Summary
Vi beskriver protokoller for å forberede oocyster og rense sporozoitter for å studere smitte av menneskelige intestinal og luftveier organoids av Cryptosporidium parvum. Vi viser prosedyrene for microinjection av parasitter i intestinal organoid lumen og immunostaining av organoids. Til slutt beskriver vi isolering av genererte oocyster fra organoids.
Abstract
Cryptosporidium parvum er en av de viktigste årsakene til menneskelig diaré sykdom. For å forstå patologi av parasitten og utvikle effektive legemidler, en in vitro kultur system som viser forholdene i verten er nødvendig. Organoids, som ligner vevet i deres opprinnelse, er ideelle for å studere Host-parasitt interaksjoner. Organoids er tredimensjonale (3D) vev-avledet strukturer som er avledet fra voksne stamceller og vokse i kultur i lengre perioder uten gjennomgår noen genetisk aberrasjon eller transformasjon. De har godt definert polaritet med både apikale og basolateral overflater. Organoids har ulike anvendelser i narkotika testing, bio Banking, og sykdoms modellering og Host-mikrobe interaksjonsstudier. Her presenterer vi en steg-for-steg protokoll for hvordan å forberede oocyster og sporozoitter av Cryptosporidium for infeksjon Human intestinal og luftveiene organoids. Deretter viser vi hvordan microinjection kan brukes til å injisere mikrober i organoid lumen. Det er tre store metoder som organoids kan brukes til mikrobe interaksjonsstudier-microinjection, mekanisk klipping og plating, og ved å gjøre monolagere. Microinjection muliggjør vedlikehold av 3D-strukturen og muliggjør presis kontroll av parasitt volumer og direkte apikale side kontakt for mikrober. Vi gir detaljer for optimal vekst av organoids for enten avbildning eller oocyst produksjon. Til slutt viser vi også hvordan de nylig genererte oocyster kan isoleres fra organoid for videre nedstrøms prosessering og analyse.
Introduction
Utvikling av medikamenter eller vaksiner for behandling og forebygging av Cryptosporidium -smitte har blitt hindret av mangelen på in vitro-systemer som nettopp etterligner in vivo-situasjonen hos mennesker1,2. Mange av de tilgjengelige systemer enten bare tillate kortvarig infeksjon (< 5 dager) eller ikke støtter den komplette livssyklusen av parasitten3,4. Andre systemer som muliggjør fullstendig utvikling av parasitten er basert på udødeliggjort cellelinjer eller kreftcelle linjer som ikke trofast recapitulate den fysiologiske situasjonen hos mennesker5,6,7 . Organoids eller "mini-organer" er 3D vev avledet strukturer som dyrkes i en ekstracellulære matrise supplert med ulike vev spesifikke vekstfaktorer. Organoids har blitt utviklet fra ulike organer og vev. De er genetisk stabile og recapitulate de fleste funksjoner av organene av deres opprinnelse, og kan opprettholdes i kultur i lengre perioder av gangen. Vi har utviklet en metode for å infisere menneskelige intestinal og lunge organoids med Cryptosporidium som gir en nøyaktig in vitro modell for studiet av Host-parasitt interaksjoner relevant for intestinal og respiratoriske cryptosporidiose8 ,9,10,11,12,13. I motsetning til andre publiserte kultur modeller, organoid systemet er representativt for virkelige liv vert parasitt interaksjoner, gir mulighet for fullføring av livssyklusen slik at alle stadier av parasitten livssyklus kan bli studert, og opprettholder parasitten forplantning i opptil 28 dager10.
Cryptosporidium parvum er en apicomplexan parasitt som infiserer epitel i luftveiene og tarm trakter, forårsaker langvarig diaré sykdom. Den resistente miljø scenen er oocyst, funnet i forurenset mat og vann14. Når svelget eller inhalert, oocyst excysts og utgivelser fire sporozoitter som fester til epitelceller. Sporozoitter glir på vertene celler og engasjere vert celle reseptorer, men parasitten ikke fullt ut invadere cellen, og ser ut til å indusere verten cellen til sluker det15. Parasitten, som er internalisert innenfor en intracellulære men extracytoplasmic kupé, forblir på den apikale overflaten av cellen, replikere i en parasitophorous vacuole. Den gjennomgår to runder med aseksuell reproduksjon – en prosess som kalles merogony. I løpet av merogony, type jeg meronts utvikle hvilke inneholde åtte merozoitter det er befridd å invadere ny celler. Disse merozoitter invadere nye celler for å utvikle seg til type II meronts inneholder fire merozoitter. Disse merozoitter, når den slippes, infisere celler og utvikle seg til macrogamonts og microgamonts. Microgametes utgis og gjødsle macrogametes som produserer zygotes som modnes til oocyster. Eldre oocyster blir senere sluppet inn i lumen. Oocyster er enten tynne vegger som umiddelbart excyst å reinfect epitel, eller tykke vegger som slippes ut i miljøet for å infisere den neste verten14. Alle stadier av Cryptosporidium livssyklus har blitt identifisert i det organoid kultur systemet som tidligere er utviklet av vår gruppe10.
