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Immunology and Infection

माइक्रोइंजेक्शन द्वारा 3 डी ऊतक व्युत्पन्न मानव ऑर्गनॉइड संस्कृति प्रणालियों में क्रिप्टोस्पोरिडियम संक्रमण का अध्ययन

Published: September 14, 2019 doi: 10.3791/59610
Automatic Translation
1, 1,3, 2
1Hubrecht Institute, Oncode Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), UMC Utrecht, 2Veterinary Microbiology and Pathology, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 3Janssen Pharmaceutica

Summary

हम क्रिप्टोस्पोरिडियम पार्वम द्वारा मानव आंतों और वायुमार्ग organoids के संक्रमण का अध्ययन करने के लिए oocysts तैयार करने और sporozoites शुद्ध करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन। हम आंतों organoid लुमेन और organoids के इम्यूनोस्टेनिंग में परजीवी के माइक्रोइंजेक्शन के लिए प्रक्रियाओं का प्रदर्शन. अंत में, हम organoids से उत्पन्न oocysts के अलगाव का वर्णन.

Abstract

क्रिप्टोस्पोरिडियम पार्वम मानव दस्त रोग के प्रमुख कारणों में से एक है। परजीवी की विकृति को समझने और कुशल दवाओं को विकसित करने के लिए, एक इन विट्रो संस्कृति प्रणाली जो मेजबान में स्थितियों को फिर से दोहराती है, की आवश्यकता है। Organoids, जो बारीकी से अपने मूल के ऊतकों के समान, मेजबान परजीवी बातचीत का अध्ययन करने के लिए आदर्श होते हैं. Organoids तीन आयामी (3 डी) ऊतक व्युत्पन्न संरचनाओं जो वयस्क स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त कर रहे हैं और किसी भी आनुवंशिक विपथन या परिवर्तन के दौर से गुजर के बिना समय की विस्तारित अवधि के लिए संस्कृति में विकसित कर रहे हैं. वे दोनों शीर्ष और basolateral सतहों के साथ अच्छी तरह से परिभाषित ध्रुवता है. Organoids दवा परीक्षण, जैव बैंकिंग, और रोग मॉडलिंग और मेजबान microbe बातचीत अध्ययन में विभिन्न अनुप्रयोगों है. यहाँ हम मानव आंतों और airway organoids को संक्रमित करने के लिए क्रिप्टोस्पोरिडियम के oocysts और sporozoites तैयार करने के लिए कैसे की एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। फिर हम यह प्रदर्शित करते हैं कि सूक्ष्मजीवको अंगाभ लुमेन में सूक्ष्मजीवों को इंजेक्ट करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग कैसे किया जा सकता है। वहाँ तीन प्रमुख तरीकों जिसके द्वारा organoids मेजबान microbe बातचीत अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-माइक्रोइंजेक्शन, यांत्रिक कतरनी और चढ़ाना, और मोनोलेयर बनाकर. माइक्रोइंजेक्शनिंग 3 डी संरचना के रखरखाव में सक्षम बनाता है और परजीवी मात्रा और रोगाणुओं के लिए प्रत्यक्ष शीर्ष पक्ष संपर्क के सटीक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है। हम या तो इमेजिंग या oocyst उत्पादन के लिए organoids के इष्टतम विकास के लिए विवरण प्रदान करते हैं. अंत में, हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि कैसे नव उत्पन्न oocysts आगे बहाव प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए organoid से अलग किया जा सकता है.

Introduction

क्रिप्टोस्पोरिडियम संक्रमण के उपचार और रोकथाम के लिए दवाओं या टीकों का विकास इन विट्रो प्रणालियों की कमी के कारण बाधित हुआ है जो मनुष्यों में विवो स्थिति की ठीक तरह से नकल करते हैं1,2. वर्तमान में उपलब्ध प्रणालियों में से कई या तो केवल अल्पकालिक संक्रमण की अनुमति देते हैं (lt;5 दिन) या परजीवी3,4के पूर्ण जीवन चक्र का समर्थन नहीं करते . अन्य प्रणालियां जो परजीवी के पूर्ण विकास को सक्षम करती हैं, अमर कोशिका रेखाओं या कैंसर कोशिका रेखाओं पर आधारित होती हैं जो मनुष्यों में शारीरिक स्थिति को ईमानदारी से पुन: प्राप्त नहीं करती हैं5,6,7 . Organoids या 'मिनी अंगों' 3 डी ऊतक व्युत्पन्न संरचनाओं जो एक extracellular मैट्रिक्स विभिन्न ऊतक विशिष्ट विकास कारकों के साथ पूरक में बड़े हो रहे हैं. ऑर्गेनोइड्स को विभिन्न अंगों और ऊतकों से विकसित किया गया है। वे आनुवंशिक रूप से स्थिर हैं और अपने मूल के अंगों के अधिकांश कार्यों recapitulate, और समय की विस्तारित अवधि के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है. हमने क्रिप्टोस्पोरिडियम के साथ मानव आंतों और फेफड़ों के organoids को संक्रमित करने के लिए एक विधि विकसित की है जो आंतों और श्वसन क्रिप्टोस्पोरिडोसिस के लिए प्रासंगिक मेजबान-परजीवी बातचीत के अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल में सटीक प्रदान करता है8 9,10,11,12,13. अन्य प्रकाशित संस्कृति मॉडल के विपरीत, organoid प्रणाली वास्तविक जीवन मेजबान परजीवी बातचीत के प्रतिनिधि है, जीवन चक्र के पूरा होने के लिए इतना है कि परजीवी जीवन चक्र के सभी चरणों का अध्ययन किया जा सकता है की अनुमति देता है, और परजीवी प्रसार बनाए रखता है 28 दिनों तक10के लिए |

