रेंज को कवर 20 नमूनों के लिए ही होना चाहिए नैदानिक पुष्टि पीडी-L1 आइएचसी परीक्षण8. हम १२० बायोप्सी और ७० cytology नमूनों पर एक मांयता अध्ययन किया । कुल मिलाकर, सामंजस्य उच्च था, सकारात्मकता के लिए टीपीएस कटऑफ के स्वतंत्र रूप से, नमूनों के प्रकार, या ट्यूमर प्रोटोकॉल. यहां प्रस्तुत निष्कर्षों के अंय पिछले दोनों ऊतक और cytology नमूनों12,13,14, 15 के लिए एक उच्च सामंजस्य दर दिखा अध्ययन के उन लोगों के साथ समझौते में हैं।
इस अध् ययन में सभी नमूनों को 10% NBF में तय किया गया । हमने अन्य fixatives के प्रभाव का मूल्यांकन नहीं किया, जबकि अन्य गैर-formalin fixatives जैसे अल्कोहल आधारित fixatives का पीडी-L1 धुंधला होने पर प्रभाव वर्तमान में बेरोज़गारी है. पीडी-L1, विशेष रूप से मैक्रोफेज को व्यक्त प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उपस्थिति, cytology नमूनों की एक सावधान व्याख्या वारंट । इन नमूनों धारावाहिक hematoxylin और eosin स्लाइड के संदर्भ के साथ मूल्यांकन किया जाना चाहिए, और, कुछ कठिन मामलों में, प्रतिरक्षा कोशिकाओं का आकलन करने के लिए पूरक दाग केवल ट्यूमर कोशिकाओं में पीडी-L1 अभिव्यक्ति के किसी भी गलत व्याख्या को बाहर करने के लिए किया जा सकता है.
इस अध्ययन के एक एकल संस्थान में एक पूर्वव्यापी विश्लेषण सहित सीमाओं के एक नंबर, रखती है, और तथ्य यह है कि कोई रोगी pembrolizumab के साथ इलाज के लिए नैदानिक परिणाम का मूल्यांकन किया गया । इसके अलावा, LDT की एक छोटी सी सीमा यहां प्रस्तुत की चिंता दानेदार धुंधला पैटर्न है कि जब प्रवर्धन प्रणाली है, जो उनकी व्याख्या कर सकते है और अधिक मुश्किल का उपयोग करते समय कभी देखा था । इसके अलावा, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के धुंधला पैटर्न कुछ अधिक है कि सोने के मानक के साथ मनाया से अधिक तीव्र है । आइएचसी के साथ पीडी-L1 धुंधला की सही व्याख्या प्राप्त करने के लिए पैथोलॉजिस्ट का प्रशिक्षण आवश्यक है । 16
नैदानिक सेटिंग में, LDTs की मजबूती की जरूरत है प्रमाणीकरण और प्रत्यायन की मांग के द्वारा समय पर बनाए रखा, मानक संचालन प्रक्रियाओं का पालन करके, और नियमित रूप से बाह्य गुणवत्ता मूल्यांकन योजनाओं में भाग लेने के द्वारा8। नैदानिक पूर्वानुमान प्रदर्शन की गारंटी केवल जब इन आवश्यकताओं को पूरा कर रहे है8सुनिश्चित किया जा सकता है ।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल दोनों बायोप्सी और cytology नमूनों पर पीडी-L1 LDTs के लिए महत्वपूर्ण जरूरत पते जब भौगोलिक क्षेत्रों है कि सोने के मानक परख से सुसज्जित नहीं हो सकता है भर में एक व्यापक रूप से उपलब्ध दाग पर विश्लेषण किया । LDT यहाँ प्रस्तुत है, जो 22C3 एंटीबॉडी ध्यान केंद्रित का उपयोग कर अनुकूलित किया गया था, cytology रोगियों से दोनों बायोप्सी और NSCLC नमूने पर पीडी-L1 अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता. इससे उन प्रयोगशालाओं की संख्या का विस्तार होगा जो pembrolizumab मोनोथेरापी के साथ उपचार के लिए पात्र NSCLC वाले रोगियों की पहचान करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले पीडी-L1 परीक्षण की पेशकश कर सकते हैं, जो एक विश्वसनीय और reproducible तरीके से ।
एक संभावित भविष्य की दिशा के लिए अंय cytology नमूना प्रकार का उपयोग करने की व्यवहार्यता का आकलन है (जैसे, ठीक सुई बायोप्सी, ब्रोंकोस्कोपी-निर्देशित FNA, endobronchial अल्ट्रासाउंड निर्देशित FNA, और दमा ब्रश से नमूनों) 22C3 एंटीबॉडी के साथ ध्यान केंद्रित LDTs आधारित है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस अध्ययन के मर्क एंड कं, इंक, केनिलवर्थ, ंयू जर्सी, संयुक्त राज्य अमेरिका द्वारा प्रायोजित किया गया था । funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका निभाई ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NovaPrep HQ1 | Novacyt | NA | Preservative solution for cytology specimens |
| Novaprep® HQ+ B | Novacyt | NA | Mucolytic solution |
| Tissue-Tek VIP 6 | Sakura | 6042 VIP 6 | |
| Tissue-Tek TEC 5 Tissue Embedding Console System | Sakura | 5229 TEC 5 | |
| microscope glass slide SuperFrost Plus | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| DL-Dithiothreitol powder | Sigma-Aldrich | D3801 | |
| Heidolph Multi Reax Vortex Shaker | Thermo Fisher Scientific | 13-889-410 | |
| Shandon Cytoblock | Thermo Fisher Scientific | 7401150 | |
| 22C3 anti-PD-L1 concentrate antibody | Agilent Dako | #M365329 | |
| PD-L1 IHC 22C3 pharmDx | Agilent Dako | SK006 | |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | AS480 | |
| BenchMark ULTRA autostainer | Ventana | #750-600 | |
| OptiView HQ Universal Linker | Ventana | #760-700 | |
| OptiView HRP Multimer | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Amplification H2O2 | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplifier | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Amplification Multimer | Ventana | #760-100 | |
| OptiView DAB | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Copper | Ventana | #760-700 | |
| Hematoxylin II | Ventana | #790-2208 | |
| Bluing Reagent | Ventana | #760-2037 | |
| Cell Conditioning 1 (CC1) | Ventana | #950-124 | |
| Tissue-Tek Film Coverslipper | Sakura | 4742 |
References
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