Siden menneskelige organoids trofast gjenskape menneskelige vev9,11,13, og støtter alle replicative stadier av Cryptosporidium10, de er den ideelle vev kultur system for å studere Cryptosporidium biologi og Host-parasitt interaksjoner. Her beskriver vi prosedyrene for å infisere organoids med både Cryptosporidium oocyster og excysted sporozoitter, og isolere den nye oocyster produsert i dette vevet kultur system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All vevs håndtering og reseksjon ble utført under institusjons gjennomgang Board (IRB) godkjente protokoller med pasient samtykke.
1. utarbeidelse av C. parvum Oocyster for injeksjon
Merk: Cryptosporidium oocyster ble kjøpt fra en kommersiell kilde (se tabell over materialer). Disse oocyster er produsert i kalver og er lagret i fosfat-bufret saltvann (PBS) med antibiotika. De kan oppbevares i ca 3 måneder ved 4 ° c og bør aldri fryses. Vi bruker vanligvis oocyster innen en måned. Organoids kan være smittet med enten intakt oocyster, eller sporozoitter kan isoleres fra excysted oocyster og brukes til å infisere Organoids hvis det er viktig å ikke ha oocyster carryover fra den opprinnelige inokulum.
-
Klargjør Cryptosporidium oocyster for å infisere celler (figur 1a).
- Hold oocyster på isen gjennom alle manipulasjoner til de legges til organoids.
- Beregn antall oocyster som trengs for en full seks-brønn plate av organoids (vanligvis ca 5 x 105-2,5 x 105 for platen). Tell antall oocyster i en hemocytometer for å verifisere antallet og overføre til et sentrifugerør.
Merk: For å hjelpe til med visualisering, kan oocyster blandes 1:1 med et oocyst-spesifikt fluorescerende antistoff (se tabell over materialer) før de lastes inn på hemocytometer. Fluoroforen-merket oocyster kan deretter lett visualisere og nummerert ved hjelp av et fluorescens mikroskop. Vi foreslår at du injiserer ca. 100 – 1000 oocyster/organoid. Generelt, 1000-2000 organoids kan dyrkes i en seks-brønn plate. - Ta med volumet på oocyster fjæring opptil 900 μL med PBS. Tilsett 100 μL av natrium natriumhypokloritt (f.eks. Clorox) blekemiddel (ved 4 ° c). Ruge for 10 min på isen.
- Sentrifuger for 3 min i en mikrosentrifugen ved 8 000 x g ved 4 ° c. Orientere rørene i sentrifuger med hetten åpningen vendt innover. Pellet kan være vanskelig å se så vite hvor parasitter har pelleted i røret er viktig.
- Fjern supernatanten med en pipette være forsiktig for å unngå pellet. Tilsett 1 mL Dulbecco er modifisert Eagle ' s medium (DMEM) og Vortex å blande.
- Sentrifuger for 3 min i en mikrosentrifugen ved 8 000 x g ved 4 ° c.
- Gjenta vask med DMEM to ganger.
- Forbered Utvidelses medium (OME) eller differensiering organoid medium (OMD) som taurocholate er lagt til en endelig konsentrasjon på 0,5% (w/v) (se tabell av materialer). Taurocholate bør alltid være forberedt og lagt frisk.
Merk: Vi har med hell brukt 0,5% taurocholate i vår infeksjon analyser hvor inokulum er intakt oocyster, og så forbedret utbredelsen av smitte uten skadelige effekter på verten cellene. Taurocholate kan imidlertid ha uventede effekter på celler, og lavere konsentrasjoner har blitt brukt med hell i infeksjon analyser16. - Resuspend oocyster i 100 μL av organoid kultur medium supplert med 0,5% (w/v) natrium taurocholate. Tell oocyster igjen som beskrevet i trinn 1.1.2.
