Summary
我々は、クリプトスポリジウムパルバムによるヒト腸および気道オルガノイドの感染を研究するための卵胞を調造し、スポロゾイツを精製するためのプロトコルを説明する。腸内臓器内膜への寄生虫のマイクロインジェクションとオルガノイドの免疫染色の手順を示す.最後に、オルガノイドから発生した卵胞の単離について述べた。
Abstract
クリプトスポリジウムパルバムは、ヒト下痢症の主な原因の一つである。寄生虫の病理を理解し、効率的な薬剤を開発するためには、宿主の状態を要約するインビトロ培養システムが必要である。オルガノイドは、その起源の組織によく似ており、宿主と寄生虫の相互作用を研究するのに理想的です。オルガノイドは、成体幹細胞に由来し、遺伝的収差や形質転換を受けることなく長期間培養中に増殖する三次元(3D)組織由来構造である。それらは頂点および浴盤の表面との極性をよく定義した。オルガノイドは、薬物検査、バイオバンキング、疾患モデリングおよび宿主微生物相互作用研究において様々な用途を有する。ここでは、ヒトの腸および気道オルガノイドに感染するためのクリプトスポリジウムの卵胞およびスポロゾイツを調製する方法のステップバイステップのプロトコルを提示する。次に、マイクロインジェクションを使用して微生物をオルガノイド内膜に注入する方法を示します。オルガノイドを宿主微生物相互作用研究に使用できる主な方法は、マイクロインジェクション、機械的せん断、めっき、単層の作り方の3つがあります。マイクロインジェクションは3D構造の維持を可能にし、寄生虫の容積および微生物のための直接頂点の側面接触の精密な制御を可能にする。イメージングまたは卵嚢胞産生のためのオルガノイドの最適な成長のための詳細を提供します。最後に、新たに生成された卵胞をオルガノイドから単離して、さらに下流の処理と解析を行う方法も示します。
Introduction
クリプトスポリジウム感染の治療および予防のための薬剤またはワクチンの開発は、ヒト1,2における生体内状況を正確に模倣するインビトロシステムの欠如によって妨げられている。現在利用可能なシステムの多くは、短期的な感染(<5日)のみを許可するか、寄生虫3、4の完全なライフサイクルをサポートしていません。寄生虫の完全な発達を可能にする他のシステムは、ヒトの生理状況を忠実に要約しない不死化細胞株または癌細胞株に基づいている5,6,7.オルガノイドまたは「ミニ臓器」は、様々な組織特異的成長因子を補完する細胞外マトリックスで成長する3D組織由来の構造である。オルガノイドは、様々な臓器や組織から開発されています。それらは遺伝的に安定しており、その起源の器官のほとんどの機能を要約し、長期間培養中に維持することができる。腸と呼吸器クリプトスポリジウムに関連する宿主寄生虫相互作用の研究のための正確なインビトロモデルを提供するクリプトスポリジウムでヒトの腸および肺オルガノイドを感染させる方法を開発した8 ,9,10,11,12,13.他の公表された培養モデルとは対照的に、オルガノイド系は、実際の宿主寄生虫相互作用を代表し、寄生虫のライフサイクルのすべての段階を研究できるようにライフサイクルを完了し、寄生虫の伝播を維持することができます。最大28日間10.
クリプトスポリジウムパルバムは、呼吸器および腸管の上皮に感染し、長期の下痢疾患を引き起こすアピコンプレミカン寄生虫である。耐性環境段階は、汚染された食品および水14に見られる卵胞である。一度摂取または吸入すると、卵嚢胞は上皮細胞に付着する4つのスポロゾイトを放出する。スポロゾイテスは宿主細胞上を滑走し、宿主細胞受容体を従事させるが、寄生虫は細胞に完全に侵入せず、宿主細胞を誘発して15を巻き込むように見える。寄生虫は、細胞内の内部に内在するが、細胞外のクラスタ内に残り、細胞の頂点に残り、寄生虫の真空中で複製する。それは無性生殖の2ラウンドを受ける - メロゴニーと呼ばれるプロセス。メロゴンの間に、新しい細胞に侵入するために放出される8つのメロゾイトを含むI型メロンが発達する。これらのメロゾイトは新しい細胞に侵入し、4つのメロゾイトを含むII型メロンに発展する。これらのメロゾサイトは、放出されると、細胞に感染し、マクロガモントおよびマイクロガモントに発症する。マイクロガメテスが放出され、成熟したザイゴットを産生するマクロガメテスを受精させる。成熟した卵胞は、その後内膜に放出される。卵嚢胞は、上皮を再感染させる直ちに排泄物を放出する薄い壁であるか、または次の宿主14に感染するために環境に放出される厚い壁である。クリプトスポリジウムライフサイクルのすべての段階は、我々のグループ10によって以前に開発されたオルガノイド培養システムで同定されている。
ヒトオルガノイドはヒト組織9、11、13を忠実に複製し、クリプトスポリジウム10のすべての複製段階をサポートするので、それらは研究する理想的な組織培養システムであるクリプトスポリジウム生物学と宿主寄生虫相互作用ここでは、クリプトスポリジウム卵胞子と排泄されたスポロゾイツの両方でオルガノイドに感染し、この組織培養システムで産生される新しい卵胞を分離する手順について説明する。
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Protocol
すべての組織の取り扱いと切除は、患者の同意を得て、機関審査委員会(IRB)承認されたプロトコルの下で行われました。
1. 注射用C.パルバムウーシストの調製
