Summary
Vi beskriver protokoll för att förbereda oocyster och rena sporozoiter för att studera infektion av mänskliga tarm och luftvägarna organoider av Cryptosporidium parvum. Vi visar procedurerna för mikroinjektion av parasiter i tarmorganoid lumen och immunofärgning av organoider. Slutligen beskriver vi isoleringen av genererade oocyster från organoider.
Abstract
Cryptosporidium parvum är en av de viktigaste orsakerna till mänskliga diarrésjukdom. För att förstå parasitens patologi och utveckla effektiva läkemedel behövs ett in vitro-kultursystem som rekapitulerar förutsättningarna i värden. Organoider, som liknar vävnaderna i deras ursprung, är idealiska för att studera värd-parasit interaktioner. Organoider är tredimensionella (3D) vävnader härledda strukturer som härrör från vuxna stamceller och växa i kulturen under längre perioder utan att genomgå någon genetisk aberration eller omvandling. De har väl definierad polaritet med både apikala och basolaterala ytor. Organoider har olika tillämpningar inom drogtester, bio Banking, och sjukdomsmodellering och värd-Microbe interaktionsstudier. Här presenterar vi ett steg-för-steg-protokoll om hur man förbereder oocyster och sporozoiter av Cryptosporidium för att infektera mänskliga tarm och luftvägarna organoider. Vi visar sedan hur mikroinjektion kan användas för att injicera mikroberna i Organoid lumen. Det finns tre huvudsakliga metoder som organoider kan användas för värd-Microbe interaktionsstudier-mikroinjektion, mekanisk klippning och plätering, och genom att göra monolayers. Microinjection möjliggör underhåll av 3D-strukturen och möjliggör exakt kontroll av parasit volymer och direkt apikal sido kontakt för mikroberna. Vi tillhandahåller Detaljer för optimal tillväxt av organoider för antingen avbildning eller oocyster produktion. Slutligen visar vi också hur de nygenererade oocyster kan isoleras från Organoid för vidare nedströms bearbetning och analys.
Introduction
Utveckling av läkemedel eller vacciner för behandling och förebyggande av Kryptosporidium infektion har hindrats av avsaknaden av in vitro-system som exakt imiterar in vivo situationen hos människor1,2. Många av de för närvarande tillgängliga systemen antingen bara tillåter korttids infektion (< 5 dagar) eller inte stöder den kompletta livscykeln för parasiten3,4. Andra system som möjliggör en fullständig utveckling av parasiten är baserade på förevigade cellinjer eller cancer cellinjer som inte troget rekapitulera den fysiologiska situationen hos människor5,6,7 . Organoider eller "mini-organ" är 3D vävnad härledda strukturer som odlas i en extracellulär matris kompletteras med olika vävnads specifika tillväxtfaktorer. Organoider har utvecklats från olika organ och vävnader. De är genetiskt stabila och recapitulate mest fungerar av organen av deras beskärning, och kan underhållas i kultur för Extended perioder av tid. Vi har utvecklat en metod för att infektera mänskliga tarm och lung organoider med Cryptosporidium som ger en exakt in vitro-modell för studiet av värd-parasit interaktioner relevanta för intestinal och respiratorisk Cryptosporidios8 ,9,10,11,12,13. I motsats till andra publicerade kultur modeller, Organoid systemet är representativt förverkliga värden parasit interaktioner, gör det möjligt för slutförandet av livscykeln så att alla stadier av parasiten livscykel kan studeras, och upprätthåller parasiten förökning upp till 28 dagar10.
Cryptosporidium parvum är en parasit som infekterar epitelet i andnings-och tarm trakterna och orsakar långvarig diarrésjukdom. Den resistenta miljön skede är oocyst, finns i förorenad mat och vatten14. En gång intas eller inhaleras, den oocyster excystor och frigör fyra sporozoiter som fäster epitelceller. Sporozoiter glida på värdar celler och engagera värd cellreceptorer, men parasiten inte helt Invadera cellen, och verkar förmå värdcellen att uppslupa det15. Parasiten, som är internaliserad inom en intracellulär men extracytoplasmic facket, kvar på apikala ytan av cellen, replikerar inom en parasitophorous vacuole. Det genomgår två omgångar av asexuell reproduktion-en process som kallas merogony. Under merogony, typ I meronts utveckla som innehåller åtta merozoiter som släpps för att invadera nya celler. Dessa merozoiter invaderar nya celler för att utvecklas till typ II meronts som innehåller fyra merozoiter. Dessa merozoiter, när de släpps, infektera celler och utvecklas till macrogamonts och microgamonts. Microgametes släpps och befrukta macrogametes producerar zygoter som mognar till oocyster. Mogna oocyster släpps därefter ut i lumen. Oocyster är antingen tunnväggiga som omedelbart excysta att reinfektera epitelet, eller tjocka muromgärdade som släpps ut i miljön för att infektera nästa värd14. Alla stadier av Cryptosporidium livscykel har identifierats i Organoid kultur system som tidigare utvecklats av vår grupp10.
