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Biology

मेटाफेज टाइमिंग और सेल फैट के बाद माइटोटिक स्पिनल क्षोभ के बाद गतिशीलता का आकलन करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग

Published: September 20, 2019 doi: 10.3791/60255
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम धुरी गठन और माइटोटिक प्रगति की गतिशीलता का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। समय चूक इमेजिंग के हमारे आवेदन उपयोगकर्ता mitosis के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं की पहचान करने के लिए सक्षम बनाता है, ट्रैक और माइटोटिक दोषों की पहचान, और विरोधी mitotic दवाओं के संपर्क में आने पर धुरी गतिशीलता और mitotic सेल भाग्य का विश्लेषण.

Abstract

लाइव सेल समय चूक इमेजिंग सेल जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण उपकरण है कि सेलुलर प्रक्रियाओं है कि अन्यथा अनदेखी की जा सकती है में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, गलत समझा, या निश्चित सेल विश्लेषण द्वारा गलत व्याख्या की. जबकि स्थिर सेल इमेजिंग और विश्लेषण मजबूत और सेलुलर स्थिर राज्य का पालन करने के लिए पर्याप्त है, यह सेलुलर स्तर पर घटनाओं की एक लौकिक क्रम को परिभाषित करने में सीमित किया जा सकता है और सहित गतिशील प्रक्रियाओं के क्षणिक प्रकृति का आकलन करने के लिए सुसज्जित है माइटोटिक प्रगति. इसके विपरीत, लाइव सेल इमेजिंग एक वाक्पटु उपकरण है कि समय के साथ एकल सेल स्तर पर सेलुलर प्रक्रियाओं का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और प्रक्रियाओं की गतिशीलता है कि अन्यथा खराब निश्चित सेल इमेजिंग में प्रतिनिधित्व किया जाएगा पर कब्जा करने की क्षमता है. यहाँ हम एक दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए क्रोमैटिन और microtubules के फ्लोरोसेंट लेबल मार्करों ले जाने कोशिकाओं और लाइव सेल इमेजिंग दृष्टिकोण में उनके उपयोग मेटाफेज गुणसूत्र संरेखण और mitotic बाहर निकलने की निगरानी के लिए उत्पन्न करने के लिए. हम इमेजिंग आधारित तकनीकों का वर्णन धुरी गठन और माइटोटिक प्रगति की गतिशीलता का आकलन करने के लिए, mitosis में विभिन्न चरणों में कोशिकाओं की पहचान सहित, पहचान और माइटोटिक दोषों की ट्रैकिंग, और धुरी गतिशीलता का विश्लेषण और माइटोटिक इनहिबिटर के साथ उपचार के बाद माइटोटिक सेल भाग्य।

Introduction

स्थिर कोशिकाओं का छवि-आधारित विश्लेषण आमतौर पर विभिन्न क्षोभ के प्रत्युत्तर में कोशिका जनसंख्या स्तर परिवर्तनों का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। जब सेल तुल्यकालन के साथ संयुक्त, संग्रह और सीरियल समय अंक की इमेजिंग के बाद, इस तरह के दृष्टिकोण घटनाओं के एक सेलुलर अनुक्रम का सुझाव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. फिर भी, निश्चित सेल इमेजिंग कि लौकिक संबंधों में सीमित है एक जनसंख्या के लिए निहित हैं और व्यक्तिगत कोशिकाओं के स्तर पर प्रदर्शन नहीं. इस तरह, जबकि निश्चित सेल इमेजिंग और विश्लेषण मजबूत phenotypes और स्थिर राज्य परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त है, समय के साथ क्षणिक परिवर्तन का पता लगाने की क्षमता और परिवर्तन है कि केवल कोशिकाओं की एक subpopulation प्रभाव अपूर्ण है. इसके विपरीत, लाइव सेल इमेजिंग एक वाक्पटु उपकरण है कि एक एकल सेल के भीतर सेलुलर और subcellular प्रक्रियाओं का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या सेलुलर आबादी, समय के साथ और तुल्यकालन दृष्टिकोण है कि खुद सेलुलर व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं की सहायता के बिना 1 , २ , 3 , 4 , 5 , 6.