注:クリプトスポリジウム卵嚢胞は、商業的な供給源から購入された(材料の表を参照)。これらの卵胞は子牛で産生され、抗生物質とリン酸緩衝生理食べ物(PBS)に保存されます。それらは4 °Cで約3ヶ月間貯えることができるし、決して凍結してはならない。私たちは通常、1ヶ月以内に卵嚢胞を使用します。オルガノイドは、無傷の卵胞に感染し、またはスポロゾイツは、排泄された卵嚢から単離され、元の接種から卵胞を持ち越さないことが重要である場合はオルガノイドに感染するために使用することができる。
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細胞に感染するためのクリプトスポリジウム卵嚢胞を調調す(図1A)。
- オルガノイドに追加されるまで、すべての操作を通して氷の上に卵嚢胞を保ちます。
- オルガノイドの完全な6ウェルプレートに必要な卵嚢胞の数を計算します(通常、プレートの約5 x 105-2.5 x 105)。ヘモサイトメーターの卵胞数を数え、量を確認し、遠心管に移します。
注:可視化を助けるために、卵嚢胞は、発血量計にロードされる前に、卵母細胞特異的蛍光抗体(材料の表を参照)と1:1を混合してもよい。蛍光顕微鏡を用いて、蛍光標識された卵嚢胞を容易に可視化し、列挙することができる。約100~1,000の卵胞/オルガノイドを注入することをお勧めします。一般に、1,000〜2,000個のオルガノイドを6ウェルプレートで栽培することができます。 - PBSで900 μLまでの卵母体懸濁液の容積を持って来なさい。次亜塩素酸ナトリウム(例えば、クロロックス)漂白剤(4°C)を100μL加えます。氷の上で10分間インキュベートします。
- 4°Cで8,000 x gのマイクロ遠心分離機で3分間遠心分離機。遠心分離機のチューブの向きに、キャップ開口部を内側に向けます。ペレットは見えにくいので、寄生虫がチューブ内のどこにペレットを入れたかを知ることは不可欠です。
- ペレットを避けるために注意しているピペットで上清を取り除く。ダルベッコの改変イーグルミディアム(DMEM)と渦を1mL加えて混ぜます。
- 4°Cで8,000 x gのマイクロ遠心分離機で3分間遠心分離機。
- DMEMでさらに2回洗い返します。
- タウロコレートを0.5%(w/v)の最終濃度に添加した膨張培地(OME)または分化オルガノイド培地(OMD)を調記する(材料の表を参照)。タウロコレートは常に準備し、新鮮な追加する必要があります。
注:我々は、接種が無傷の卵胞である私達の感染アッセイで0.5%タウロコレートを使用することに成功し、宿主細胞に有害な影響を与えることなく感染率が改善された。しかしながら、タウロコレートは細胞に予期せぬ影響を及ぼす可能性があり、感染アッセイ16では低濃度が正常に使用されている。 - タウロコレートナトリウム0.5%(w/v)を補ったオルガノイド培地の100μLで卵嚢胞を再中断する。手順 1.1.2 で説明したように、再度卵母細胞をカウントします。
- 注入を視覚化するために懸濁液に高速緑色の染料を追加します。
- マイクロローダーの先端(材料の表を参照)を卵母剤の懸濁液で充填し、引っ張られた毛細血管を充填するためにそれを使用します。
注意:全体の手順は、レベル2の安全プロトコルを持つ組織培養フードで行われるべきです。クリプトスポリジウム卵嚢胞は、空中で感染する可能性もあるので、マスクの使用をお勧めします。
2. C.パルバム・ウーシストからのスポロゾイツのインビトロ精製
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上述したように漂白剤を洗い流した後、C.parvum oocystsからスポロゾイツを精製する。
- 卵嚢胞を15 mLチューブに移します。室温排泄培地(DMEMでは0.75%w/vタウロコレートナトリウム)で卵母細胞を再停止し、1 x 107卵嚢胞/mLを得た。タウロコレートの添加は、卵胞の排泄速度を改善し、スポロゾイト収率を向上させる。
- 1-1.5 hの37 °Cで卵母性懸濁液をインキュベートする。
- サンプルを顕微鏡で調べて、排泄の程度を確認します。60-80%の排泄は、スポロゾイツの良好な回復のために合理的です。排泄のレベルが低い場合は、より長くインキュベートする(別の30分から1時間)。
- 開始卵嚢胞の数に対する排泄率を決定します。排泄は次のように計算されます。
% エクシステーション = [1 – (無傷の卵胞数/開始時の卵胞数)] x 100 - 14 mLのPBSまたは培地を添加して細胞を洗浄し、細胞(無傷の卵嚢、卵嚢、およびスポロゾイツ)を3,400 x gで20分間遠心分離して回収し、スポロゾイツを回収する。細胞を失うことを避けるために慎重に吸引。
- DMEMの1-2 mLでスポロゾイテペレットを再ステーペントし、3 x 107卵母細胞/mLを得る(開始卵嚢胞の数に基づく)。
- 残りの卵母細胞および貝殻を除去するには、3 μm フィルター (図 1B)を通して懸濁液をフィルター処理します。10 mLシリンジバレルに取り付けられたポリカーボネートフィルター(3μmの細孔サイズ)を取り付けた47mmフィルターホルダー装置を使用します。フィルターホルダー装置を15mLチューブの上に置きます。組み立てをアイスバケツまたはコールドルームに置きます。
- フィルターアセンブリにスポロゾイテサスペンションの7.5 mLを追加し、重力でフィルタリングできるようにします。DMEMの別の7.5 mLで洗い流します。