Eftersom humana organoider troget replikerar mänskliga vävnader9,11,13, och stödja alla replikativa stadier av Cryptosporidium10, de är det idealiska vävnadskultur system för att studera Cryptosporidium biologi och värd-parasit interaktioner. Här beskriver vi procedurerna för att infektera organoider med både Cryptosporidium -oocyster och excysted sporozoiter, och isolera de nya oocyster som produceras i detta vävnadskultur system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All vävnads hantering och resektion utfördes under institutionella Granskningsnämnden (IRB) godkända protokoll med patientens samtycke.
1. beredning av C. parvum -oocyster för injektion
Anmärkning: Cryptosporidium oocyster köptes från en kommersiell källa (se tabellen av material). Dessa oocyster produceras i kalvar och lagras i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med antibiotika. De kan förvaras i ca 3 månader vid 4 ° c och får aldrig frysas. Vi använder normalt oocyster inom en månad. Organoider kan infekteras med antingen intakta oocyster, eller sporozoiter kan isoleras från excysted oocyster och används för att infektera organoider om det är viktigt att inte ha oocyster överföring från det ursprungliga inoculum.
-
Förbered Cryptosporidium -oocyster för infekterande celler (figur 1a).
- Håll oocyster på is under alla manipulationer tills de tillsätts till organoider.
- Beräkna antalet oocyster som behövs för en fullständig sex-brunn tallrik organoider (vanligtvis ca 5 x 105– 2,5 x 105 för plattan). Räkna antalet oocyster i en hemocytometern att kontrollera kvantiteten och överföra till ett centrifug röret.
Anmärkning: För att underlätta visualisering kan oocyster blandas 1:1 med en oocystspecifik fluorescerande antikropp (se tabell över material) innan den lastas på hemocytometern. De fluorophore-märkta oocyster kan sedan enkelt visualiseras och räknas med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Vi föreslår att injicera om 100 – 1000 oocyster/Organoid. I allmänhet, 1000-2000 organoider kan odlas i en sex-brunn tallrik. - Ta upp volymen av oocyster suspensionen upp till 900 μL med PBS. Tillsätt 100 μL natriumhypoklorit (t. ex. Clorox) blekmedel (vid 4 ° c). Inkubera i 10 minuter på isen.
- Centrifugera i 3 minuter i en mikrocentrifug vid 4 8 000 x ° vid 4º c. Orientera rören i centrifugen med locket öppningen vänd inåt. Pelleten kan vara svårt att se så att veta var parasiterna har inblandning pelleterat i röret är viktigt.
- Ta bort supernatanten med en pipett som är noga med att undvika pelleten. Tillsätt 1 mL av Dulbecco ' s modifierade Eagle ' s medium (DMEM) och Vortexblanda.
- Centrifugera i 3 minuter i en mikrocentrifug vid 4 8 000 x ° vid 4º c.
- Upprepa sköljningar med DMEM två gånger.
- Förbered expansion medium (OME) eller differentiering Organoid medium (OMD) som taurocholate har tillsatts till en slutlig koncentration av 0,5% (w/v) (se tabell över material). Taurocholate bör alltid förberedas och tillsättas färska.
Anmärkning: Vi har framgångsrikt använt 0,5% taurocholate i våra infektions analyser där inokulum är intakt oocyster, och såg förbättrad infektionsfrekvens utan skadliga effekter på värdcellerna. Emellertid, taurocholate kan ha oväntade effekter på celler, och lägre koncentrationer har använts framgångsrikt i infektion analyser16. - Omsuspendera oocyster i 100 μL av Organoid kultur medium kompletterat med 0,5% (w/v) natriumtaurocholat. Räkna oocyster igen enligt beskrivningen i steg 1.1.2.
- Tillsätt snabbt grönt färgämne till suspensionen för att visualisera injektion.
- Fyll mikro-Loader tips (se tabellen av material) med oocyster suspensionen och använda den för att fylla drog kapillärer.