- Legg fast Green fargestoff til suspensjonen for å visualisere injeksjon.
- Fyll mikro-loader tips (se tabellen av materialer) med oocyst suspensjon og bruke den til å fylle trukket blodkar.
Forsiktig: Hele prosedyren bør gjøres i en vev kultur hette med nivå-2 sikkerhetsprotokoller. Bruk av masker anbefales som Cryptosporidium oocyster kan også være smittsomme når luftbårne.
2. in vitro rensing av Sporozoitter fra C. parvum oocyster
-
Rens sporozoitter fra C. parvum oocyster etter bleking og vask av blekemiddel som beskrevet ovenfor.
- Overfør oocyster til et 15 mL rør. Resuspend oocyster i romtemperatur excystation medium (0,75% w/v natrium taurocholate i DMEM) for å få 1 x 107 Oocyster/ml. Tillegg av taurocholate forbedrer excystation rate av oocyster, forbedre sporozoite yield.
- Ruge oocyst suspensjon ved 37 ° c for 1 – 1.5 h.
- Kontroller prøve mikroskopisk for omfanget av excystation; 60 – 80% excystation er rimelig for god utvinning av sporozoitter. Hvis nivået av excystation er lavt, ruge lenger (ytterligere 30 min til 1 time).
- Bestem prosent excystation i forhold til antall Start oocyster. Excystation beregnes som:
% excystation = [1 – (antall intakte oocyster/antall oocyster ved start)] x 100 - Vask celler for å fjerne excystation reagenser ved å legge til 14 mL PBS eller medium, miksing, og utvinne celler (intakt oocyster, oocyst skjell, og sporozoitter) av sentrifugering ved 3 400 x g for 20 min for å gjenopprette sporozoitter. Aspirer nøye for å unngå å miste celler.
- Resuspend sporozoite pellet i 1 – 2 mL DMEM for å få 3 x 107 Oocyster/ml (basert på antall Start oocyster).
- For å fjerne gjenværende oocyster og skjell, Filtrer fjæringen gjennom et 3 μm-filter (figur 1B). Bruk en 47 mm filter holder apparat utstyrt med polykarbonat filter (3 μm pore størrelse) festet til en 10 mL sprøyte fat. Plasser filter holde ren på toppen av et 15 mL rør. Plasser forsamlingen i en is bøtte eller i kaldt rom.
- Tilsett 7,5 mL av sporozoite suspensjon til filteret forsamlingen og tillate å filtrere gjennom av tyngdekraften. Vask gjennom med en annen 7,5 mL DMEM.
Merk: For å sikre suksess i sporozoite isolasjon frisk oocyster og gode excystation er kritiske. Hvis det er for mange unexcysted oocyster, vil suspensjonen ikke flyte gjennom av tyngdekraften. Påføring av trykk på sprøyten kan tvinge unexcysted oocyster gjennom. Microinjection av sporozoitter er mer utfordrende enn for oocyster fordi sporozoitter kan klump og blokkere kapillær. For å unngå dette anbefaler vi å lage en bredere kapillær spiss når du injiserer organoids med sporozoitter. For å oppnå tilstrekkelige nivåer av smitte, 2-4 ganger antall sporozoitter må injiseres i hver organoid i forhold til organoids smittet med oocyster. - Sentrifuger den filtrerte sporozoite suspensjonen på 3 400 x g ved hjelp av en svingende bøtte rotor for 20 min til pellets sporozoitter.
- Resuspend i 50 – 100 μL av OME eller OMD organoid kultur medium (se tabell over materialer) supplert med 0,05% (w/v) fast Green fargestoff og L-glutation, Betaine, L-cystein, linolsyre syre og taurin-inneholdende redusere buffer5 (se Tabell med materialer).
Merk: Incubating oocyster for lenge kan resultere i lyse av sporozoitter og dårlig utvinning og derfor bør unngås.
3. in vitro kultur for Human intestinal og lunge Organoids for Microinjection
- Kultur intestinal organoids under ekspansjon og differensiering medie forhold.