注:スポロゾイテ分離の成功を確実にするためには、新鮮な卵胞と良好な排泄物が重要です。非エキシストの卵胞が多すぎると、懸濁液は重力によって流れ込まない。注射器に圧力をかけることで、無消しの卵胞を強制的に通すことができます。スポロゾイトのマイクロインジェクションは、スポロゾイツが毛細血管を束ねてブロックする可能性があるため、卵胞のマイクロインジェクションよりも困難です。これを避けるために、スポロゾイトでオルガノイドを注入する際に、より広い毛細血管の先端を作ることをお勧めします。十分なレベルの感染を達成するためには、卵胞に感染したオルガノイドと比較して、各オルガノイドに2~4倍のスポロゾイテスを注入する必要がある。 - ペレットスポロゾイツに20分間スイングバケツローターを使用して、3,400 x gでフィルタリングされたスポロゾイトサスペンションを遠心分離します。
- OMEまたはOMDオルガノイド培養培地の50~100μL(材料表参照)で再中断 0.05% (w/v) ファストグリーン色素およびL-グルタチオン、ベタイン、L-システイン、リノール酸およびタウリン含有バッファー5(参照)材料のテーブル)
注:あまりにも長い間卵胞をインキュベートすると、スポロゾイツのリシスと回復不良を引き起こし、したがって避けるべきである。
3. マイクロインジェクションのためのヒト腸および肺オルガノイドのインビトロ培養
- 拡張および分化培養中の培養腸オルガノイド
メモ：腸および肺オルガノイド伝播の詳細は、以前に他の記事で説明されています8,13(参照してください。材料の表メディアレシピ用)。ここでは、オルガノイド培養法を最適化に関する具体的な参照と共に簡単に説明します。Cryptosporidium注射と成長。オルガノイド中の寄生虫のイメージングでは、分化媒体で増殖したオルガノイドは、分化媒体で増殖したオルガノイドに比べて破片の蓄積が少ないため、増殖媒のオルガノイドよりも好ましいことがわかった。しかし、目的が卵胞を単離する場合、分化培ったオルガノイドは、はるかに多くの卵胞を産生する。- 細胞外マトリックス(材料表参照)で3D培養中のオルガノイドを37°Cで維持します。OME(拡張メディア)を上部に追加し、毎日リフレッシュします。
注:肺オルガノイドの場合、別々の膨張および分化媒体はありません。 - マイクロインジェクション用のオルガノイドを分割してプレートにするには、ヒトオルガノイドを含む6ウェルプレートから培地を取り出し、F12+++(材料の表を参照)をウェルに追加し、1 mLピペットチップでピペッティングしてマトリックスを分割します。15 mLチューブに細胞を集集めます(チューブあたりF12++++の2 mLは、さらなる手順のために十分です)。
- 別の15 mLチューブにF12+++の10-12 mLを追加し、媒体に火磨きガラスピペットを置き、ピペットを上下に3回上下に置き、ヒトの腸と肺オルガノイドを分解します。
注:長いガラスピペ(20〜30センチメートル)を使用し、簡単にそれを火磨きます。オルガノイドが損傷する可能性があるため、開口部(直径1mm)を非常に小さくしないでください。ピペットの先端を簡単に火磨きして滑らかにします。オルガノイドを約50μmの小片に分割する肺オルガノイドは、より厚い外膜を有するため、腸オルガノイドと比較してガラスピペットでより強いせん断を必要とする。さらに、彼らは腸オルガノイドよりも遅い成長速度を有する(各通過の間に最大14日)。 - F12++++を最大5~7mL、遠心分離機を350×gで5分間追加します。
注:このステップの遠心分離速度は、細胞外マトリックスから十分に分離された良好な細胞ペレットを作るために通常よりも高い(材料の表を参照)。マウスの小腸オルガノイドに比べて、ヒトの小腸オルガノイドは破壊しにくいことがわかっています。 - 細胞を邪魔することなく、可能な限り多くの培地を除去し、4°Cで維持されたマトリックスでペレットを再中断します。6ウェルプレートのウェルあたりのマトリックスの200〜300 μLが必要です。オルガノイドはかなり高い細胞密度を維持するために3分の1に分割する必要があります。
- 6ウェルプレートのウェルにそれぞれ約5〜10μLのマトリックス液滴にオルガノイドをプレートします。37°Cで20〜30分間インキュベートし、その上に膨張媒体(OME)を追加します。
- 2~3日ごとにメディアを変更します。
注:約5-7日で、EMで成長するオルガノイドは100-200 μmのサイズに達し、注射の準備ができています。 - オルガノイドを区別するために、EMで5-6日後に、分化媒体(DM)条件にメディアを変更し、寄生虫を注入する前に5-6の追加の日のために保ちます。
注:オルガノイドの膨張のために、オルガノイドを緻密にプレートすることをお勧めします。マイクロインジェクションの場合、より低密度でメッキされたオルガノイドで6ウェルプレートを使用することをお勧めします。例えば、6ウェルプレートの3つのウェルからマイクロインジェクション用のフル6ウェルプレートにプレートオルガノイドを入れます。マトリックスは-20 °Cで長期保存し、使用前に4°Cまたは氷の上で解凍する必要があります。肺オルガノイドの拡張は同様の方法であるが、肺オルガノイド特異的培地成分を用いて(表1)8.
- 細胞外マトリックス(材料表参照)で3D培養中のオルガノイドを37°Cで維持します。OME(拡張メディア)を上部に追加し、毎日リフレッシュします。
4. オルガノイドルーメンへのウーシスト/スポロゾイツのマイクロインジェクション
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3Dオルガノイドの頂点側に寄生虫をマイクロインジェクションする(図2)。
- マイクロピペットプーラーを使用して直径1mmのガラス毛細血管を準備します。
注:マイクロピペットプーラーで使用される設定(材料の表を参照)は、熱= 663、プル = 100、速度 = 200、時間 = 40 ミリ秒の設定は、特定のマシンのユーザーの指示に従って調整する必要があります。 - 毛細血管の先端を鉗子で切る。毛細管端のサイズ/直径は約9-12 μmを測定します。これは卵母細胞の容易な流れを可能にする(4-5 μmのサイズ)。