Försiktighet: Hela förfarandet bör göras i en vävnad kultur huva med nivå-2 säkerhetsprotokoll. Användning av masker rekommenderas som Cryptosporidium oocyster kan också vara smittsam när luftburna.
2. in vitro rening av sporozoiter från C. parvum oocysts
-
Purify sporozoiter från C. parvum oocystor efter blekning och tvätta ut blekmedel som beskrivs ovan.
- Överför oocysterna till en 15 mL tub. Omsuspendera oocyster i rumstemperatur excystation medium (0,75% w/v natriumtaurocholat i DMEM) för att få 1 x 107 oocyster/ml. Tillsatsen av taurocholate förbättrar excystation hastighet av oocyster, förbättra sporozoite avkastning.
- Inkubera oocyster suspension vid 37 ° c i 1 – 1,5 h.
- Kontrollera provet mikroskopiskt för omfattningen av excystation; 60 – 80% excystation är rimligt för god återhämtning av sporozoiter. Om nivån av excystation är låg, inkubera längre (ytterligare 30 min till 1 h).
- Bestäm procent excystation i förhållande till antalet start oocyster. Excystation beräknas som:
% excystation = [1 – (antal intakta oocyster/antal oocyster vid start)] x 100 - Tvätta celler för att avlägsna excystations reagenser genom att tillsätta 14 mL PBS eller medel, blanda och återvinna celler (intakt oocyster, oocyster skal, och sporozoiter) genom centrifugering vid 3 400 x g för 20 min att återhämta sporozoiter. Aspirera försiktigt för att undvika att förlora celler.
- Omsuspendera sporozoitepelleten i 1 – 2 mL DMEM för att erhålla 3 x 107 oocyster/ml (baserat på antalet start-oocyster).
- För att ta bort kvarvarande oocyster och skal, filtrera suspensionen genom ett 3 μm filter (figur 1b). Använd en 47 mm filterhållare apparat försedd med polykarbonatfilter (porstorlek 3 μm) fäst på en 10 mL spruta fat. Placera filter hållarens apparat ovanpå en 15 mL tub. Placera aggregatet i en ishink eller i kylrum.
- Tillsätt 7,5 mL av sporozoite suspensionen till filterenheten och låt den filtrera genom gravitationen. Tvätta igenom med en annan 7,5 mL DMEM.
Anmärkning: För att säkerställa framgång i sporozoite isolering färska oocyster och god excystation är kritiska. Om det finns för många unexcysted oocyster, suspensionen kommer inte flöda genom gravitation. Tillämpa tryck på sprutan kan tvinga unexcysted oocyster igenom. Mikroinjektion av sporozoiter är mer utmanande än för oocyster eftersom sporozoiter kan klumpa och blockera kapillär. För att undvika detta, rekommenderar vi att göra en bredare kapillär spets när injicera organoider med sporozoiter. För att uppnå tillräckliga nivåer av infektion, 2 – 4 gånger antalet sporozoiter måste injiceras i varje Organoid jämfört med organoider infekterade med oocyster. - Centrifugera den filtrerade sporozoite suspensionen vid 3 400 x g med en svängig skopa rotor för 20 min till pellets sporozoiter.
- Resuspend i 50 – 100 μL av OME eller OMD Organoid odlingssubstrat (se tabellen av material) kompletterat med 0,05% (w/v) snabbt grönt färgämne och l-Glutathione, Betaine, l-cystein, linolsyra och taurin-innehållande reducerande buffert5 (se Tabell över material).
Anmärkning: Inkuberande oocyster för länge kan resultera i lys av sporozoiter och dålig återhämtning och därför bör undvikas.
3. in vitro-kultur av mänskliga tarm-och lung Organoider för mikroinjektion
- Kultur intestinal organoider under expansion och differentiering Media villkor.
Observera:Detaljerna i intestinal och lung Organoid utbredning har tidigare beskrivits i andra artiklar8,13(seTabell över materialför medie recept). Här beskriver vi kortfattat Organoid kultur metod med särskild hänvisning till optimering förCryptosporidiuminjektion och tillväxt. Vi har funnit att för avbildning av parasiter i organoider, organoider som odlas i expansions medium är att föredra framför de i odlade differentiering Media eftersom det finns mindre ansamling av skräp än den som ses i organoider odlas i differentiering medium. Men om målet är att isolera oocyster, organoider som odlas i differentiering Media producera mycket högre antal oocyster.- Bibehålla organoider i 3D-kulturer i extracellulär matris (se tabellen av material) vid 37 ° c. Lägg till OME (expansions medium) ovanpå och uppdatera varje dag.