क्रिप्टोस्पोरिडियम पार्वम एक ऐपीकॉम्प्लेन्चलियन परजीवी है जो श्वसन और आंतों के ट्रैक्ट के उपकला को संक्रमित करता है, जिससे लंबे समय तक दस्त रोग होता है। प्रतिरोधी पर्यावरण चरण oocyst है, दूषित भोजन और पानी में पाया14. एक बार ingested या साँस, oocyst excysts और चार sporozoites कि उपकला कोशिकाओं को देते हैं विज्ञप्ति. Sporozoites मेजबान कोशिकाओं पर सरकना और मेजबान सेल रिसेप्टर्स संलग्न है, लेकिन परजीवी पूरी तरह से सेल पर आक्रमण नहीं करता है, और यह15को घेरने के लिए मेजबान सेल प्रेरित करने के लिए प्रकट होता है. परजीवी, जो एक इंट्रासेल्यूलर लेकिन एक्स्ट्रासाइटोप्लाज्मिक डिब्बे के भीतर internalized है, कोशिका की शीर्ष सतह पर रहता है, एक परजीवी धानी के भीतर नकल. यह अलैंगिक प्रजनन के दो दौर से गुजरता है- एक प्रक्रिया जिसे मेरोफोनी कहा जाता है। मेरोजनी के दौरान, प्रकार मैं meronts विकसित जो आठ merozoites कि नई कोशिकाओं पर आक्रमण करने के लिए जारी कर रहे हैं होते हैं. ये merozoites चार merozoites युक्त प्रकार द्वितीय meronts में विकसित करने के लिए नई कोशिकाओं पर आक्रमण। ये मेरोजोइट, जब जारी किए जाते हैं, कोशिकाओं को संक्रमित करते हैं और मैक्रोगैमोंट और माइक्रोगामोंट में विकसित होते हैं। माइक्रोगेमेट्स जारी किए जाते हैं और ओसिस्टों में परिपक्व होने वाले युग्मनज का उत्पादन करने वाले मैक्रोगेम्स को उपजाऊ बनाते हैं। परिपक्व oocysts बाद में लुमेन में जारी कर रहे हैं. Oocysts या तो पतली दीवारों जो तुरंत उपकला को पुन: संक्रमित करने के लिए excyst हैं, या मोटी दीवारों जो पर्यावरण में जारी कर रहे हैं अगले मेजबान14को संक्रमित करने के लिए. क्रिप्टोस्पोरिडियम जीवन चक्र के सभी चरणों की पहचान हमारे समूह10द्वारा पहले विकसित organoid संस्कृति प्रणाली में की गई है .

चूंकि मानव organoids ईमानदारी से मानव ऊतकों को दोहराने9,11,13, और क्रिप्टोस्पोरिडियम10के सभी प्रतिकृति चरणों का समर्थन , वे आदर्श ऊतक संस्कृति प्रणाली का अध्ययन करने के लिए कर रहे हैं क्रिप्टोस्पोरिडियम जीव विज्ञान और मेजबान परजीवी बातचीत। यहाँ हम दोनों क्रिप्टोस्पोरिडियम oocysts और excysted sporozoites के साथ organoids को संक्रमित करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन है, और इस ऊतक संस्कृति प्रणाली में उत्पादित नए oocysts अलग.

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Protocol

सभी ऊतक हैंडलिंग और लकीर रोगी सहमति के साथ संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत किया गया था।

1. इंजेक्शन के लिए सी parvum Oocysts की तैयारी

नोट: क्रिप्टोस्पोरिडियम oocysts एक वाणिज्यिक स्रोत से खरीदे गए थे (सामग्री की मेजदेखें). इन oocysts बछड़ों में उत्पादित कर रहे हैं और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) में जमा हो जाती है। वे 4 डिग्री सेल्सियस पर के बारे में 3 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है और जमे हुए कभी नहीं किया जाना चाहिए। हम आम तौर पर एक महीने के भीतर oocysts का उपयोग करें. organoids या तो बरकरार oocysts से संक्रमित किया जा सकता है, या sporozoites excysted oocysts से अलग किया जा सकता है और organoids को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया अगर यह महत्वपूर्ण है कि ओसिस्टों मूल inoculum से ले जाने के लिए नहीं है।

  1. कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए क्रिप्टोस्पोरिडियम ओसिस्ट तैयार करें (चित्र 1क)
    1. सभी जोड़तोड़ भर में बर्फ पर oocysts रखें जब तक वे organoids में जोड़ रहे हैं.
    2. organoids की एक पूर्ण छह अच्छी तरह से थाली के लिए आवश्यक oocysts की संख्या की गणना (आमतौर पर के बारे में 5 x 105-2.5 x 105 थाली के लिए). मात्रा को सत्यापित करने और एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरण करने के लिए एक हेमोसाइटोमीटर में oocysts की संख्या की गणना करें।
      नोट: दृश्य में सहायता करने के लिए, oocysts एक oocyst-विशिष्ट फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ मिश्रित किया जा सकता है (सामग्री की मेजदेखें) हेमोसाइटोमीटर पर लोड किया जा रहा से पहले. फ्लोरोफोर-लेबल वाले ओसिस्टों को फिर आसानी से कल्पना की जा सकती है और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके गणना की जा सकती है। हम लगभग 100-1,000 oocysts/organoid इंजेक्शन लगाने का सुझाव देते हैं। सामान्य तौर पर, 1,000-2,000 organoids एक छह अच्छी थाली में उगाया जा सकता है.
    3. पीबीएस के साथ 900 डिग्री सेल्सियस तक oocysts निलंबन की मात्रा लाओ। सोडियम हाइपोक्लोराइट (जैसे, क्लोरॉक्स) ब्लीच (4 डिग्री सेल्सियस पर) के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। बर्फ पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8,000 x g पर एक microcentrifuge में 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। कैप खोलने के साथ अपकेंद्रण में ट्यूब को आवक का सामना करना पड़ रहा है। गोली तो जानने के लिए जहां परजीवी ट्यूब में छर्रने है देखने के लिए मुश्किल हो सकता है आवश्यक है.
    5. गोली से बचने के लिए सावधान किया जा रहा एक पिपेट के साथ supernatant निकालें. मिश्रण करने के लिए Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) और भंवर के 1 एमएल जोड़ें.
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8,000 x g पर एक microcentrifuge में 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    7. दो बार DMEM के साथ washes दोहराएँ.
    8. विस्तार माध्यम (OME) या विभेदन organoid माध्यम (OMD) जो करने के लिए taurocholate 0.5% (w/v) की एक अंतिम एकाग्रता में जोड़ा गया है तैयार (सामग्री की तालिकादेखें). Taurocholate हमेशा तैयार किया जाना चाहिए और ताजा जोड़ा.
      नोट: हम सफलतापूर्वक हमारे संक्रमण assays में 0.5% taurocholate का इस्तेमाल किया है जहां inoculum बरकरार oocysts है, और मेजबान कोशिकाओं पर हानिकारक प्रभाव के बिना संक्रमण की बेहतर दरों को देखा. हालांकि, taurocholate कोशिकाओं पर अप्रत्याशित प्रभाव हो सकता है, और कम सांद्रता संक्रमण परख16में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है.
    9. ऑर्गेण्ॉइड संस् कृति मध् यम के 100 ल् में ऊसिस्टों को 0ण् 5% (व् व्) सोडियम टाउरोकोलेट के साथ पूरक किया जाता है। योरसिस्ट्स को पुनः ः ः स्याल 1.1.2 में वर्णित है.
    10. इंजेक्शन कल्पना करने के क्रम में निलंबन के लिए फास्ट ग्रीन डाई जोड़ें.
    11. माइक्रो-लोडर युक्तियाँ भरें (सामग्री की तालिकादेखें) oocyst निलंबन के साथ और इसे का उपयोग करने के लिए खींच ामाल केशिकाओं को भरने के लिए.
      चेतावनी: पूरी प्रक्रिया स्तर-2 सुरक्षा प्रोटोकॉल के साथ एक ऊतक संस्कृति हुड में किया जाना चाहिए. मास्क के उपयोग की सिफारिश की जाती है क्योंकि क्रिप्टोस्पोरिडियम oocysts भी संक्रामक हो सकता है जब हवाई।