- マイクロローダーの先端を使用して、卵胞またはスポロゾイト懸濁液で毛細血管を埋めます。
- 卵嚢胞で満たされた毛細血管をマイクロインジェクターにロードします。
- 5倍の倍率で反転顕微鏡下の各オルガノイドに100~200nLの懸濁液をマイクロインジェクションし、圧力を一定に保ちます。マイクロインジェクションの後、OMEまたはOMDで毎日メディアをリフレッシュし、プレートを37°Cで維持します。
注:マイクロインジェクションにはマイクロマニピュレータは使用しません。すべてのサンプルで均等な注入を確実にするために、実験全体に同じ毛細血管の使用をお勧めします。
- マイクロピペットプーラーを使用して直径1mmのガラス毛細血管を準備します。
5. オルガノイドの免疫蛍光染色
- 冷たいF12+++を含む15 mLチューブにP1000ピペットを持つオルガノイド(1-2 x 24ウェル)を集みます。
- ペレットオルガノイドを300xgで2分間、ペレットを破壊することなく上清を除去し、ペレットを緩やかに残りの体積にゆるくピプティングする。
- PBSに2%パラホルムアルデヒドの5 mLを追加します。オルガノイドが壁に付着するのを防ぐために、チューブを反転させないようにします。オルガノイドをチューブの底部に落ち着かせ、室温で一晩または1時間で4°Cで固定します。
- 固定液を取り外し、透過性バッファーの10 mLを追加します(PBSで0.2%トリトン)。
- 20分間室温でチューブを回転させます(これはすべてのオルガノイドが懸濁液に残ることを保証します)。
- オルガノイドを300xgで2分間ペレットし、その後上清を廃棄する。
- 500μLのブロッキング溶液(材料表参照)でオルガノイドを穏やかに再中断し、2 mLマイクロ遠心管に移します。
- シェーカーで室温で20分間インキュベートします。オルガノイドが重力によってチューブの底に落ち着くようにします。ブロッキング溶液を一次抗体溶液(材料の表を参照)に置き換え、室温で1~2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。
- 0.1%のツエンを含むPBSで3倍を洗浄します。オルガノイドは毎回落ち着き、上清を取り除きます。
- 二次抗体溶液(材料表参照)を追加し、室温で2時間インキュベートします。
- 0.1%のツエンを含むPBSで3倍を洗浄します。3回目の洗浄後に50μLのPBSを残します。
- スライド上のPBSの50 μLに懸濁したオルガノイドをピペで取り付けます。余分なPBSを取り外し、取り付け剤のドロップを追加し(材料の表を参照)、上部にカバースリップを追加します。側面をマニキュアで密封し、乾燥させます。
6. オルガノイドからの卵母細胞の分離
- 新たに形成された卵嚢胞をオルガノイ状の内膜から分離する。
メモ：卵嚢胞は、卵嚢分離キットを用いて免疫磁気分離によってオルガノイドから単離される(材料の表)を以下に説明する変更を加えた。単離された卵胞は、免疫蛍光および電子顕微鏡検査によって分析することができる。- OMDで5~7日間維持され、未感染で1日間感染し、5日間感染した分化オルガノイドから始めます。最初の 2 つを負のコントロールとして使用します。
注:我々は、分化オルガノイドが肺または拡張腸オルガノイド10よりも多くの卵胞を産生することを見出した。 - 15 mL遠心管にオルガノイドを集めます。3,000 x gおよび10 °Cで20分間オルガノイドを遠心分離する。
注:この高速は、壊れる可能性のあるオルガノイドから卵胞が失われないようにするために必要です。 - オルガノイドメディアを取り外し、5mLの水に置き換えます。
- 火磨かれたガラスパスツールピペットで激しいピペットを繰り返すことによってオルガノイドを破壊します。
- 塊が見える場合は、オルガノイド懸濁液をガラスに移し、オルガノイドが十分に破壊されるまで均質化する。ダウンスホモジナイザーは、卵胞に影響を与えない。
- 目に見える塊が見えなくなったら、卵嚢分離キットから5 mLのバッファーAを追加します。混合し、抗卵嚢胞IgMでコーティングされた磁気ビーズの120 μLを追加します。
- ロッカープラットフォーム上で連続混合して、室温で2時間セルサスペンションと磁気ビーズをインキュベートします。
- インキュベーションの最後に、15 mLチューブ用に設計された磁気分離ラックに細胞とビーズを含むチューブを置きます。
- 磁気分離ラックのチューブを手動で3分間回転させます。ビーズは磁石の隣のチューブの側面に付着します。
- 慎重に、10 mLピペットで、ビーズから上清を取り除きます。ビーズをバッファBの450μLで再中断し、1.5 mLマイクロ遠心管に移します。
注:卵嚢胞の単離が確認されるまで上清を保つ。 - 残りのビーズと卵胞を回収するには、バッファBの450 μLで15mLチューブを洗浄し、マイクロ遠心管の磁気ビーズにこの洗浄を追加します。
- 手順 6.1.11 をもう一度繰り返します。すべてのビーズと捕捉された卵胞は、マイクロ遠心管に移されるべきである。
- マイクロ遠心管をマイクロ遠心管を保持するために設計された磁気分離ラックに置きます。
- 磁気分離ラック内のチューブを3分間手で回転させます。
- ピペットで上清を慎重に取り外し、新しいチューブに入れます。
注:卵嚢胞の単離が確認されるまで上清を保つ。 - 磁気分離ラックから磁気ビーズと卵母細胞を含むマイクロ遠心管を取り外します。