Merk:Detaljene i intestinal og lunge organoid forplantning har tidligere vært beskrevet i andre artikler8,13(seTabell av materialerfor Media oppskrifter). Her beskriver vi kort den organoid kultur metoden med spesifikk henvisning til optimalisering forCryptosporidiuminjeksjon og vekst. Vi har funnet at for Imaging av parasitter i organoids, organoids vokst i ekspansjon medium er å foretrekke for de i dyrket differensiering Media som det er mindre rusk akkumulering enn det sett i organoids vokst i differensiering medium. Men hvis målet er å isolere oocyster, organoids vokst i differensiering Media produserer langt høyere antall oocyster.- Oppretthold organoids i 3D-kulturer i ekstracellulære matrise (se tabell over materialer) ved 37 ° c. Legg OME (ekspansjon Media) på toppen og oppdatere hver dag.
Merk: For lunge organoids, har vi ikke egen ekspansjon og differensiering Media. - Å splitte og plate organoids for microinjection, fjerne medier fra 6-brønn plate som inneholder menneskelige organoids og legge F12 + + + (se tabell over materialer) til brønnen og bryte opp matrisen ved pipettering med en 1 ml pipette spissen flere ganger. Samle celler i en 15 mL Tube (2 mL F12 + + + per tube er nok for videre prosedyrer).
- Tilsett 10 – 12 mL av F12 + + + i et annet 15 mL rør og Plasser en brann-polert glass Pipet inn i mediet, pipette opp og ned 3 ganger for å bryte opp den menneskelige intestinal og lunge organoids.
Merk: Bruk en lang glass Pipet (20-30 cm) og brann-polish det kort. Ikke gjør åpningen (1 mm diameter) svært liten fordi organoids kan skades. Gjør spissen av Pipet glatt ved kort brann-polering det. Break organoids i mindre biter av ~ 50 μm. Lung organoids har en tykkere ytre membran og krever derfor sterkere klipping med glass pipette i forhold til intestinal organoids. Videre har de en langsommere vekstrate enn intestinal organoids (opp til 14 dager mellom hver passaging). - Legg til F12 + + + opptil 5 – 7 mL og sentrifuger ved 350 x g i 5 min.
Merk: Sentrifugering hastighet i dette trinnet er høyere enn normalt for å gjøre en god celle pellet som er godt adskilt fra ekstracellulære matrise (se tabellen av materialer). Vi har observert at i forhold til musen tynntarmen organoids, humant tynntarmen organoids er vanskeligere å forstyrre. - Fjern så mye medium som mulig uten å forstyrre cellene, deretter resuspend pellet med matrise opprettholdes ved 4 ° c; 200 – 300 μL av matrise per brønn av en seks-brønn plate er nødvendig. Organoids bør deles en i tre for å opprettholde en ganske høy celle tetthet.
- Plate organoids i matrisen dråper på ca 5 – 10 μL hver i brønnen av en seks-brønn plate. Ruge for 20 – 30 min ved 37 ° c og legg deretter til Utvidelses medium (OME) øverst.
- Endre mediet hver 2 – 3 dager.
Merk: I ca 5 – 7 dager, organoids vokser i EM nå en størrelse på 100-200 μm og er klar for injeksjon. - For å differensiere organoids, etter 5 – 6 dager i EM, endre Media til differensiering Media (DM) forhold og holde for 5-6 ekstra dager før injisere parasitter.
Merk: For utvidelse av organoids, anbefales det å tallerken organoids tett. For microinjection er bruk av en seks-brønn plate anbefalt med organoids belagt ved en mindre tetthet. For eksempel, plate organoids fra tre brønner av en seks-brønn plate i en full seks-brønn plate for microinjections. Matrix skal opprettholdes ved-20 ° c for langtidslagring og tint ved 4 ° c eller på is før bruk. Utvidelse av lunge organoids er gjort er en lignende måte, men ved hjelp av lunge organoid spesifikke medie komponenter (tabell 1)8 .
- Oppretthold organoids i 3D-kulturer i ekstracellulære matrise (se tabell over materialer) ved 37 ° c. Legg OME (ekspansjon Media) på toppen og oppdatere hver dag.
4. Microinjection av Oocyster/Sporozoitter inn i Organoid lumen
-
Microinject parasitter inn i den apikale siden av 3D-organoid (figur 2).
- Forbered glass kar på 1 mm diameter ved hjelp av en micropipette avtrekker.
Merk: Innstillinger som brukes på micropipette avtrekker (se tabell over materialer) er: Heat = 663, Pull = 100, Velocity = 200, tid = 40 MS. innstillinger må justeres i henhold til bruker instruksjonene for en bestemt maskin. - Skjær spissen av kapillær med tang. Størrelsen/diameteren av kapillær enden måler ca 9 – 12 μm; Dette muliggjør enkel flyt av oocyster (4 – 5 μm-størrelse).