Anmärkning: För lung organoider har vi inte separata expansions-och differentierings medier. - För att dela och platta organoider för mikroinjektion, ta bort media från 6-brunnen plattan som innehåller humana organoider och tillsätt F12 + + + (se tabellen av material) till brunnen och bryta upp matrisen genom Pipettera med en 1 ml pipett spets flera gånger. Samla in celler i en 15 mL tub (2 mL F12 + + + per tub är tillräckligt för ytterligare procedurer).
- Tillsätt 10 – 12 mL av F12 + + + i en annan 15 mL-tub och placera ett brandpolerat glas Pipettera i mediet, Pipettera upp och ner 3 gånger för att bryta upp de mänskliga tarm-och lung organoiderna.
Anmärkning: Använd ett långt glas Pipettera (20 – 30 cm) och avfyra-polera det kort. Gör inte öppningen (1 mm diameter) mycket liten eftersom organoider kan skadas. Gör spetsen av Pipettera slät genom att kort brand-polering det. Bryt organoider i mindre bitar av ~ 50 μm. lung organoider har ett tjockare yttre membran och kräver därför starkare klippning med glaspipetten jämfört med intestinala organoider. Dessutom, de har en långsammare tillväxttakt än intestinal organoider (upp till 14 dagar mellan varje passaging). - Tillsätt F12 + + + upp till 5 – 7 mL och centrifugera vid 350 x g i 5 minuter.
Anmärkning: Centrifugeringshastigheten i detta steg är högre än normalt för att göra en bra cellpellet som är väl separerad från den extracellulära matrisen (se tabellen av material). Vi har observerat att jämfört med mus tunntarm organoider, mänskliga tunntarm organoider är svårare att störa. - Avlägsna så mycket medium som möjligt utan att störa cellerna, och sedan Omsuspendera pelleten med Matrix som hålls vid 4 ° c. 200 – 300 μL matris per brunn av en sex-bra tallrik krävs. Organoider bör delas en i tre för att bibehålla en ganska hög celltäthet.
- Platta organoider i Matrix droppar av ca 5 – 10 μL vardera i brunnen av en sex-bra tallrik. Inkubera i 20 – 30 minuter vid 37 ° c och tillsätt sedan expansions medium (OME) ovanpå.
- Byt medium var 2 – 3 dagar.
Anmärkning: I cirka 5 – 7 dagar, organoider som växer i EM nå en storlek på 100 – 200 μm och är redo för injektion. - För att differentiera organoider, efter 5 – 6 dagar i EM, ändra media till differentiering media (DM) villkor och hålla i 5 – 6 ytterligare dagar innan du injicerar parasiterna.
Anmärkning: För expansion av organoider, det rekommenderas att platta organoider tätt. För mikroinjektion rekommenderas användning av en sex-well tallrik med organoider pläterade i mindre densitet. Till exempel, plåt organoider från tre brunnar av en sex-bra tallrik till en full sex-brunn tallrik för mikroinjektioner. Matrisen skall hållas vid-20 ° c vid långtidsförvaring och upptinad vid 4 ° c eller på is före användning. Expansion av lung organoider görs är ett liknande sätt men med hjälp av lung Organoid specifika Media komponenter (tabell 1)8 .
- Bibehålla organoider i 3D-kulturer i extracellulär matris (se tabellen av material) vid 37 ° c. Lägg till OME (expansions medium) ovanpå och uppdatera varje dag.
4. mikroinjektion av oocyster/sporozoiter i det Organoida lumen
-
Mikroinjicering av parasiter i den apikala sidan av 3D-Organoid (figur 2).
- Förbered glas kapillärer av 1 mm diameter med hjälp av en micropipett avdragare.
Anmärkning: Inställningar som används på micropipett avdragare (se tabell över material) är: Heat = 663, Pull = 100, Velocity = 200, tid = 40 MS. inställningarna kommer att behöva justeras enligt bruksanvisningen för en viss maskin. - Skär spetsen av kapillär med pinps. Storleken/diametern på kapilläränden mäter ca 9 – 12 μm; Detta möjliggör ett enkelt flöde av oocyster (storlek 4 – 5 μm).
- Fyll kapillärer med oocyster eller sporozoite suspension med hjälp av Micro-Loader tips.
- Fyll på den oocyst-fyllda kapillär på en mikroinjektor.
- Microinjicera 100 – 200 nL suspension i varje Organoid under ett inverterat Mikroskop vid 5x förstoring, hålla tryckkonstanten. Efter mikroinjektion, uppdatera media med OME eller OMD varje dag och underhålla plattan vid 37 ° c.