एक द्विध्रुवी माइटोटिक धुरी का गठन कोशिका विभाजन के दौरान उचित गुणसूत्र अलगाव के लिए आवश्यक है, जिसके परिणामस्वरूप दो आनुवंशिक रूप से समान बेटी कोशिकाओं में होती है। माइटोटिक तर्कु संरचना में दोष जो माइटोटिक प्रगति को भ्रष्ट करता है और गुणसूत्र पृथक्करण की निष्ठा से समझौता करता है, भयावह कोशिका विभाजन और कम सेल व्यवहार्यता में परिणाम कर सकता है। इस कारण से , तर्कु के गठन को बदलने वाले माइटोटिक जहर कैंसर कोशिकाओं के तेजी से प्रसार को सीमित करने के लिए चिकित्सा का वादा कर रहे हैं7,8,9. फिर भी, माइटोटिक जहर के अलावा के बाद धुरी संरचना का निश्चित सेल विश्लेषण धुरी गठन की गतिशील प्रक्रिया का आकलन करने की क्षमता में सीमित है और यह इंगित नहीं कर सकता है कि धुरी संरचना में देखे गए परिवर्तन स्थायी हैं या कर रहे हैं इसके बजाय क्षणिक और सफल सेल विभाजन की अनुमति के लिए दूर किया जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल में, हम लाइव सेल इमेजिंग द्वारा धुरी क्षोभ के बाद mitosis की गतिशीलता का आकलन करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन. chTERT अमर RPE-1 सेल लाइन का उपयोग करने के लिए एक RFP-टैग्ड Histone 2B व्यक्त करने के लिए chromatin कल्पना करने के लिए इंजीनियर, एक EGFP-टैग्ड के साथ -tubulin microtubules कल्पना करने के लिए, मेटाफेज गुणसूत्र के समय, anaphase onset, और अंत में माइटोटिक सेल भाग्य गुणसूत्र आंदोलन, संहनन, और परमाणु आकृति विज्ञान के दृश्य संकेतों का उपयोग कर मूल्यांकन कर रहे हैं।

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Protocol

1. hTERT-RPE-1 कोशिकाओं का उत्पादन stably RFP-Histone 2B (RFP-H2B) और जेड-tubulin-EGFP (टब-EGFP) व्यक्त

नोट: सभी कदम aseptic तकनीकों का पालन करें और एक biosafety स्तर द्वितीय + (BSL2 +) सुरक्षा कैबिनेट में जगह ले लो.