- Fyll blodkar med oocyst eller sporozoite suspensjon ved hjelp av mikro-loader tips.
- Legg den oocyst kapillær på en microinjector.
- Microinject nL suspensjon i hver organoid under et invertert mikroskop ved 5x forstørrelse, holde trykket konstant. Etter microinjection, Oppdater Media med OME eller OMD hver dag og vedlikeholde platen ved 37 ° c.
Merk: Vi bruker ikke en micromanipulator for microinjection. Bruk av samme kapillær anbefales for hele eksperimentet for å sikre lik injeksjon i alle prøvene.
- Forbered glass kar på 1 mm diameter ved hjelp av en micropipette avtrekker.
5. Immunofluorescence farging av Organoids
- Samle organoids (1 – 2 x 24 brønner) med en P1000 pipette i et 15 mL rør som inneholder kald F12 + + +.
- Pellet organoids på 300 x g for 2 min, Fjern supernatanten uten å forstyrre pellet, og forsiktig Pipet pellet løs inn i gjenværende volum.
- Tilsett 5 mL 2% paraformaldehyde i PBS. For å hindre organoids fra å stikke til veggen ikke invertere røret. La organoids bosette seg i bunnen av røret og fikse ved 4 ° c over natten eller 1 time ved romtemperatur.
- Fjern bindemiddel og tilsett 10 mL permeabilization buffer (0,2% Triton i PBS).
- Roter røret ved romtemperatur i 20 min (Dette sikrer at alle organoids forblir i suspensjon).
- Pellet organoids på 300 x g for 2 min, og deretter forkaste supernatanten.
- Resuspend organoids forsiktig i 500 μL av blokkerings løsning (se tabell over materialer) og Overfør til et 2 ml mikrosentrifugen rør.
- Ruge i 20 minutter ved romtemperatur på en shaker. Tillat organoids å bosette til bunnen av røret ved tyngdekraften. Bytt ut blokkerings løsningen med primær antistoff løsning (se tabell over materialer) og ruge for 1 – 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° c.
- Vask 3x med PBS inneholder 0,1% mellom. La organoids bosette seg hver gang og fjerne supernatanten.
- Legg til sekundær antistoff løsning (se tabell over materialer) og ruge for 2 t ved romtemperatur.
- Vask 3x med PBS inneholder 0,1% mellom. La 50 μL av PBS etter den tredje vasken.
- Monter på lysbildet ved å pipettering organoids som er suspendert i 50-μL av PBS på lysbildet. Fjern overflødig PBS, legge til en dråpe av montering agent (se tabell over materialer) og legge til dekkglass på toppen. Forsegle sidene med neglelakk og la det tørke.
6. isolering av Oocyster fra Organoids
- Isoler nylig dannet oocyster fra organoid lumen.
Merk:Oocyster er isolert fra organoids ved immunomagnetisk Innfanging separasjon ved hjelp av et oocyst isolasjons sett (seTabell av materialer) med endringene som er beskrevet nedenfor. Den isolerte oocyster kan deretter analyseres ved immunofluorescence og elektron mikroskopi.- Start med differensiert organoids som har blitt opprettholdt i OMD for 5 – 7 dager og som er infisert, smittet for 1 dag og smittet i 5 dager. Bruk de første to som negative kontroller.
Merk: Vi har funnet at differensiert organoids produsere mer oocyster enn lunge eller utvide intestinal organoids10. - Samle organoids i 15 mL sentrifugerør. Sentrifuger organoids i 20 min ved 3 000 x g og 10 ° c.
Merk: Denne høye hastigheten er nødvendig for å sikre at ingen oocyster er tapt ut av noen organoids som kan være ødelagt. - Fjern det organoid mediet og sett det inn igjen med 5 mL vann.
- Forstyrre organoids ved gjentatt energisk pipettering med en brann-polert glass Pasteur pipette.
- Hvis klumper er synlige, overføre organoid suspensjon til et glass dounce homogenisator, og homogenisere inntil organoids er godt forstyrret. Dounce homogenisator vil ikke påvirke oocyster.
- Når det ikke er synlige klumper, tilsett 5 mL buffer A fra oocyst isolasjons sett. Bland og deretter legge til 120 μL av magnetiske perler belagt med anti-oocyst IgM.