2. विट्रो शुद्धीकरण में सी पार्वम Oocysts से Sporozoites के

  1. ऊपर बताए गए ब्लीच को ब्लीच करने और धोने के बाद सी पार्वुएम ओसिस्टसे से स्पोरोजोइट्स को शुद्ध करें।
    1. एक 15 एमएल ट्यूब के लिए oocysts स्थानांतरण. कमरे के तापमान excystation माध्यम में oocysts resuspend (0.75% w/v सोडियम taurocholate DMEM में) प्राप्त करने के लिए 1 x 107 oocysts / टाउरोकोलेट के अलावा oocysts के excystation दर में सुधार, sporozoite उपज में सुधार.
    2. 1-1.5 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ओसिस्ट निलंबन।
    3. एक्ससाइट्स्टेशन की सीमा के लिए नमूने की सूक्ष्म रूप से जांच करें; 60-80% excystation sporozoites की अच्छी वसूली के लिए उचित है. यदि एक्ससाइट्व्हन का स्तर कम है, तो लंबे समय तक इनक्यूबेट करें (एक और 30 मिनट से 1 ज)।
    4. शुंडक शुरु होने की संख्या के सापेक्ष प्रतिशत एक्ससाइट्वन निर्धारित करें। Excystation के रूप में गणना की है:
      % excystation [ [1 ] (अपूर्व oocysts की संख्या /
    5. पीबीएस या मध्यम के 14 एमएल जोड़कर excystation अभिकर्मकों को दूर करने के लिए कोशिकाओं को धो लें, मिश्रण, और कोशिकाओं को ठीक करने (निष्क्रिय oocysts, oocyst गोले, और sporozoites) 20 मिनट के लिए 20 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा 20 मिनट के लिए sporozoites ठीक करने के लिए। कोशिकाओं को खोने से बचने के लिए सावधानी से प्रेरित करें।
    6. 3 x 107 oocysts/mL (शुरू oocysts शुरू करने की संख्या के आधार पर) प्राप्त करने के लिए DMEM के 1-2 एमएल में sporozoite गोली को पुन: निलंबित।
    7. शेष oocysts और गोले को दूर करने के लिए, एक 3 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से निलंबन फिल्टर (चित्र 1B). एक 47 मिमी फिल्टर धारक एक 10 एमएल सिरिंज बैरल से जुड़ी पॉली कार्बोनेट फिल्टर (3 डिग्री मीटर pores आकार) के साथ फिट उपकरण का प्रयोग करें। एक 15 एमएल ट्यूब के शीर्ष पर फिल्टर धारक उपकरण रखें. एक बर्फ बाल्टी में या ठंडे कमरे में विधानसभा रखें.
    8. फिल्टर विधानसभा के लिए sporozoite निलंबन के 7.5 एमएल जोड़ें और गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से फिल्टर करने के लिए अनुमति देते हैं। DMEM के एक और 7.5 एमएल के साथ के माध्यम से धो लें.
      नोट: स्पोरोज़ोआइट अलगाव में सफलता सुनिश्चित करने के लिए ताजा oocysts और अच्छा excystation महत्वपूर्ण हैं. यदि बहुत सारे unexcysted oocysts हैं, निलंबन गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से प्रवाह नहीं होगा. सिरिंज पर दबाव लागू करने के माध्यम से unexcysted oocysts मजबूर कर सकते हैं. स्पोरोजोइट्स का माइक्रोइंजेक्शन ओसिस्टों की तुलना में अधिक चुनौतीपूर्ण है क्योंकि स्पोरोजोइट्स केशिका को अवरुद्ध कर सकते हैं। इससे बचने के लिए, हम sporozoites के साथ organoids इंजेक्शन जब एक व्यापक केशिका टिप बनाने की सलाह देते हैं. संक्रमण के पर्याप्त स्तर को प्राप्त करने के लिए, 2-4 बार sporozoites की संख्या oocysts से संक्रमित organoids की तुलना में प्रत्येक organoid में इंजेक्शन की जरूरत है.
    9. 20 मिनट के लिए एक झूलते बाल्टी रोटर का उपयोग कर 3,400 x ग्राम पर फ़िल्टरकिए गए sporozoite निलंबन सेंट्रीफ्यूज गोली sporozoites के लिए।
    10. OME या OMD organoid संस्कृति माध्यम के 50-100 डिग्री एल में पुन: निलंबित (सामग्री की तालिकादेखें ) 0.05% के साथ पूरक (w/v) फास्ट ग्रीन डाई और एल-ग्लूटाथियोन, betaine, एल-cysteine, linoleic एसिड और taurine युक्त कम करने बफर5 (देखें सामग्री की तालिका)
      नोट: बहुत लंबे समय के लिए oocysts incubating sporozoites और गरीब वसूली के lysis में परिणाम हो सकता है और इसलिए बचा जाना चाहिए.