Anmärkning: Vi använder inte en micromanipulator för mikroinjektion. Användning av samma kapillär rekommenderas för hela experimentet för att säkerställa lika injektion i varje prov.
- Förbered glas kapillärer av 1 mm diameter med hjälp av en micropipett avdragare.
5. immunofluorescenens färgning av Organoider
- Samla organoider (1 – 2 x 24 brunnar) med en P1000 pipett i en 15 mL tub som innehåller kallt F12 + + +.
- Pellets organoider på 300 x g för 2 min, ta bort supernatanten utan att störa pelleten, och försiktigt Pipettera pelleten löst i den återstående volymen.
- Tillsätt 5 mL 2% PARAFORMALDEHYD i PBS. För att förhindra att organoider fastnar på väggen Invertera inte röret. Låt organoider att bosätta sig på botten av röret och fixera vid 4 ° c över natten eller 1 h vid rumstemperatur.
- Ta bort fixativ och tillsätt 10 mL permeabiliseringsbuffert (0,2% Triton i PBS).
- Rotera röret vid rumstemperatur i 20 minuter (Detta säkerställer att alla organoider förblir i suspensionen).
- Pellets organoider på 300 x g för 2 min, och sedan Kassera supernatanten.
- Omsuspendera organoiderna försiktigt i 500 μL blockerande lösning (se tabell över material) och överför till ett 2 ml microcentrifugerör.
- Inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur i en shaker. Låt organoider att bosätta sig på botten av röret med tyngdkraften. Byt ut blockeringslösningen mot primär antikropps lösning (se tabell över material) och inkubera i 1 – 2 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° c.
- Tvätta 3x med PBS som innehåller 0,1% Tween. Låt organoiderna bosätta sig varje gång och ta bort supernatanten.
- Tillsätt sekundär antikropps lösning (se tabell över material) och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur.
- Tvätta 3x med PBS som innehåller 0,1% Tween. Lämna 50 μL PBS efter den tredje tvätten.
- Montera på bilden genom att Pipettera organoider suspenderade i 50 μL PBS på bilden. Ta bort överflödig PBS, tillsätt en droppe monteringsmedel (se tabellen av material) och Lägg täckslip ovanpå. Försegla sidorna med nagellacket och låt det torka.
6. isolering av oocyster från Organoider
- Isolera nybildade oocyster från Organoid lumen.
Observera:Oocyster isoleras från organoider genom immunagnetisk separation med hjälp av en oocyster isolerings sats (seTabell över material) med de ändringar som beskrivs nedan. De isolerade oocysterna kan sedan analyseras med immunofluorescensen och elektronmikroskopi.- Börja med differentierade organoider som har bibehållits i OMD för 5 – 7 dagar och som är oinfekterade, infekterade för 1 dag och infekterade i 5 dagar. Använd de två första som negativa kontroller.
Anmärkning: Vi har funnit att differentierade organoider producerar fler oocyster än lung eller expanderande intestinal organoider10. - Samla in organoider i 15 mL centrifugrör. Centrifugera organoider i 20 min vid 3 000 x g och 10 ° c.
Anmärkning: Denna höga hastighet behövs för att se till att inga oocyster försvinner ur någon organoider som kan brytas. - Ta bort Organoid-mediet och Ersätt det med 5 mL vatten.
- Störa organoider genom upprepad kraftig pipettering med en brandpolerad glas Pastinpipett.
- Om klumpar är synliga, överföra Organoid suspensionen till en glas dounce Homogenisatorer, och homogenisera tills organoider är väl störd. Den dounce Homogenisatorer kommer inte att påverka oocyster.
- När det inte finns några synliga klumpar, tillsätt 5 mL buffert A från oocyster isolerings satsen. Blanda och tillsätt sedan 120 μL av de magnetiska pärlorna belagda med anti-oocyst IgM.
- Inkubera cellsuspensionen och magnetiska pärlor för 2 h vid rumstemperatur med kontinuerlig blandning på en rocker plattform.
- I slutet av inkubationen, placera rören som innehåller celler och pärlor på en magnetisk separering rack avsedd för 15 mL rör.
- Rotera rören i magnetisk separation rack manuellt för 3 min. Pärlorna kommer att fästa vid sidan av röret bredvid magneten.
- Ta försiktigt bort supernatanten från pärlorna med en 10 mL pipett. Omsuspendera pärlorna i 450 μL buffert B och överför till ett 1,5 mL microcentrifugerör.