- Ruge cellen suspensjon og magnetiske perler for 2 h ved romtemperatur med kontinuerlig miksing på en rocker plattform.
- På slutten av inkubasjons, plasser rørene som inneholder celler og perler på et magnetisk skille rack designet for 15 mL rør.
- Roter rørene i det magnetiske skille stativet manuelt i 3 minutter. Perlene vil holde seg til siden av røret ved siden av magneten.
- Forsiktig, med en 10 mL pipette, Fjern supernatanten fra perlene. Resuspend av perlene i 450, μL av buffer B og Overfør til et 1,5 mL mikrosentrifugen rør.
Merk: Hold supernatanten inntil isolasjonen av oocyster er bekreftet. - For å samle eventuelle gjenværende perler og oocyster, vask 15 mL rør med 450 μL av buffer B og tilsett denne vasken til de magnetiske perlene i mikrosentrifugen røret.
- Gjenta trinn 6.1.11 én gang til. Alle perler og fanget oocyster skal nå overføres til mikrosentrifugen røret.
- Plasser mikrosentrifugen røret på en magnetisk separasjon rack designet for å holde mikrosentrifugen rør.
- Roter røret i det magnetiske skille stativet for hånd i 3 min.
- Fjern forsiktig supernatanten med en pipette inn i et nytt rør.
Merk: Hold supernatanten inntil isolasjonen av oocyster er bekreftet. - Fjern det mikrosentrifugen røret som inneholder magnetiske perler og oocyster fra det magnetiske skille stativet.
- Tilsett 100 μL av 0,1 N HCl til magnetiske perler for å eluere oocyster av perlene. Vortex for 30 s.
Merk: Vortexer bør settes til litt mindre enn maksimal hastighet. - Ruge perler i 0,1 N HCl i 10 min ved romtemperatur.
- Vortex igjen. Deretter plasserer røret tilbake på magnetiske separasjon rack. Vent til perler å holde seg til siden av røret og deretter overføre supernatanten til en ny mikrosentrifugen tube.
- Gjenta trinn 6.1.17 gjennom 6.1.19 og Kombiner den andre eluatet med den første eluering.
- Nøytralisere eluatet med 20 μL av 1 N NaOH, eller en annen nøytralisere buffer, for eksempel 1 M Tris, pH 8.
- For å telle oocyster, ta 10 μL av eluatet, Kombiner det med 10 μL av oocyst-spesifikt antistoff (se tabell over materialer) og telle fluorescerende oocyster på en hemocytometer.
Merk: Isolerte oocyster kan oppbevares ved 4 ° c eller brukes umiddelbart til immunofluorescence eller elektron mikroskopi bildebehandling.
- Start med differensiert organoids som har blitt opprettholdt i OMD for 5 – 7 dager og som er infisert, smittet for 1 dag og smittet i 5 dager. Bruk de første to som negative kontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollene som presenteres her resulterer i effektiv rensing av oocyster og sporozoitter (figur 1a) klar for microinjection. Excystation protokoll resulterer i frigjøring av sporozoitter fra ca. 70 – 80% av oocyster, derfor er det viktig å filtrere ut de resterende oocyster og skjellene gjennom et 3 μm filter. Filtrering resulterer i nesten 100% sporozoite rensing (figur 1B). Videre, tilsetning av et grønt fargestoff bidrar til å sikre injeksjon av alle organoids og tillater visualisering av injisert organoids i minst 24 timer etter injeksjon (figur 2b).
Disse protokollene for utarbeidelse av oocyster og sporozoitter er grei og har vært brukt i mange år, så det er forventet at de behandlede oocyster og renset sporozoitter vil være levedyktig og smittsomme. I studiene brukte vi imidlertid å skanne elektron mikroskopi for å sikre at excystation prosessen ikke skadet sporozoitter eller oocyster (fig. 2a)10. Injeksjon av like mengder oocyster inn i organoid lumen kan bekreftes visuelt ved enkel mikroskopisk bildebehandling (figur 2C). En del av infiserte organoids bør settes opp for å verifisere parasitten forplantning av kvantitative PCR som vi har beskrevet10.