3. माइक्रोइंजेक्शन के लिए मानव आंत्र और फेफड़ों organoids के Vitro संस्कृति में

  1. संस्कृति आंत्र organoids विस्तार और भेदभाव मीडिया की स्थिति के तहत.
    नोट:    आंतों और फेफड़ों organoid संचरण के विवरण पहले अन्य लेख में वर्णित किया गया है8,13(देखेंसामग्री की तालिकामीडिया व्यंजनों के लिए). यहाँ, हम संक्षेप में के लिए अनुकूलन के लिए विशिष्ट संदर्भ के साथ organoid संस्कृति विधि का वर्णनCryptosporidiumइंजेक्शन और विकास. हमने पाया है कि organoids में परजीवी की इमेजिंग के लिए, organoids विस्तार माध्यम में बड़े हो रहे हैं उन लोगों के लिए बेहतर कर रहे हैं के रूप में वहाँ कम मलबे संचय है कि भिन्नता माध्यम में विकसित organoids में देखा से. हालांकि, अगर लक्ष्य oocysts को अलग करने के लिए है, भेदभाव मीडिया में उगाया organoids oocysts की अब तक उच्च संख्या का उत्पादन.
    1. 3D संस्कृतियों में अकोशिक मैट्रिक्स में organoids बनाए रखें (सामग्री की मेजदेखें) 37 डिग्री सेल्सियस पर. शीर्ष पर OME (विस्तार मीडिया) जोड़ें और हर दिन ताज़ा करें।
      नोट: फेफड़ों organoids के लिए, हम अलग विस्तार और भेदभाव मीडिया नहीं है.
    2. माइक्रोइन्सिंग के लिए विभाजित और प्लेट organoids के लिए, मानव organoids युक्त 6 अच्छी तरह से थाली से मीडिया को हटा दें और F12 + + ( सामग्री की मेजदेखें) अच्छी तरह से जोड़ने के लिए और एक 1 एमएल पिपेट टिप कई बार के साथ pipeting द्वारा मैट्रिक्स को तोड़ने। कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब (2 एमएल F12++ प्रति ट्यूब में एकत्रित करना आगे की प्रक्रियाओं के लिए पर्याप्त है)।
    3. एक और 15 एमएल ट्यूब में 10-12 एमएल एफ 12+ + जोड़ें और मानव आंतों और फेफड़ों के organoids को तोड़ने के लिए मध्यम, पिपेट ऊपर और नीचे 3 बार में एक आग पॉलिश ग्लास पाइप जगह है।
      नोट: एक लंबे कांच के पाइप (20-30 सेमी) का प्रयोग करें और इसे संक्षेप में आग-पॉलिश करें। organoids क्षतिग्रस्त हो सकता है क्योंकि खोलने (1 मिमी व्यास) बहुत छोटा मत करो. पाइप की नोक को कुछ समय के लिए आग-पॉलिश करके चिकना करें। organoids को 50 डिग्री मी के छोटे टुकड़ों में तोड़ें। फेफड़ों के organoids एक मोटा बाहरी झिल्ली है और इसलिए आंतों organoids की तुलना में कांच पिपेट के साथ मजबूत कतरनी की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, वे आंतों organoids की तुलना में एक धीमी वृद्धि दर है (प्रत्येक passaging के बीच 14 दिनों के लिए).
    4. F12 + + 5-7 एमएल तक जोड़ें और 5 मिनट के लिए 350 x g पर अपकेंद्रित्र।
      नोट: इस चरण में अपकेंद्रण गति सामान्य से अधिक होती है ताकि एक अच्छी कोशिका गोली हो जिसे बाह्यकोशिकमैट्रिक्स से अच्छी तरह अलग किया जा सके (सामग्री की सारणीदेखें )। हमने देखा है कि माउस छोटी आंत organoids की तुलना में, मानव छोटी आंत organoids को बाधित करने के लिए कठिन हैं.
    5. कोशिकाओं को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना माध्यम निकालें, फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखे मैट्रिक्स के साथ गोली को फिर से निलंबित करें; छ:कूप प्लेट के प्रति 200-300 र्ल मैट्रिक्स की आवश्यकता होती है। Organoids एक काफी उच्च कोशिका घनत्व बनाए रखने के लिए तीन में से एक विभाजित किया जाना चाहिए.
    6. एक छह अच्छी प्लेट के कुएं में प्रत्येक के बारे में 5-10 डिग्री सेल्सियस के मैट्रिक्स बूंदों में organoids प्लेट. 37 डिग्री सेल्सियस पर 20-30 मिनट के लिए इनक्यूबेट और फिर शीर्ष पर विस्तार माध्यम (OME) जोड़ें।
    7. माध्यम हर 2-3 दिन बदलें.
      नोट: लगभग 5-7 दिनों में, EM में बढ़ नेorganoids 100-200 $m के आकार तक पहुंच जाते हैं और इंजेक्शन के लिए तैयार होते हैं।
    8. organoids अंतर करने के लिए, EM में 5-6 दिनों के बाद, मीडिया भेदभाव मीडिया (डीएम) शर्तों को बदलने और परजीवी इंजेक्शन से पहले 5-6 अतिरिक्त दिनों के लिए रहते हैं.
      नोट: organoids के विस्तार के लिए, यह organoids घनी थाली करने के लिए सिफारिश की है. माइक्रोइंजेक्शन िंग के लिए, कम घनत्व पर प्लेट किए गए ऑर्गनॉइड्स के साथ छह-वेल प्लेट का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। उदाहरण के लिए, एक छह अच्छी तरह से थाली के तीन कुओं से प्लेट organoids माइक्रोइंजेक्शन के लिए एक पूर्ण छह अच्छी तरह से थाली में. मैट्रिक्स लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना चाहिए और उपयोग करने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर thawed. फेफड़ों के अंगों का विस्तार एक समान तरीके से किया जाता है लेकिन फेफड़ों के अंगाभ विशिष्ट मीडिया घटकों (सारणी 1)8 का उपयोग किया जाता है .

4. ऑर्गेनिड लुमेन में ओसिस्ट्स/स्पोरोजोइट्स का माइक्रोइंजेक्शन

  1. 3D organoid के शीर्ष पक्ष में सूक्ष्मरूप परजीवी (चित्र 2)।
    1. माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करके 1 मिमी व्यास के कांच केशिकाओं को तैयार करें।
      नोट: माइक्रोपिपेट पुलर पर उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स (सामग्री की तालिकादेखें ) हैं: हीट - 663, पुल ] 100, वेग ] 200, समय - 40 एमएस सेटिंग्स को एक विशेष मशीन के लिए उपयोगकर्ता निर्देशों के अनुसार समायोजित करने की आवश्यकता होगी।
    2. केशिका की नोक को संदके हुए से काटें। केशिका अंत के आकार/व्यास के बारे में 9-12 डिग्री उ उपाय; यह oocysts (4-5 डिग्री मीटर आकार) के आसान प्रवाह में सक्षम बनाता है।
    3. माइक्रो-लोडर युक्तियों का उपयोग करके oocyst या sporozoite निलंबन के साथ केशिकाएं भरें।
    4. एक माइक्रोइंजेक्टर पर oocyst से भरे केशिका लोड.
    5. 5x आवर्धन पर एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत प्रत्येक organoid में 100-200 nL निलंबन माइक्रोइंजेक्ट, दबाव स्थिर रखते हुए. माइक्रोइंजेक्शन के बाद, हर दिन ओमे या ओएमडी के साथ मीडिया को ताज़ा करें और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
      नोट: हम माइक्रोइंजेक्शन के लिए माइक्रोमैनिप्युलेटर का उपयोग नहीं करते हैं। हर नमूने में समान इंजेक्शन सुनिश्चित करने के लिए पूरे प्रयोग के लिए एक ही केशिका का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