Anmärkning: Håll supernatanten tills isoleringen av oocyster bekräftas. - För att samla upp kvarvarande pärlor och oocyster, tvätta 15 mL-röret med 450 μL buffert B och tillsätt denna tvätt till de magnetiska pärlorna i microcentrifugeröret.
- Upprepa steg 6.1.11 en gång till. Alla pärlor och fångade oocyster bör nu överföras till microcentrifug röret.
- Placera microcentrifugeröret på ett magnetiskt separations rack som är utformat för att hålla mikrocentrifugrör.
- Vrid röret i det magnetiska separations stället för hand i 3 minuter.
- Ta försiktigt bort supernatanten med en pipett till ett nytt rör.
Anmärkning: Håll supernatanten tills isoleringen av oocyster bekräftas. - Avlägsna microcentrifugeröret som innehåller magnetiska pärlor och oocyster från magnet avskiljnings stället.
- Tillsätt 100 μL av 0,1 N HCl till magnetiska pärlor för att eluera oocyster från pärlorna. Vortex för 30 s.
Anmärkning: Vortexer bör ställas in på något mindre än maximal hastighet. - Inkubera pärlorna i 0,1 N HCl i 10 min vid rumstemperatur.
- Vortex igen. Placera sedan röret tillbaka på magnetisk separations rack. Vänta på pärlor att fästa vid sidan av röret och sedan överföra supernatanten till en ny microcentrifug röret.
- Upprepa steg 6.1.17 genom 6.1.19 och kombinera den andra eluatet med den första elueringen.
- Neutralisera eluatet med 20 μL 1 N NaOH, eller en annan neutraliserande buffert som 1 M Tris, pH 8.
- För att räkna oocyster, ta 10 μL av eluatet, kombinera det med 10 μL oocyst-specifik antikropp (se tabell över material) och räkna fluorescerande oocyster på en hemocytometer.
Anmärkning: Isolerade oocyster kan förvaras vid 4 ° c eller användas omedelbart för immunofluorescens eller elektronmikroskopi avbildning.
- Börja med differentierade organoider som har bibehållits i OMD för 5 – 7 dagar och som är oinfekterade, infekterade för 1 dag och infekterade i 5 dagar. Använd de två första som negativa kontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De protokoll som presenteras här resulterar i en effektiv rening av oocyster och sporozoiter (figur 1a) redo för mikroinjektion. Excystations protokoll resulterar i frigöraren av sporozoiter från ungefärligt 70 – 80% av oocystsna, därför är det nödvändigt att filtrera ut de resterande oocystsna och beskjuter till och med ett 3 μm filtrerar. Filtrering resulterar i nästan 100% sporozoite rening (figur 1b). Dessutom, tillsats av en grön färg hjälper till att säkerställa injektion av alla organoider och möjliggör visualisering av injicerade organoider i minst 24 h efter injektion (figur 2b).
Dessa protokoll för beredning av oocyster och sporozoiter är enkla och har använts i många år, så det förväntas att de behandlade oocyster och renade sporozoiter kommer att vara livskraftiga och smittsamma. Men i våra studier använde vi scanningelektronmikroskopi för att säkerställa att excystations processen inte skadade sporozoiter eller oocyster (figur 2A)10. Injektion av lika mängder oocyster i Organoid lumen kan visuellt bekräftas genom enkel mikroskopisk avbildning (figur 2C). En del av infekterade organoider bör inrättas för att verifiera parasitens utbredning genom kvantitativ PCR som vi har beskrivit10.
Framsteg genom parasitens livscykel kan visualiseras genom insamling av infekterade organoider vid olika tidpunkter efter infektion och analys genom transmissionselektronmikroskopi eller genom immunofluorescensbildning kombinerat med 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindol ( DAPI) färgning av parasit kärnor10. Till exempel, antikroppar mot merozoite ytantigener, såsom gp40 och GP1517 kan användas för att identifiera meront stadier; typ I meronts kommer att ha 8 kärnor och typ II meronts, 4 kärnor10. Nyligen, en panel av monoklonala antikroppar som är specifika för trophozoites, merozoiter, typ I kontra II meronts, och macrogamonts har blivit tillgänglig18. Dessa antikroppar skulle också vara mycket effektiva för att markera utvecklingen av parasiten genom dess olika livscykelstadier i organoider.