  1. लिपिड-आधारित ट्रांसफेक्शन डिलीवरी सिस्टम के निर्माता के निर्देशों के अनुसार उपयुक्त लेन्टिवायरल प्लासमिड के साथ 293T कोशिकाओं के ट्रांसफेक्शन द्वारा ब्याज के जीन (जेड-टूबुलिन-ईजीएफपी और आरएफपी-एच 2 बी) को ले जाने वाले रेट्रोवायरस उत्पन्न करें।
    1. दिन 1: एक डिस्पोजेबल ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करने के लिए सेल संस्कृति माध्यम उप-संप्रवाह 293T कोशिकाओं की एक थाली से aspirate और फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ अवशिष्ट माध्यम से धोने के लिए पीबीएस के 5 एमएल जोड़कर. प्लेट तल पर पीबीएस वितरित करने के लिए चक्कर, तो एक बाँझ डिस्पोजेबल ग्लास पास्चर पिपेट के साथ पीबीएस aspirate.
    2. 0.05% trypsin के 2 एमएल जोड़ें जो 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गर्म किया गया है और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर पर वापस करें 5% सीओ2 के साथ 2 से 5 मिनट के लिए, ताकि अनुयायी कोशिकाओं को सेल संस्कृति डिश सतह से मुक्त होने की अनुमति दी जा सके।
    3. ताजा Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 8 एमएल जोड़ें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन /
    4. कोशिकाओं को धीरे से पाइपिंग द्वारा पुन: निलंबित करें और निलंबन को एक बाँझ 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। शंकु ट्यूब को संतुलित अपकेंद्रण में रखें और कक्ष के तापमान पर 5 मिनट के लिए 161 x ग्राम पर स्पिन करें ताकि कोशिकाओं को धीरे-धीरे गोली दी जा सके।
    5. पेलेटकोशिकाओं से मध्यम/ट्रिप्सिन समाधान को प्रेरित करें और 10 एमएल में डीएमईएम के 10 एमएल में कोशिकाओं को पुन: असाइन करें, 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक। एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करने के लिए 293T सेल निलंबन और प्लेट 2 x 106 293T कोशिकाओं एक 6 अच्छी तरह से प्लेट के प्रति अच्छी तरह से गिनती.
    6. Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) की कुल मात्रा में संस्कृति कोशिकाओं 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन /
    7. दिन 2: लिपिड आधारित transfection वितरण अभिकर्मक और कम सीरम माध्यम के 100 डिग्री सेल्सियस के Pipette 7 डिग्री सेल्सियस एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में और यह 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करने के लिए अनुमति देते हैं (ट्यूब #1).
    8. एक अलग 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में, pippette 1 $g RFP-H2B अभिव्यक्ति वेक्टर के (या $ tubulin-EGFP अभिव्यक्ति वेक्टर के 1 $g), साथ में 5 $L बढ़ाने अभिकर्मक के साथ (के रूप में निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार आवश्यक), 0.5 g pMD2.G, और 1 डिग्री पीएसपीएएक्स 2 और कम की 100L सीरम माध्यम (ट्यूब #2)।
    9. चरण 1.1.7 की सामग्री का मिश्रण और ध्यान से ट्यूब #2 ट्यूब #1 में पाइपिंग द्वारा और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट द्वारा कदम 1.1.8.
      नोट: प्रतिक्रिया अतिरिक्त कुओं में कोशिकाओं के transfection के लिए आवश्यक के रूप में बढ़ाया जा सकता है.
    10. ट्रान्फेक्शन रिएक्शन ड्रॉपवार को 2 एमएल मध्यम में 293T कोशिकाओं से युक्त करने के लिए और 5% ब्व्2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर को डिश वापस कर दें.
      नोट: दोनों RFP-H2B और $-tubulin-EGFP व्यक्त कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए, प्रत्येक अभिव्यक्ति निर्माण के लिए अलग वायरस उत्पन्न (चरण 1.1.7- 1.1.9).