5. ऑर्गेनोइड्स का इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग

  1. एक P1000 पिपेट के साथ organoids (1-2 x 24 कुओं) को एक 15 एमएल ट्यूब में जमा करें जिसमें ठंड F12++.
  2. 2 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर गोली organoids, गोली को बाधित किए बिना supernatant निकालें, और धीरे से शेष मात्रा में ढीला गोली पाइप.
  3. पीबीएस में 2% पैराफॉर्मेल्डिहाइड का 5 एमएल जोड़ें। organoids दीवार से चिपके रहने से रोकने के लिए ट्यूब उलटा नहीं है. organoids ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए और कमरे के तापमान पर 4 डिग्री सेल्सियस रात या 1 एच पर तय करने के लिए अनुमति दें।
  4. fixative निकालें और permebilization बफर के 10 एमएल जोड़ें (0.2% TRIton PBS में).
  5. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब घुमाएँ (यह सुनिश्चित करता है कि सभी organoids निलंबन में रहते हैं).
  6. 2 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर organoids गोली, और फिर supernatant त्याग दें.
  7. अंगाबों को 500 डिग्री सेल्सियस में धीरे-धीरे अवरुद्ध विलयन में पुन: स्फूर्ति देना (सामग्री की सारणीदेखें ) और 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  8. एक शेकर पर कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट। organoids गुरुत्वाकर्षण से ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें। अवरुद्ध समाधान को प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ बदलें (सामग्री की तालिकादेखें ) और कमरे के तापमान पर 1-2 ज के लिए या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  9. पीबीएस के साथ 3x धो0.1% ट्वीन युक्त. ऑर्गेनिड को हर बार व्यवस्थित होने दें और सुपरनेंट को हटा दें।
  10. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें ) और कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
  11. पीबीएस के साथ 3x धो0.1% ट्वीन युक्त. तीसरे धोने के बाद पीबीएस के 50 डिग्री सेल्सियस छोड़ दें।
  12. स्लाइड पर पीबीएस के 50 डिग्री एल में निलंबित organoids पाइपिंग द्वारा स्लाइड पर माउंट. अतिरिक्त पीबीएस निकालें, बढ़ते एजेंट की एक बूंद जोड़ने (सामग्री की तालिकादेखें) और शीर्ष पर कवरपर्ची जोड़ें. नेल पॉलिश के साथ पक्षों को सील और यह सूखी.

6. Organoids से Oocysts के अलगाव

  1. ऑर्गेनिड ल्यूमेन से नवगठित ओसिस्टों को अलग करें।
    नोट:    Oocysts एक oocyst अलगाव किट का उपयोग कर प्रतिरक्षाचुंबकीय जुदाई द्वारा organoids से अलग कर रहे हैं (देखेंसामग्री की तालिका) नीचे वर्णित संशोधनों के साथ. अलग oocysts तो इम्यूनोफ्लोरेसी और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है.
    1. 5-7 दिनों के लिए OMD में बनाए रखा गया है कि विभेदित organoids के साथ शुरू करो और कि uninfected हैं, 1 दिन के लिए संक्रमित और 5 दिनों के लिए संक्रमित. पहले दो को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करें.
      नोट: हमने पाया है कि विभेदित अंग फेफड़ों की तुलना में अधिक ओसिस्टों का उत्पादन करते हैं या आंतों के अंगों का विस्तारकरतेहैं .
    2. 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में organoids लीजिए. 3,000 x g और 10 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए organifuge.
      नोट: यह उच्च गति सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि कोई oocysts किसी भी organoids कि टूट सकता है से बाहर खो रहे हैं.
    3. organoid मीडिया निकालें और यह पानी के 5 एमएल के साथ बदलें.
    4. आग-पॉलिश ग्लास पेस्टर पिपेट के साथ बार-बार जोरदार पाइपिंग द्वारा organoids को बाधित करें।
    5. यदि क्लंप दिखाई दे रहे हैं, तो organoid निलंबन को एक गिलास में स्थानांतरित करें homogenizer, और homogenize जब तक organoids अच्छी तरह से बाधित कर रहे हैं. डेंगी homogenizer oocysts को प्रभावित नहीं करेगा.
    6. एक बार कोई दिखाई clumps रहे हैं, oocyst अलगाव किट से बफर ए के 5 एमएल जोड़ें. मिश्रण और फिर विरोधी oocyst आईजीएम के साथ लेपित चुंबकीय मोती के 120 डिग्री एल जोड़ें।
    7. एक रॉकर मंच पर निरंतर मिश्रण के साथ कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए सेल निलंबन और चुंबकीय मोती इनक्यूबेट करें।
    8. ऊष्मायन के अंत में, 15 एमएल ट्यूबों के लिए डिज़ाइन किए गए चुंबकीय पृथक्करण रैक पर कोशिकाओं और मोतियों से युक्त ट्यूबों को रखें।
    9. चुंबकीय जुदाई रैक में ट्यूबों मैन्युअल रूप से 3 मिनट के लिए घुमाएँ. मोती चुंबक के बगल में ट्यूब के पक्ष का पालन करेंगे.
    10. ध्यान से, एक 10 एमएल पिपेट के साथ, मोती से supernatant हटा दें। बफर बी के 450 डिग्री सेल्सियस में मोती को पुन: निलंबित करें और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: oocysts के अलगाव की पुष्टि की है जब तक supernatant रखें.
    11. किसी भी शेष मोती और oocysts इकट्ठा करने के लिए, बफर बी के 450 डिग्री एल के साथ 15 एमएल ट्यूब धोने और microcentrifuge ट्यूब में चुंबकीय मोती के लिए इस धोने जोड़ें।
    12. 6-1-11 एक बार चरण दोहराएँ. सभी मोती और कब्जा कर लिया oocysts अब microcentrifuge ट्यूब को स्थानांतरित किया जाना चाहिए.
    13. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब ों रखने के लिए डिज़ाइन किए गए चुंबकीय पृथक्करण रैक पर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें।
    14. 3 मिनट के लिए हाथ से चुंबकीय जुदाई रैक में ट्यूब घुमाएँ.
    15. ध्यान से एक नई ट्यूब में एक पिपेट के साथ supernatant हटा दें.
      नोट: oocysts के अलगाव की पुष्टि की है जब तक supernatant रखें.
    16. चुंबकीय जुदाई रैक से चुंबकीय मोती और oocysts युक्त microcentrifuge ट्यूब निकालें.
    17. 0ण्1 एन एच सीएल के 100 डिग्री सेल्सियस को चुंबकीय मोतियों में जोड़ें ताकि मोतियों को दूर करने के लिए ऊसिस्टों को दूर किया जा सकता है। 30 एस के लिए भंवर.
      नोट: भंवर अधिकतम गति से थोड़ा कम करने के लिए सेट किया जाना चाहिए.
    18. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 0.1 एन एचसीएल में मोती इनक्यूबेट करें।
    19. भंवर फिर से. फिर ट्यूब चुंबकीय जुदाई रैक पर वापस जगह है. मोती ट्यूब के पक्ष का पालन करने के लिए प्रतीक्षा करें और फिर एक नया microcentrifuge ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण.
    20. 6-1-17 से 6ण्1ण्19 तक द्वितीय ाुपर्यम् ।
    21. एल्यूएट को 1 छ नाह के 20 डिग्री एल के साथ निष्क्रिय कर देना, या अन्य तटस्थ बफर जैसे 1 एम ट्रास, पीएच 8।
    22. oocysts गिनती करने के लिए, eluate के 10 डिग्री सेल्सियस ले, यह oocyst-विशिष्ट एंटीबॉडी के 10 डिग्री सेल्सियस के साथ गठबंधन (सामग्री की तालिकादेखें) और एक हेमोसाइटोमीटर पर फ्लोरोसेंट oocysts गिनती.
      नोट: पृथक oocysts 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या इम्यूनोफ्लोरेसेंस या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए तुरंत इस्तेमाल किया।