- 磁気ビーズに0.1 N HClの100 μLを加え、ビーズから卵母細胞を溶出させます。30sのための渦。
注:渦器は最高速度よりわずかに小さいに設定する必要があります。 - ビーズを0.1N HClで10分間室温でインキュベートします。
- 再び渦。次に、チューブを磁気分離ラックに戻します。ビーズがチューブの側面に付着するのを待ってから、上清を新しいマイクロ遠心管に移します。
- 手順 6.1.17 から 6.1.19 を繰り返し、2 番目の溶出物を最初の溶出物と組み合わせます。
- 溶出液を1N NaOHの20μL、または1Mトリス、pH8などの別の中和バッファーで中和する。
- 卵母細胞を数えるには、溶出剤の10μLを取り、10 μLの卵母細胞特異的抗体(材料表参照)と組み合わせ、発細胞計で蛍光卵母体を数えます。
注:単離された卵母細胞は4°Cで貯えることができるか、または免疫蛍光または電子顕微鏡イメージ投射のためにすぐに使用することができる。
- OMDで5~7日間維持され、未感染で1日間感染し、5日間感染した分化オルガノイドから始めます。最初の 2 つを負のコントロールとして使用します。
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Representative Results
ここで提示されるプロトコルは、マイクロインジェクションの準備ができて卵母細胞およびスポロゾイツ(図1A)の効率的な精製をもたらす。排泄プロトコルは、約70~80%の卵胞からスポロゾイツを放出するので、残りの卵胞および貝殻を3μmフィルターを通してフィルタリングすることが不可欠である。濾過は、ほぼ100%のスポロゾイテ精製をもたらす(図1B)。さらに、緑色色素の添加は、すべてのオルガノイドの注入を確実にするのに役立ち、注射後少なくとも24時間の注入されたオルガノイドの可視化を可能にする(図2B)。
卵胞子およびスポロゾイツの調製のためのこれらのプロトコルは簡単で、長年にわたり使用されてきたので、処理された卵胞子および精製されたスポロゾイトは生存可能で感染性であることが期待される。しかし、我々の研究では、排泄プロセスがスポロゾイトまたは卵胞子に損傷を与えないことを確認するために、走査型電子顕微鏡を使用しました(図2A)10。オルガノイ状腔への同量の卵胞の注入は、単純な顕微鏡イメージングによって視覚的に確認することができる(図2C)。感染したオルガノイドの一部は、我々が10を説明したように定量的なPCRによって寄生虫の伝播を確認するために設定されるべきである。
寄生虫のライフサイクルを通じた進歩は、感染後の感染後の異なる時点での感染したオルガノイドの収集と、感染後の電子顕微鏡による分析、または4',6-diamidino-2-フェニリンドール(4',6-diamidino-2-フェニリンドール()DAPI)寄生虫核の染色10.例えば、gp40およびgp1517のようなメロゾイテ表面抗原に対する抗体は、メロン期を同定するために使用することができる。タイプIメロンは8核とタイプIIメロン、4核10を持つことになります。近年、トロホゾイツ、メロゾイト、II型メロン、およびマクロガモントに特異的なモノクローナル抗体のパネルが利用可能になった18。これらの抗体はまた、オルガノイドの様々なライフサイクル段階を通じて寄生虫の進行をマーキングするのに非常に有効であろう。
免疫蛍光アッセイは、クリプトスポリジウムによって感染している細胞の種類を調べるためにも使用できます。これは、呼吸器クリプトスポリジオシスについてほとんど知られておらず、寄生虫の正確な宿主細胞は知られていなかったので、気道オルガノイドで見ることは特に重要でした。クラブ細胞のマーカーであるクリプトスポリジウム感染オルガノイドに関する免疫蛍光アッセイを行い、クリプトスポリジウムがCC10陰性細胞と陽性細胞の両方に感染していることを発見しました(図3)。これらの結果は、我々は気道オルガノイド10でクリプトスポリジウム感染分泌および非分泌細胞を観察したTeMによって裏付けられた。
分化されたオルガノイドが5日間感染した後、かなりの数の卵胞が産生されるはずです。私たちの手の中では、1つの6ウェルプレートからのオルガノイドの感染は約4000の卵胞を生み出し、これは容易に同定され、卵嚢特異的抗体を標識することによって血球計に数えることができました。卵嚢胞中の4つのスポロゾイテスの存在は、卵胞の一部を接着剤スライド上で乾燥させ、メタノールで固定し、DAPI染色を卵嚢特異的抗体と組み合わせることによって確認することができる(図4)。厚い壁状の卵胞の生産の検証は、TEM分析10によって行うことができた。
図1:クリプトスポリジウム卵胞およびスポロゾイツの調製および精製(A)感染に対する卵胞およびスポロゾイテ製剤に用いられる方法の概略表現。(B)卵嚢胞のインビトロ排泄を示す画像。無焼き卵母細胞および貝殻の濾過は、スポロゾイツの精製溶液を与える。スケールバー = 10 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:オルガノイド内膜への卵胞のマイクロインジェクション。この図は Heo et al.10から変更されています。(A)卵胞およびスポロゾイツの電子顕微鏡(SEM)画像をスキャンする。(B)卵嚢注射オルガノイドを示す画像。緑色の色素は、各オルガノイドの注入を視覚化するのに役立ち、少なくとも24時間にわたって持続する(C)卵胞を注入したオルガノイドの画像。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:クリプトスポリジウム-感染気道オルガノイドの免疫蛍光画像。ムチンはオルガノイドの内膜に抗ムシン5抗体(赤色)で標識され、クラブ細胞は抗CC10(黄色)で標識され、クリプトスポリジウムは卵嚢特異的抗体(緑色)で検出され、細胞核はDAPI(青色)で染色される。パネルBは、パネルAの正方形に示された領域の拡大です。