    11. दिन 3: Aspirate और ताजा DMEM के 2 एमएल के साथ मध्यम की जगह 10% FBS और 1% पेनिसिलिन / 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र इनक्यूबेटर को डिश लौटादें .
  2. दिन 4: 293T कोशिकाओं को बाधित या हटाने के लिए नहीं सतर्क किया जा रहा है, व्यक्त वायरस कणों युक्त माध्यम लीजिए। एक 5 एमएल सिरिंज से जुड़ी एक 0.45 डिग्री सेल्सियस फिल्टर के माध्यम से गुजर द्वारा यह गुजर द्वारा मध्यम युक्त वायरस कणों फ़िल्टर। 4 डिग्री सेल्सियस, या -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण पर अल्पकालिक भंडारण के लिए अलीकोट वायरस।
    नोट: इस तरीके से प्राप्त वायरल कणों की एक श्रेणी में मौजूद होंगे $1 x 107 करने के लिए 1 x 108 Transducing इकाइयों / के रूप में वायरल उत्पादक कोशिकाओं और कोशिकाओं को संक्रमित किया जा करने के लिए दोनों एक ही माध्यम में सुसंस्कृत कर रहे हैं, वायरल एकाग्रता मध्यम को बदलने के लिए आवश्यक नहीं है और फ़िल्टर ्ड वायरल कणों सीधे कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. वायरल संक्रमण के लिए तैयार करने में बीज 2 x 105 hTERT-RPE-1 कोशिकाओं को 6-वेल डिश के प्रति अच्छी तरह से। DMEM के 2 एमएल में संस्कृति कोशिकाओं 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन /स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक और 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में बनाए रखने के लिए ।
  4. दिन 5: हेक्साडिमेट्रीन ब्रोमाइड (उदा., पॉलीब्रेन) को hTERT-RPE-1 कोशिकाओं को 8 ग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता में जोड़ें। सेल कल्चर मीडियम के 500 डिग्री सेल्सियस में पतला वायरस के मिश्रण के साथ कोशिकाओं को संक्रमित करें।
    नोट: हेक्साडिमेट्रीन ब्रोमाइड स्टॉक समाधान बाँझ आसुत पानी में तैयार किया जाता है, फिर 0.45 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है।
  5. दिन 6: एक डिस्पोजेबल ग्लास पास्चर पिपेट का उपयोग करना, वायरस संक्रमित कोशिकाओं वाले कुओं से माध्यम को प्रेरित करें। 10% एफबीएस, 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन, और प्लाज़्मिड एकीकरण और अभिव्यक्ति के लिए चयन करने के लिए एंटीबायोटिक की उचित सांद्रता युक्त डीएमईएम के 2 एमएल के साथ सेल संस्कृति माध्यम को बदलें।
    नोट: वर्णित प्रयोगों में प्रयुक्त जेड-ट्यूबुलिन-ईजीएफपी एक्सप्रेशन प्लाज्मिड में एक प्यूरोमाइसिन-प्रतिरोध जीन होता है और RFP-H2B अभिव्यक्ति प्लाज्मिड एक ब्लास्टीकिडिन प्रतिरोध जीन रखता है। इसलिए, प्यूरोमाइसिन के 10 ग्राम/एमएल और ब्लास्टीकिडिन के 2 ग्राम/एमएल का उपयोग जेड-टूबुलिन-ईजीएफपी, आरएफपी-एच 2 बी के चयन के लिए किया जाता है जो एचईआरटी आरपीई-1 कोशिकाओं को व्यक्त करता है। चयन के लिए इस्तेमाल एंटीबायोटिक की सांद्रता विभिन्न सेल लाइनों के लिए अलग हो सकता है इस्तेमाल किया.
  6. 5-7 दिनों के लिए एंटीबायोटिक चयन के तहत कोशिकाओं को बनाए रखें, उचित चयन अभिकर्मकों युक्त ताजा माध्यम के साथ हर 3 दिनों में मध्यम की जगह।
    नोट: सेल चयन के दौरान उप-संगम पर बनाए रखा जाना चाहिए और आवश्यकतानुसार विस्तृत किया जाना चाहिए, जैसा कि चरण 1.1.1 से 1.1.4 में वर्णित है।
  7. टैग किए गए निर्माणकी अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेंस इमेजिंग का उपयोग करें।
    नोट: यदि वांछित, एकल सेल क्लोन सेल आबादी के भीतर एक समान अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने के लिए प्राप्त किया जा सकता है. एक बार स्थिर क्लोन की पुष्टि कर रहे हैं, कोशिकाओं एंटीबायोटिक चयन के अभाव में मानक संस्कृति की स्थिति के तहत बनाए रखा जा सकता है.