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Representative Results

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप ओसिस्टों और स्पोरोजोइट्स के कुशल शुद्धिकरण (चित्र 1A) माइक्रोइंजेक्शन के लिए तैयार है। excystation प्रोटोकॉल oocysts के लगभग 70-80% से sporozoites की रिहाई में परिणाम है, इसलिए यह एक 3 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से शेष oocysts और गोले बाहर फिल्टर करने के लिए आवश्यक है। निस्पंदन का परिणाम लगभग 100% स्पोरोजोआइट शोधन में होता है (चित्र 1 बी)। इसके अलावा, एक हरे रंग के अलावा सभी organoids के इंजेक्शन सुनिश्चित करने में मदद करता है और इंजेक्शन के बाद कम से कम 24 एच के लिए इंजेक्शन organoids के दृश्य की अनुमति देता है (चित्र 2B).

oocysts और sporozoites की तैयारी के लिए इन प्रोटोकॉल सरल कर रहे हैं और कई वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है, तो यह उम्मीद है कि इलाज oocysts और शुद्ध sporozoites व्यवहार्य और संक्रामक हो जाएगा. तथापि, अपने अध्ययनों में हमने यह सुनिश्चित करने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैन िंग का प्रयोग किया कि एक्ससाइटन प्रक्रिया से स्पोरोजोइट्स या ओसिस्ट (चित्र 2क)10को नुकसान न पहुंचे। ऑर्गेनिॉइड लुमेन में समान मात्रा में ओसिस्टों के इंजेक्शन की सरल सूक्ष्म इमेजिंग द्वारा नेत्रहीन पुष्टि की जा सकती है (चित्र 2ब्) . मात्रात्मक पीसीआर द्वारा परजीवी संचरण की पुष्टि करने के लिए संक्रमित अंगों का एक भाग स्थापित किया जाना चाहिए जैसा कि हमने10का वर्णन किया है .

परजीवी जीवन चक्र के माध्यम से प्रगति को संक्रमित organoids के संग्रह द्वारा विभिन्न समय बिंदुओं पर संक्रमण और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण या इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा 4 $,6-diamidino-2-phenylindole के साथ संयुक्त द्वारा कल्पना की जा सकती है ( डीएपीआई) परजीवी नाभिक10का धुंधला। उदाहरण के लिए, मेरोज़ोइट सतह एंटीजन के एंटीबॉडी, जैसे कि gp40 और gp1517 का उपयोग मेरोंट चरणों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है; प्रकार मैं meronts 8 नाभिक और प्रकार द्वितीय meronts, 4 नाभिक10होगा. हाल ही में, ट्रोफोजोइट्स, मेजोमाइट्स, टाइप I बनाम II मेरोंट्स और मैक्रोगैमोंट्स के लिए विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का एक पैनल18उपलब्ध हो गया है। ये एंटीबॉडी organoids में अपने विभिन्न जीवन चक्र चरणों के माध्यम से परजीवी की प्रगति अंकन में बहुत प्रभावी होगा.

इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख का उपयोग यह पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है कि क्रिप्टोस्पोरिडियमसे कौन से सेल प्रकार संक्रमित हैं . यह विशेष रूप से airway organoids में देखने के लिए महत्वपूर्ण था के रूप में बहुत कम श्वसन क्रिप्टोस्पोरिडोसिस के बारे में जाना जाता है, और परजीवी के लिए सटीक मेजबान सेल ज्ञात नहीं था. हमने क्रिप्टोस्पोरिडियम-संक्रमित organoids पर इम्यूनोफ्लोरेसींस परख आयोजित की, सह-स्थानीयकरण CC10, क्लब कोशिकाओं के लिए एक मार्कर और पाया कि क्रिप्टोस्पोरिडियम दोनों CC10- नकारात्मक और सकारात्मक कोशिकाओं को संक्रमित (चित्र 3)। इन परिणामों की पुष्टि टीईएम द्वारा की गई थी जिसमें हमने क्रिप्टोस्पोरिडियम को वायुमार्ग organoids10में स्रावी और गैर-सचिव कोशिकाओं को संक्रमित करते देखा था।

पांच दिनों के लिए विभेदित organoids संक्रमित किया गया है के बाद, वहाँ का उत्पादन किया जा रहा oocysts की महत्वपूर्ण संख्या होनी चाहिए। हमारे हाथों में, एक छह अच्छी प्लेट से organoids के संक्रमण के बारे में 4000 oocysts, जो आसानी से पहचान की जा सकती है और एक oocyst-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबलिंग द्वारा एक hemocytometer पर गिना. oocysts में चार sporozoites की उपस्थिति एक चिपकने वाली स्लाइड पर oocysts के एक हिस्से को सुखाने से पुष्टि की जा सकती है, मेथनॉल के साथ फिक्सिंग और oocyst विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ DAPI धुंधला संयोजन (चित्र 4) . मोटी दीवारों oocysts के उत्पादन का सत्यापन TEM विश्लेषण10द्वारा किया जा सकता है .

Figure 1
चित्र 1: क्रिप्टोस्पोरिडियम oocysts और sporozoites की तैयारी और शुद्धि। (ए) संक्रमण के लिए ओसिस्ट और स्पोरोजोइट तैयारी के लिए उपयोग की जाने वाली विधि का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ख) oocysts के इन विट्रो excystation में दिखा छवि. अनएक्ससिस्टेड ओसाइट्स और गोले का निस्पंदन स्पोरोजोइट्स का शुद्ध समाधान देता है। स्केल बार ] 10 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: अंगाभ लुमेन में ओसिस्टों का माइक्रोइंजेक्शन। यह आंकड़ा Heo एट अल10से संशोधित किया गया है. (ए) ओसिस्टों और स्पोरोजोइट्स के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) छवियों को स्कैन करना। (बी) ओसिस्ट-इंजेक्शन organoids दिखा छवि. हरे रंग प्रत्येक organoid के इंजेक्शन कल्पना में मदद करता है और कम से कम 24 एच पर बनी रहती है (सी) oocysts के साथ इंजेक्शन एक organoid की छवि. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: क्रिप्टोस्पोरिडियम-संक्रमित एयरवे ऑर्गेनॉइड की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि। Mucin organoid के लुमेन में विरोधी mucin 5 एंटीबॉडी (लाल) के साथ लेबल है, क्लब कोशिकाओं विरोधी CC10 (पीला) के साथ लेबल कर रहे हैं, क्रिप्टोस्पोरिडियम oocyst-विशिष्ट एंटीबॉडी (हरा) के साथ पता चला है, और सेल नाभिक DAPI (नीले) के साथ दाग रहे हैं। पैनल बी पैनल ए में वर्ग में संकेत क्षेत्र की एक वृद्धि है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: विभेदित आंतों के organoids से अलग oocyst के इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि. Oocyst दीवार हरे रंग में oocyst-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबल है और चार sporozoite नाभिक DAPI के साथ कल्पना कर रहे हैं (नीले) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