図4:分化腸オルガノイドから単離された卵胞の免疫蛍光画像。ウーシスト壁は緑色のウーシスト特異的抗体で標識され、4つのスポロゾイテ核はDAPI(青)で可視化され、この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
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Discussion
腸および気道オルガノイドにおけるクリプトスポリジウム寄生虫の培養は、宿主寄生虫相互作用10を研究するための正確なモデルを提供するが、他にも多くの用途を有する。例えば、遺伝子組み換えクリプトスポリジウム寄生虫を選択して伝播する現在の方法は、生体内感染に不可欠な改変を有する寄生虫の単離を許可しないマウス19の通過を必要とする。クリプトスポリジウムのオルガノイド培養は、この手順に代わるものである。しかし、我々は、電ポレートされたスポロゾイトが一緒に集まり、マイクロピペットをブロックすることを指摘しました。遺伝子組み換え寄生虫を選択する目的で、オルガノイドは、トランスフェクトされたスポロゾイツとの感染を可能にするために、分化条件下で2次元形式でコラーゲンコーティングトランスウェル上で成長することができ、その結果、遺伝子組み換えの卵胞子。トランスウェルは頂点および浴盤の表面へのアクセスを可能にし、長期間安定している。
現在、がん組織由来オルガノイド(未発表データ)に対する薬剤の高スループットスクリーニングのための2次元形式でオルガノイドを培養しています。オルガノイド培養のこの方法はまた、遺伝子改変ルシフェラーゼタグクリプトスポリジウム株19を用いて抗クリプトスポリジウム薬の試験に適応することができる。さらに、感染が密接に同期していないにもかかわらず、スポロゾイトを用いたオルガノイドの感染は、特定のライフサイクル段階に対する薬剤の有効性を検査できるライフサイクルの十分な同期を提供する。
オルガノイド共培養システムは、微生物叢および免疫細胞20などの宿主系のいくつかの他の側面を考慮して開発されている。したがって、寄生虫と宿主細胞、免疫細胞および微生物叢との間の相互作用を解剖する能力は、すぐにインビトロで可能になるだろう。クリプトスポリジウムの遺伝子操作も可能になりました19,クリプトスポリジウムとオルガノイド培養の蛍光レポーター株の組み合わせは、感染細胞の単一細胞シーケンシングのためのツールを提供します, そして、寄生虫の特定の段階に感染した細胞のより具体的には単一細胞シーケンシング。
ここで説明する実験の成功は、卵胞の生存率および感染性に大きく依存する。クリプトスポリジウム卵嚢胞の異なるバッチは、宿主細胞に感染する排泄率および能力において大きく異なる。スポロゾイツの十分な収率は良好な排泄率に依存し、排泄率は常に感染性に相関するとは限らない。低レベルの感染または不十分な排泄が卵胞の特定のバッチで観察された場合、時間と労力は、卵胞数を増加させようとするのではなく、新しい多くの卵胞子を得ることによって節約されるか、または潜伏時間を長くする。
オルガノイド培養培養培養培養は、毎日更新する必要があります。オルガノイド培養物の以前の通路の使用をお勧めします。オルガノイド培養の健康が寄生虫の生存率を大きく決定するにつれて、オルガノイドが後の通路で区別し始める場合は、オルガノイドの新しいバイアルを解凍することが重要です。感染後、オルガノイドメディアは、メディアに有毒物質の蓄積を避けるために毎日リフレッシュする必要があります。
クリプトスポリジウムのオルガノイド培養は、寄生虫が無期限に伝播することができないという点で制限されており、感染は28日間10日にわたって3回の経過後にピーターアウトする。我々が説明したように、マウス実験のための十分なオルガノイドのマイクロインジェクションは、時間がかかり、物理的に課税することができます。それにもかかわらず、現在までに、ヒト感染を完全に代表するインビトロシステムにおける完全なライフサイクルを可能にする他の方法はなく、また、宿主病原体相互作用の探索を可能にする培養システムも記載されていない。呼吸器感染症。クリプトスポリジウムのオルガノイド培養は、クリプトスポリジウムではこれまで不可能だった宿主寄生虫相互作用への探査の道を開く強力な新しいツールを提供します。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
アリゾナ大学ツーソン校(アリゾナ州)の動物比較生物医学部のデボラ・A・シェーファー氏に感謝しています。我々はまた、孤立したオルガノイド卵胞のTEM調製およびイメージングのためにワシントン州立大学のフランチェスキ顕微鏡・画像センターとD.L.マレンドーアに感謝する。
D.D.は、オランダ科学研究機構(NWO-ALW, 016.Veni.171.015)からのVENI助成金の受領者です。I.H.は、オランダ科学研究機構(NWO-ALW,863.14.002)からのVENI助成金の受領者であり、欧州委員会(提案330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF)のマリー・キュリー・フェローシップによって支援されました。これらの結果につながる研究は、ERCアドバンスト補助金契約第67013号の欧州研究評議会から、およびR21 AT009174の下でNIH NIAIHからRMOに資金を受けています。この研究は、オランダ癌協会の一部が資金提供を受け、オランダ癌協会の助成金を受けたOncode研究所の一部です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Basement membrane extract (extracellular matrix) | amsbio | 3533-010-02 | |
| Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) | Waterborne, Inc | A400FLR-1X | Final Concentration = Use 2-3 drops/slide |
| Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads | Waterborne, Inc | IMS400-20 | |
| Dynamag 15 rack | Thermofisher Scientific | 12301D | |
| Dynamag 2 rack | Thermofisher Scientific | 12321D | |
| EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm | EMD-Millipore | TSTP02500 | |
| Fast green dye | SIGMA | F7252-5G | |
| Femtojet 4i Microinjector | Eppendorf | 5252000013 | |
| Glass capillaries of 1 mm diameter | WPI | TW100F-4 | |
| Matrigel (extracellular matrix) | Corning | 356237 | |
| Microfuge tube 1.5 mL | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Micro-loader tips | Eppendorf | 612-7933 | |
| Micropipette puller P-97 | Shutter instrument | P-97 | |
| Normal donkey Serum | Bio-Rad | C06SB | |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | |
| Sodium hypoclorite (use 5%) | Clorox | 50371478 | |
| Super stick slides | Waterborne, Inc | S100-3 | |
| Swinnex-25 47 mm Polycarbonate filter holder | EMD-Millipore | SX0002500 | |
| Taurocholic acid sodium salt hydrate | SIGMA | T4009-5G | |
| Tween-20 | Merck | 8221840500 | |
| Vectashield mounting agent | Vector Labs | H-1000 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries, Inc | SI0236 | |
| Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes) | Final amount | ||
| DMEM | Invitrogen | 12634-010 | 500 mL |
| Penstrep | Gibco | 15140-122 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Glutamax | Gibco | 35050038 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| Hepes | Gibco | 15630056 | 5 mL of stock in 500 mL DMEM |
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media) | Final concentration | ||
| A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 0.5 µM |
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 1x |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Gastrin | Tocris | 3006-1mg | 10 nM |
| NAC | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| NIC | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
| Noggin CM | In house* | 10% | |
| P38 inhibitor (SB202190) | Sigma | S7076-25 mg | 10 µM |
| PGE2 | Tocris | 2296/10 | 10 nM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1 mL/500 mL media |