Immunofluorescensanalyser kan också användas för att undersöka vilka celltyper som är infekterade av Cryptosporidium. Detta var särskilt viktigt att titta på i luftvägarna organoider som mycket lite är känt om respiratoriska cryptosporidiosis, och den exakta värdcellen för parasiten var inte känd. Vi genomförde immunofluorescenstester på Cryptosporidium-infekterade organoider, Co-LOCALIZING CC10, en markör för klubb celler och fann att Cryptosporidium infekterade både CC10-negativa och positiva celler (figur 3). Dessa resultat styrdes av TEMs där vi observerade Cryptosporidium infekterande sekretoriska och icke-sekretoriska celler i luftvägarna organoider10.
Efter differentierade organoider har smittats i fem dagar, det bör finnas ett betydande antal oocyster som produceras. I våra händer, infektion av organoider från 1 6-väl plattan gav ca 4000 oocyster, som lätt kan identifieras och räknas på en hemocytometern genom märkning med en oocyst-specifik antikropp. Närvaron av fyra sporozoiter i oocyster kunde bekräftas genom torkning ner en del av oocyster på en självhäftande bild, fastställande med metanol och kombinera DAPI färgning med oocyster specifik antikropp (figur 4). Verifiering av produktionen av tjocka muromgärdade oocyster kan göras genom TEM-analys10.
Figur 1: beredning och rening av Cryptosporidium -oocyster och sporozoiter. ASchematisk framställning av den metod som används för oocyster-och sporozoitiska preparat för infektion. (B) bild som visar in vitro excystation av oocyster. Filtrering av unexcysted oocyter och skal ger en renad lösning av sporozoiter. Scale bar = 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: mikroinjektion av oocyster i det organoida lumen. Denna siffra har modifierats från HEO et al.10. A) bilder av oocyster och sporozoiter (SEM-mikroskopi). (B) bild som visar oocyst-injicerade organoider. Den gröna färgen hjälper visualisera injektion av varje Organoid och kvarstår under minst 24 h. (C) bild av en Organoid injiceras med oocyster. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Immunofluorescensbild av Cryptosporidium-infekterad luftvägs Organoid. Mucin är märkt med anti-mucin 5 antikropp (röd) i lumen av Organoid, är klubb celler märkta med anti-CC10 (gul), Cryptosporidium detekteras med oocyst-specifik antikropp (grön), och cellkärnor FÄRGAS med DAPI (blå). Panel B är en utvidgning av det område som anges på torget i panel A. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Immunofluorescensbild av oocyster som isolerats från differentierade intestinala organoider. Oocystväggen är märkt med oocyst-specifik antikropp i grönt och de fyra sporozoite kärnor visualiseras med DAPI (blå) vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kultur av Cryptosporidium parasiter i tarm och luftvägarna organoider ger en exakt modell för att studera värd-parasit interaktioner10 men har också många andra program. Till exempel, nuvarande metoder för att välja och sprida genetiskt modifierade Cryptosporidium parasiter kräver passage i möss19 som inte tillåter isolering av parasiter som har ändringar som är väsentliga för in vivo infektion. Organoid kultur av Cryptosporidium ger ett alternativ till detta förfarande. Emellertid, vi har noterat att elektroporated sporozoiter klumpar ihop och blockera mikropipett. I syfte att välja ut genetiskt modifierade parasiter kan organoider odlas på kollagen-belagda transwells i ett tvådimensionellt format under differentierings förhållanden för att möjliggöra infektion med transfekterade sporozoiter och därmed valet av de genetiskt modifierade oocysterna. Transwells ger tillgång till både apikala och basolaterala ytor och är stabila under längre tidsperioder.
För närvarande, Vi odlar organoider i ett tvådimensionellt format för hög genomströmning screening av läkemedel för cancervävnad härledda organoider (opublicerade data). Denna metod för Organoid kultur kan också anpassas för testning av anti-Cryptosporidium droger med hjälp av genetiskt modifierade luciferas taggade Cryptosporidium stammar19. Dessutom, även om infektionen inte är tätt synkroniserad, infektion av organoider med sporozoiter ger tillräcklig synkronisering av livscykeln som läkemedel kan testas för deras effekt mot specifika livscykelstadier.
Organoid Co-Culture system utvecklas nu med hänsyn till några andra aspekter av värdsystemet såsom bakterieflora och immunceller20. Sålunda, förmågan att dissekera interaktioner mellan parasiten och värdceller, immunceller och bakterieflora kommer snart att vara möjligt in vitro-. Genetisk manipulation av Cryptosporidium är också nu möjligt19, och kombinationen av fluorescerande reporter stammar av Cryptosporidium och Organoid kultur kommer att ge verktyg för Single cell sekvensering av infekterade celler, och ännu mer specifikt Single cell sekvensering av celler infekterade med specifika stadier av parasiten.