आंतों और वायुमार्ग organoids में क्रिप्टोस्पोरिडियम परजीवी की संस्कृति मेजबान परजीवी बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक सटीक मॉडल प्रदान करता है10 लेकिन यह भी कई अन्य अनुप्रयोगों है. उदाहरण के लिए, आनुवंशिक रूप से संशोधित क्रिप्टोस्पोरिडियम परजीवी के चयन और प्रचार के वर्तमान तरीकों को चूहों में पारित होने की आवश्यकताहोती है 19 जो परजीवी के अलगाव की अनुमति नहीं देता है जिनके पास विवो संक्रमण में आवश्यक संशोधन होते हैं। क्रिप्टोस्पोरिडियम की ऑर्गनॉइड संस्कृति इस प्रक्रिया का विकल्प प्रदान करती है। तथापि, हमने नोट किया है कि इलेक्ट्रोपोरेटेड स्पोरोजोइट्स एक साथ झुरमुट करते हैं और माइक्रोपिपेट को अवरुद्ध करते हैं। आनुवंशिक रूप से संशोधित परजीवी का चयन करने के उद्देश्य के लिए, organoids विभिन्न स्थितियों के तहत एक दो आयामी प्रारूप में कोलेजन लेपित transwells transofted sporozoites के साथ संक्रमण की अनुमति देने के लिए और फलस्वरूप के चयन पर उगाया जा सकता है आनुवंशिक रूप से संशोधित oocysts. transwells दोनों शीर्ष और basolateral सतहों के लिए उपयोग की अनुमति है और समय की विस्तारित अवधि के लिए स्थिर हैं.

वर्तमान में, हम कैंसर ऊतक व्युत्पन्न organoids (अप्रकाशित डेटा) के लिए दवाओं की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए एक दो आयामी प्रारूप में organoids संस्कृति. ऑर्गेनिक कल्चर की इस विधि को आनुवंशिक रूप से संशोधित ल्यूसिफेज टैग किए गए क्रिप्टोस्पोरिडियम उपभेदों19का उपयोग करके एंटीक्रिप्टोस्पोरिडियम दवाओं के परीक्षण के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, भले ही संक्रमण कसकर सिंक्रनाइज़ नहीं किया जाता है, sporozoites के साथ organoids के संक्रमण जीवन चक्र है कि दवाओं विशिष्ट जीवन चक्र चरणों के खिलाफ उनकी प्रभावकारिता के लिए परीक्षण किया जा सकता है की पर्याप्त तुल्यकालन प्रदान करता है.

अब मेजबान प्रणाली के कुछ अन्य पहलुओं जैसे माइक्रोबायोटा और प्रतिरक्षाकोशिकाओंको ध्यान में रखते हुए ऑर्गेनोइड सह-संस्कृति प्रणालियों का विकास किया जा रहा है। इस प्रकार, परजीवी और मेजबान कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और microbiota के बीच बातचीत विच्छेदन करने की क्षमता जल्द ही इन विट्रो में संभव हो जाएगा. क्रिप्टोस्पोरिडियम का आनुवंशिक हेरफेर भी अब संभव है19, और क्रिप्टोस्पोरिडियम और organoid संस्कृति के फ्लोरोसेंट रिपोर्टर उपभेदों का संयोजन संक्रमित कोशिकाओं के एकल सेल अनुक्रमण के लिए उपकरण प्रदान करेगा, और परजीवी के विशिष्ट चरणों से संक्रमित कोशिकाओं के और भी अधिक विशेष रूप से एकल सेल अनुक्रमण।

यहाँ वर्णित प्रयोगों की सफलता oocysts की व्यवहार्यता और infectivity पर अत्यधिक निर्भर है. क्रिप्टोस्पोरिडियम oocysts के विभिन्न बैचों excystation दरों और मेजबान कोशिकाओं को संक्रमित करने की क्षमता में व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं। स्पोरोजोइट्स की पर्याप्त पैदावार अच्छी एक्ससाइटन दरों पर निर्भर करती है और एक्ससाइटन दर हमेशा संक्रमितता से संबंधित नहीं होती है। यदि संक्रमण या खराब excystation के निम्न स्तर oocysts के एक विशेष बैच के साथ मनाया जाता है, समय और प्रयास oocysts की संख्या में वृद्धि करने का प्रयास करने के बजाय oocysts की एक नई बहुत प्राप्त करने के द्वारा बचाया जा सकता है, या ऊष्मायन समय लंबा.

Organoid संस्कृति मीडिया हर वैकल्पिक दिन ताजा किया जाना चाहिए. ऑर्गेन्डोइड संस्कृतियों के पहले के अंश का उपयोग उचित है। यह organoids की एक नई शीशी thaw करने के लिए महत्वपूर्ण है अगर organoids organoid संस्कृतियों के स्वास्थ्य के रूप में बाद के मार्ग में अंतर करने के लिए शुरू काफी परजीवी की व्यवहार्यता निर्धारित करते हैं. संक्रमण के बाद, मीडिया में विषाक्त पदार्थों के संचय से बचने के लिए हर दिन organoid मीडिया को ताज़ा किया जाना चाहिए।

क्रिप्टोस्पोरिडियम की ऑर्गनॉइड संस्कृति सीमित है जिसमें परजीवी का अनिश्चित काल तक प्रचार नहीं किया जा सकता है, और संक्रमण 28 दिनों10से अधिक तीन मार्ग के बाद बाहर हो जाता है। माउस प्रयोगों के लिए पर्याप्त organoids के माइक्रोइंजेक्शन जैसे हम वर्णित है समय लेने वाली और शारीरिक रूप से कर सकता है. फिर भी, तारीख करने के लिए, कोई अन्य विधि एक इन विट्रो प्रणाली में पूरा जीवन चक्र मानव संक्रमण की पूरी तरह से प्रतिनिधि सक्षम बनाता है, और न ही किसी भी संस्कृति प्रणाली है कि मेजबान-रोगज़नक बातचीत के लिए महत्वपूर्ण की खोज की अनुमति देता है वर्णित किया गया है श्वसन संक्रमण। क्रिप्टोस्पोरिडियम की ऑर्गनॉइड संस्कृति एक शक्तिशाली नया उपकरण प्रदान करती है जो क्रिप्टोस्पोरिडियमके लिए पहले से संभव नहीं मेजबान परजीवी बातचीत में अन्वेषण के रास्ते खोलता है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम पशु और तुलनात्मक जैव चिकित्सा विज्ञान के स्कूल से डेबोरा ए शेफ़र के आभारी हैं, कृषि और जीवन विज्ञान के कॉलेज, एरिजोना विश्वविद्यालय, टक्सन, A$, संयुक्त राज्य अमेरिका के लिए हमें oocyst उत्पादन और विश्लेषण के साथ मदद करने के लिए. हम भी फ्रांसकी माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सेंटर और डी.एल. Mullendore TEM तैयारी और अलग organoid oocysts के इमेजिंग के लिए वाशिंगटन स्टेट यूनिवर्सिटी में धन्यवाद.