| RSpoI CM | In house* | 20% | |
| Wnt3a CM | In house* | 50% | |
| In house* - cell lines will be provided upon request | |||
| INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media) | To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME) | ||
| LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media) | Final concentration | ||
| Adv+++ | make up to 100 mL | ||
| ALK-I A83-01 | Tocris | 2939-50mg | 500 nM |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | 0.0763888889 |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 25 ng/mL |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9125-25G | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 5 mM |
| Noggin UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| p38 MAPK-I | Sigma | S7076-25 mg | 1 µM |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 1:500 |
| RhoKI Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817_100 mg | 2.5 µm |
| Rspo UPE | U-Protein Express | Contact company directly | 10% |
| Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection) | Final concentration | ||
| L-Glutathione reduced | Sigma | G4251-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Betaine | Sigma | 61962 | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-2.5G | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Linoleic acid | Sigma | L1376-10MG | 6.8 μg/mL of OME/OMD /LOM |
| Taurine | Sigma | T0625-10MG | 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM |
| Blocking buffer (for immunoflourescence staining) | Final concentration | ||
| Donkey/Goat serum | Bio-Rad | C06SB | 2% |
| PBS | Thermo-Fisher | 70011044 | Make up to 100 mL |
| Tween 20 | Merck | P1379 | 0.1% |
| List of Antibodies used | |||
| Alexa 568 goat anti-rabbit | Invitrogen | A-11011 | Dilution-1:500; RRID: AB_143157 |
| Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo | Waterborne, Inc | A400FLK | Dilution- 1:200 |
| Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive | Waterborne, Inc | IMS400-20 | Dilution-1:500 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Dilution-1:1,000; RRID : AB_2629482 |
| Phalloidin-Alexa 674 | Invitrogen | A22287 | Dilution-1:1,000; RRID: AB_2620155 |
| Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). | Upon request | Upon request | Dilution-1:500 |
| Sporo-Glo | Waterborne, Inc | A600FLR-1X | Dilution- 1:200 |
References
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