Fremgang gjennom parasitten livssyklusen kan bli visualisere av samling av infiserte organoids på ulike tidspunkt poeng etter smitte og analyse av Transmission Electron mikroskopi eller ved immunofluorescence kombinert med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole ( DAPI) farging av parasitt kjerner10. For eksempel kan antistoffer mot merozoite overflate antigener, slik som gp40 og gp1517 brukes til å identifisere meront stadier; type I meronts vil ha 8 kjerner og type II meronts, 4 kjerner10. Nylig, et panel av monoklonale antistoffer spesifikke for trophozoites, merozoitter, skriver jeg versus II meronts, og macrogamonts har blitt tilgjengelig18. Disse antistoffene vil også være svært effektive i merking fremdriften av parasitten gjennom sine ulike livssyklus stadier i organoids.
Immunofluorescence analyser kan også brukes til å utforske hvilke celletyper som er infisert av Cryptosporidium. Dette var spesielt viktig å se på i luftveiene organoids som svært lite er kjent om luftveiene cryptosporidiose, og den eksakte vert celle for parasitten var ikke kjent. Vi gjennomførte immunofluorescence analyser på Cryptosporidium-smittet organoids, co-lokalisere CC10, en markør for klubben celler og funnet ut at CRYPTOSPORIDIUM smittet både CC10-negative og positive celler (Figur 3). Disse resultatene ble bekreftet av systemer der vi observerte Cryptosporidium infisere sekretoriske og ikke-sekretoriske celler i luftveiene organoids10.
Etter differensiert organoids har vært smittet i fem dager, bør det være betydelig antall oocyster blir produsert. I våre hender har smitte av organoids fra 1 6-brønnen gitt ca 4000 oocyster, som lett kan identifiseres og telles på en hemocytometer ved merking med et oocyst-spesifikt antistoff. Tilstedeværelsen av fire sporozoitter i oocyster kan bekreftes ved å tørke ned en del av oocyster på en selvklebende sklie, feste med metanol og kombinere DAPI farging med oocyst spesifikt antistoff (Figur 4). Verifisering av produksjon av tykke vegger oocyster kan gjøres ved TEM analyse10.
Figur 1: forberedelse og rensing av Cryptosporidium oocyster og sporozoitter. (A) skjematisk fremstilling av metoden som brukes for oocyst og sporozoite forberedelse til infeksjon. (B) bilde som viser in vitro excystation av oocyster. Filtrering av unexcysted oocyts og skjell gir en renset løsning av sporozoitter. Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Microinjection av oocyster inn i organoid lumen. Dette tallet har blitt modifisert fra Heo et al.10. (A) Scanning elektron MIKROSKOPI (SEM) bilder av oocyster og sporozoitter. (B) bilde som viser oocyst-injisert organoids. Den grønne fargestoff hjelper visualisere injeksjon av hver organoid og vedvarer over minst 24 h. (C) bilde av en organoid injisert med oocyster. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Immunofluorescence bilde av Cryptosporidium-infiserte luftveis organoid. Mucin er merket med anti-mucin 5 antistoff (rød) i lumen av organoid, klubb celler er merket med anti-CC10 (gul), Cryptosporidium oppdages med oocyst-spesifikke antistoff (grønn), og cellekjerner er farget med DAPI (blå). Panel B er en utvidelse av området som er angitt i kvadratet i panel A. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Immunofluorescence bilde av oocyst isolert fra differensiert intestinal organoids. Oocyst veggen er merket med Oocyst-spesifikke antistoff i grønt og de fire sporozoite kjerner er visualisere med DAPI (blå) Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kultur Cryptosporidium parasitter i tarm og luftveier organoids gir en nøyaktig modell for å studere Host-parasitt interaksjoner10 , men har også mange andre programmer. For eksempel, nåværende metoder for å velge og overføre genmodifiserte Cryptosporidium parasitter krever passasje i mus19 som ikke tillater isolering av parasitter som har modifikasjoner viktig for in vivo infeksjon. Organoid kulturen i Cryptosporidium gir et alternativ til denne prosedyren. Men vi har bemerket at electroporated sporozoitter klump sammen og blokkere micropipette. For å velge genmodifiserte parasitter, organoids kan dyrkes på kollagen belagt transwells i et to-dimensjonale format under differensiering forhold for å tillate infeksjon med transfekterte sporozoitter og følgelig valg av genetisk modifiserte oocyster. Transwells gir tilgang til både apikale og basolateral overflater og er stabile i lengre perioder.
Foreløpig er vi kultur organoids i et to-dimensjonale format for høy gjennomstrømning screening av legemidler for kreft vev-avledet organoids (upubliserte data). Denne metoden for organoid kultur kan også tilpasses for testing av anti-Cryptosporidium legemidler ved hjelp av genetisk modifisert luciferase merket Cryptosporidium stammer19. Videre, selv om infeksjonen ikke er tett synkronisert, gir smitte av organoids med sporozoitter tilstrekkelig synkronisering av livssyklusen at narkotika kan testes for deres effekt mot spesifikke livssyklus faser.