D.D. वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (NWO-ALW, 016.Veni.171.015) से एक VENI अनुदान के प्राप्तकर्ता है. I.H. वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (NWO-ALW, 863.14.002) से एक VENI अनुदान के प्राप्तकर्ता है और यूरोपीय आयोग से मैरी क्यूरी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था (प्रस्ताव 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान ईआरसी उन्नत अनुदान समझौते संख्या 67013 के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद से वित्त पोषण प्राप्त हुआ है और R21 AT009174 के तहत NIH NIAIH से RMO के लिए. यह काम Oncode संस्थान है, जो आंशिक रूप से डच कैंसर सोसायटी द्वारा वित्त पोषित है और डच कैंसर सोसायटी से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया का हिस्सा है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Basement membrane extract (extracellular matrix) amsbio 3533-010-02  
Crypt-a-Glo antibody (Oocyst specific antibody) Waterborne, Inc A400FLR-1X Final Concentration = Use 2-3 drops/slide
Crypto-Grab IgM coated Magnetic beads Waterborne, Inc IMS400-20  
Dynamag 15 rack Thermofisher Scientific 12301D  
Dynamag 2 rack Thermofisher Scientific 12321D  
EMD Millipore Isopore Polycarbonate Membrane Filters- 3µm EMD-Millipore TSTP02500  
Fast green dye SIGMA F7252-5G    
Femtojet 4i Microinjector Eppendorf 5252000013  
Glass capillaries of 1 mm diameter WPI TW100F-4  
Matrigel (extracellular matrix) Corning 356237  
Microfuge tube 1.5 mL Eppendorf T9661-1000EA  
Micro-loader tips Eppendorf 612-7933  
Micropipette puller P-97 Shutter instrument P-97  
Normal donkey Serum Bio-Rad C06SB  
Penstrep Gibco 15140-122  
Sodium hypoclorite (use 5%) Clorox 50371478  
Super stick slides Waterborne, Inc S100-3  
Swinnex-25 47 mm Polycarbonate filter holder EMD-Millipore SX0002500  
Taurocholic acid sodium salt hydrate SIGMA T4009-5G  
Tween-20 Merck 8221840500  
Vectashield mounting agent Vector Labs H-1000  
Vortex Genie 2 Scientific industries, Inc SI0236  
Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)     Final amount
DMEM Invitrogen 12634-010 500 mL
Penstrep Gibco 15140-122 5 mL of stock in 500 mL DMEM
Glutamax Gibco 35050038 5 mL of stock in 500 mL DMEM
Hepes Gibco 15630056 5 mL of stock in 500 mL DMEM
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Expansion media)     Final concentration
A83-01 Tocris 2939-50mg 0.5 µM
Adv+++     make up to 100 mL
B27 Invitrogen 17504044 1x
EGF Peprotech AF-100-15 50 ng/mL
Gastrin Tocris 3006-1mg 10 nM
NAC Sigma A9125-25G 1.25 mM
NIC Sigma N0636-100G 10 mM
Noggin CM In house*   10%
P38 inhibitor (SB202190) Sigma S7076-25 mg 10 µM
PGE2 Tocris 2296/10 10 nM
Primocin InvivoGen ant-pm-1 1 mL/500 mL media
RSpoI CM In house*   20%
Wnt3a CM In house*   50%
In house* - cell lines will be provided upon request      
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Differentiation media)     To differentiate organoids, expanding small intestinal organoids were grown in a Wnt-rich medium for six to seven days after splitting, and then grown in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, in a differentiation medium (withdrawal of Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandin E2 from a Wnt-rich medium or OME)
LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media)     Final concentration
Adv+++     make up to 100 mL
ALK-I A83-01 Tocris 2939-50mg 500 nM
B27 Invitrogen 17504044 0.0763888889
FGF-10 Peprotech 100-26 100 ng/mL
FGF-7 Peprotech 100-19 25 ng/mL
N-Acetylcysteine Sigma A9125-25G 1.25 mM
Nicotinamide Sigma N0636-100G 5 mM
Noggin UPE U-Protein Express Contact company directly 10%
p38 MAPK-I Sigma S7076-25 mg 1 µM
Primocin InvivoGen ant-pm-1 1:500
RhoKI Y-27632 Abmole Bioscience M1817_100 mg 2.5 µm
Rspo UPE U-Protein Express Contact company directly 10%
Reducing buffer (for resuspension of oocysts and sporozoites for injection)     Final concentration
L-Glutathione reduced Sigma G4251-10MG 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM
Betaine Sigma 61962 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM
L-Cysteine Sigma 168149-2.5G 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM
Linoleic acid Sigma L1376-10MG 6.8 μg/mL of OME/OMD /LOM
Taurine Sigma T0625-10MG 0.5 μg/μL of OME/OMD/LOM
Blocking buffer (for immunoflourescence staining)     Final concentration
Donkey/Goat serum Bio-Rad C06SB 2%
PBS Thermo-Fisher 70011044 Make up to 100 mL
Tween 20 Merck P1379 0.1%
List of Antibodies used      
Alexa 568 goat anti-rabbit Invitrogen A-11011 Dilution-1:500; RRID: AB_143157
Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Fluorescein-labeled antibody Crypto-Glo Waterborne, Inc A400FLK Dilution- 1:200
Crypta-Grab IMS Beads- Magnetic beads coated in monoclonal antibody reactive Waterborne, Inc IMS400-20 Dilution-1:500
DAPI Thermo Fisher Scientific D1306 Dilution-1:1,000; RRID : AB_2629482
Phalloidin-Alexa 674 Invitrogen A22287 Dilution-1:1,000; RRID: AB_2620155
Rabbit anti-gp15 antibody generated by R. M. O’Connor (co-author). Upon request Upon request Dilution-1:500
Sporo-Glo Waterborne, Inc A600FLR-1X Dilution- 1:200

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 151 क्रिप्टोस्पोरिडियम organoids microinctions मेजबान microbe आंत फेफड़े क्रिप्टोस्पोरिडोसिस sporozoites oocysts
माइक्रोइंजेक्शन द्वारा 3 डी ऊतक व्युत्पन्न मानव ऑर्गनॉइड संस्कृति प्रणालियों में <em>क्रिप्टोस्पोरिडियम</em> संक्रमण का अध्ययन
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Dutta, D., Heo, I., O'Connor, R.… More

Dutta, D., Heo, I., O'Connor, R. Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection. J. Vis. Exp. (151), e59610, doi:10.3791/59610 (2019).

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