Framgången med de experiment som beskrivs här är starkt beroende av oocysternas livsduglighet och smittsamhet. Olika partier av Cryptosporidium oocyster kan variera kraftigt i excystation priser och förmåga att infektera värdceller. Tillräcklig avkastning sporozoiter är beroende av god excystation priser och excystation hastigheten är inte alltid korrelerad till smittsamhet. Om låga nivåer av infektion eller dålig excystation observeras med ett visst parti av oocyster, tid och ansträngning kan räddas genom att få en ny massa oocyster snarare än att försöka öka oocyster nummer, eller förlänga inkubationstider.
Organoid kultur Media bör uppdateras varje alternativ dag. Användning av tidigare passager av Organoid kulturer är tillrådligt. Det är viktigt att Tina en ny flaska av organoider om organoider börjar differentiera i senare passager som hälsa Organoid kulturer kraftigt bestämma livskraft parasiten. Efter infektion, Organoid Media bör uppdateras varje dag för att undvika ansamling av giftiga ämnen i media.
Organoid kultur Cryptosporidium är begränsad i att parasiten inte kan spridas på obestämd tid, och infektionen Peters ut efter tre passager över 28 dagar10. Mikroinjektion av tillräckliga organoider för mus experiment som vi har beskrivit kan vara tidskrävande och fysiskt påfrestande. Icke desto mindre, hittills, ingen annan metod gör det möjligt för hela livscykeln i ett in vitro-system helt representativa för mänsklig infektion, inte heller har något kultur system beskrivits som tillåter utforskning av värd-patogenen interaktioner viktiga för luftvägsinfektion. Organoid kultur Cryptosporidium ger ett kraftfullt nytt verktyg som öppnar vägar för utforskning av värd-parasit interaktioner inte tidigare möjligt för Cryptosporidium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för Deborah A. Schaefer från School of Animal och komparativa biomedicinska vetenskaper, College of Agriculture och Life Sciences, University of Arizona, Tucson, AZ, USA för att hjälpa oss med oocyster produktion och analys. Vi tackar också Franceschi Microscopy och Imaging Center och D.L. Mullendore vid Washington State University för TEM beredning och avbildning av isolerade Organoid oocyster.
D.D. är mottagare av ett VENI-stipendium från den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO-ALW, 016. Veni. 171.015). I.H. är mottagare av ett VENI-stipendium från den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO-ALW, 863.14.002) och stöddes av Marie Curie-stipendier från Europeiska kommissionen (förslag 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). Forskningen som leder till dessa resultat har fått bidrag från Europeiska forskningsrådet under ERC Advanced Grant Agreement nr 67013 och från NIH NIAIH under R21 AT009174 till RMO. Detta arbete är en del av Oncode Institute, som delvis finansieras av det nederländska cancer sällskapet och finansierades av ett bidrag från det nederländska cancer sällskapet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5 mL | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47 mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500 mL |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5 µM |
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1x |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10 µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1 mL/500 mL media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* - cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500 nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25 ng/mL |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5 mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1 µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5 µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/mL of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make up to 100 mL |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1,000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1,000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
- Checkley, W., et al. A review of the global burden, novel diagnostics, therapeutics, and vaccine targets for Cryptosporidium. The Lancet Infectious Diseases. 15 (1), 85-94 (2015).
- Bones, A. J., et al. Past and future trends of Cryptosporidium in vitro research. Experimental Parasitology. 196, 28-37 (2018).
- Muller, J., Hemphill, A. In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology. 43 (2), 115-124 (2013).
- Karanis, P., Aldeyarbi, H. M.
- Morada, M., et al. Continuous culture of Cryptosporidium parvum using hollow fiber technology. International Journal for Parasitology. 46 (1), 21-29 (2016).
- DeCicco RePass, M. A., et al. Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum. Infection and Immunity. 85 (3), (2017).
- Miller, C. N., et al. A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology. International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modelling. bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/early/2018/05/09/318444 (2018).
- Dutta, D., Clevers, H. Organoid culture systems to study host-pathogen interactions. Current Opinion in Immunology. 48, 15-22 (2017).
- Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- O'Hara, S. P., Chen, X. M. The cell biology of Cryptosporidium infection. Microbes and Infection. 13 (8-9), 721-730 (2011).
- Lendner, M., Daugschies, A.
- Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells. Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).
- O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens. Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).
- Wilke, G., et al. Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro. mSphere. 3 (3), (2018).
- Vinayak, S., et al. Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum. Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