Organoid co-kultur systemer blir nå utviklet tar hensyn til noen andre aspekter av vertssystemet som bakterieflora og immunceller20. Således, evnen å analysere vekselsvirkningene imellom det parasitt og vert celler, immunceller og bakterieflora ville snart være mulig inne vitro. Genetisk manipulering av Cryptosporidium er nå også mulig19, og kombinasjonen av fluorescerende reporter stammer av Cryptosporidium og organoid kultur vil gi verktøy for én celle sekvensering av infiserte celler, og enda mer spesifikt enkelt celle sekvensering av celler infisert med bestemte stadier av parasitten.
Suksessen til eksperimentene som er beskrevet her er svært avhengig av levedyktigheten og infectivity til oocyster. Ulike partier av Cryptosporidium oocyster kan variere mye i excystation priser og evne til å infisere vert celler. Tilstrekkelig utbytte av sporozoitter er avhengig av gode excystation rater og excystation raten er ikke alltid korrelert til infectivity. Hvis lave nivåer av infeksjon eller dårlig excystation er observert med en bestemt gruppe med oocyster, tid og krefter kan bli frelst ved å skaffe en ny masse oocyster heller enn å forsøke å øke oocyst tall, eller forlenge inkubasjons ganger.
Organoid kultur Media bør oppdateres hver alternativ dag. Bruk av tidligere passasjer av organoid kulturer er tilrådelig. Det er viktig å tine et nytt hetteglass med organoids hvis organoids begynner å differensiere i senere passasjer som helse for organoid kulturer vesentlig bestemme levedyktigheten til parasitten. Etter smitte, organoid Media bør oppdateres hver dag for å unngå opphopning av giftige stoffer i Media.
Organoid kultur Cryptosporidium er begrenset i at parasitten ikke kan spres på ubestemt tid, og infeksjonen Peters ut etter tre passasjer over 28 dager10. Microinjection av tilstrekkelig organoids for mus eksperimenter som vi har beskrevet kan være tidkrevende og fysisk skatte. Likevel, til dags dato, ingen annen metode muliggjør den komplette livssyklusen i et in vitro-system fullstendig representativt for menneskelig infeksjon, og heller ikke har noen kultur system blitt beskrevet som gjør at utforskning av verten-patogen interaksjoner viktig for luftveisinfeksjon. Organoid kulturen i Cryptosporidium gir et kraftig nytt verktøy som åpner opp veier for leting i Host-parasitt interaksjoner ikke tidligere mulig for Cryptosporidium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for Deborah A. Schaefer fra School of Animal og komparative Biomedical Sciences, College of Agriculture and Life Sciences, University of Arizona, Tucson, AZ, USA for å hjelpe oss med oocyst produksjon og analyse. Vi takker også Franceschi mikroskopi og Imaging Center og D.L. Mullendore ved Washington State University for TEM forberedelse og Imaging av isolerte organoid oocyster.
D.D. er mottaker av en VENI stipend fra Nederland organisasjonen for vitenskapelig forskning (NWO-ALW, 016. Veni. 171.015). I.H. er mottaker av en VENI stipend fra Nederland organisasjonen for vitenskapelig forskning (NWO-ALW, 863.14.002) og ble støttet av Marie Curie stipend fra EU-kommisjonen (forslag 330571 FP7-folk-2012-IIF). Forskningen som fører til disse resultatene har fått støtte fra det europeiske Forskningsrådet under ERC Advanced Grant Agreement no. 67013 og fra NIH NIAIH under R21 AT009174 til RMO. Dette arbeidet er en del av Oncode Institute, som er delvis finansiert av den nederlandske Cancer Society og ble finansiert av et stipend fra den nederlandske Cancer Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5 mL | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47 mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500 mL |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5 µM |
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1x |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10 µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1 mL/500 mL media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* - cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500 nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25 ng/mL |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5 mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1 µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5 µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/mL of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make up to 100 mL |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1,000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1,000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
- Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
- Karanis, P., Aldeyarbi, H. M.
- Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
- DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
- Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/early/2018/05/09/318444 (2018).
- Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- O'Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
- Lendner, M., Daugschies, A.
- Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
- O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
- Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
- Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