2. माइटोटिक तर्कु क्षोभ के बाद लाइव सेल इमेजिंग के लिए कोशिकाओं की तैयारी

नोट: aseptic तकनीकों का उपयोग करें और एक BSL2 सुरक्षा कैबिनेट में कदम प्रदर्शन करते हैं।

  1. एक बाँझ डिस्पोजेबल ग्लास पास्चर पिपेट का उपयोग करना, सेल लाइन है कि अभिव्यक्ति का निर्माण (ओं) (चरण 1.7 से) किया जाता है युक्त संस्कृति प्लेट से माध्यम aspirate. 10 एमएल बाँझ पीबीएस के साथ कोशिकाओं को संक्षेप में धो लें। प्लेट तल पर पीबीएस वितरित करने के लिए चक्कर, तो एक बाँझ डिस्पोजेबल ग्लास पास्चर पिपेट के साथ पीबीएस aspirate.
  2. 10 सेमी प्लेट में 0.05% ट्रिप्सिन का 2 एमएल जोड़ें। 2-5 मिनट के लिए या जब तक कोशिकाओं को प्लेट की सतह से अलग कर दिया है 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट इनक्यूबेट।
  3. ट्रिप्सिन युक्त प्लेट में 8 एमएल ताजा माध्यम डालें। कोशिकाओं को धीरे से पाइपिंग द्वारा पुन: निलंबित करें और निलंबन को एक बाँझ 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। शंकु ट्यूब को संतुलित अपकेंद्रण में रखें और कक्ष के तापमान पर 5 मिनट के लिए 161 x ग्राम पर स्पिन करें ताकि कोशिकाओं को धीरे-धीरे गोली दी जा सके।
  4. ध्यान से supernatant aspirate और एक 10 एमएल सीरम पिपेट के साथ धीरे से pipeting द्वारा पीबीएस के 10 एमएल में resuspend. शंकु ट्यूब को संतुलित अपकेंद्रण में रखें और कक्ष के तापमान पर 5 मिनट के लिए 161 x ग्राम पर स्पिन करें ताकि कोशिकाओं को धीरे-धीरे गोली दी जा सके।
  5. ध्यान से supernatant aspirate और एक 10 एमएल सीरम पिपेट के साथ धीरे pipeting द्वारा ताजा माध्यम के 10 एमएल में resuspend.
  6. कोशिकाओं की गणना करें, फिर हेमाकिटोमीटर का उपयोग करके सेल संख्या की गणना करें और सेल कल्चर माध्यम में 1-2 x 105 कोशिकाओं/एमएल की सांद्रता को पतला करें। एक बाँझ 12 अच्छी तरह से इमेजिंग नीचे प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सेल निलंबन के बीज 500 $L. सेल कल्चर इनक्यूबेटर में प्लेट रखें और कोशिकाओं को प्लेट सतह का पालन करने की अनुमति दें।
    नोट: लाइव सेल इमेजिंग कोशिकाओं की आवश्यकता है अच्छी तरह से adhered इतना है कि वे छवि अधिग्रहण के दौरान इमेजिंग विमान के साथ जुड़े रहते हैं. कोशिकाओं के लिए आवश्यक समय की अवधि निम्नलिखित चढ़ाना का पालन करने के लिए एक सेल लाइन से अगले करने के लिए अलग कर सकते हैं और अध्ययन के तहत सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  7. समय चूक इमेजिंग की शुरुआत करने से पहले 30 मिनट तक, कोशिकाओं के साथ बीज वाले एक या अधिक कुओं में एक माइटोटिक दवा की एक प्रासंगिक एकाग्रता जोड़ें। सेलुलर व्यवहार पर कार्बनिक विलायक के संभावित प्रभाव के लिए खाते में, नियंत्रण के रूप में कोशिकाओं के लिए अवरोध करनेवाला के diluent के एक बराबर मात्रा में जोड़ें. उदाहरण के लिए, सुनिश्चित करें कि माइटोटिक काइनेज अरोड़ा ए (उदाहरण के लिए, alisertib) के विशिष्ट अवरोध करनेवाला के 100 एनएम के अलावा DMSO के एक समान मात्रा के साथ समानांतर है, इस दवा के लिए diluent, कोशिकाओं के एक नियंत्रण में अच्छी तरह से.
    नोट: माइटोटिक प्रगति में गतिशील परिवर्तनों का तुलनात्मक विश्लेषण करने के लिए कोशिकाओं के कुओं को क्षोभ के अभाव में तैयार करने की आवश्यकता होती है ताकि प्रयोगात्मक स्थितियों के समानांतर सामान्य माइटोस की इमेजिंग को सक्षम किया जा सके।

3. RFP-H2B, जेड-टूबुलिन-जीएफपी व्यक्त कोशिकाओं के समय-चूक इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप स्थापित किया गया है (चित्र 1, चित्र 2)

  1. आरएफपी-एच 2 बी युक्त सेल कल्चर प्लेट रखें, जेड-ट्यूबुलिन-जीएफपी को एक उलटे एपिफ्लोरेसी माइक्रोस्कोप पर एक उपयुक्त चरण डालने में छवि बनाने के लिए hTERT RPE-1 कोशिकाओं को व्यक्त करना जो एक उच्च रिज़ॉल्यूशन कैमरा (20x पर 0.67 डिग्री मीटर का पिक्सेल आकार) से सुसज्जित है, एक पर्यावरण कक्ष 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पहले से गरम, और humidified 5% सीओ2के लिए एक वितरण प्रणाली.
    नोट: या तो संलग्न पर्यावरण कक्षों या तापमान नियंत्रित चरण आवेषण उपयुक्त प्रदान किया जा सकता है humidified 5% सीओ2 दिया जा सकता है और स्थिर तापमान नियंत्रण प्राप्त की.
  2. 0.5 के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 20x हवा उद्देश्य का उपयोग करें और उच्च विपरीत फ्लोरोसेंट और चरण कंट्रास्ट या ब्राइटफील्ड इमेजिंग के लिए सुसज्जित. चरण कंट्रास्ट या ब्राइटफील्ड के साथ कोशिकाओं को देखें और कोशिकाओं को ध्यान में लाने के लिए पाठ्यक्रम और माइक्रोस्कोप पर ठीक ध्यान केंद्रित करें।
  3. पहचानें और fluorophores कि छवि होगी के लिए उपयुक्त उत्तेजना और उत्सर्जन के साथ संबंधित फिल्टर घन का चयन करके brightfield, GFP, और RFP छवि अधिग्रहण के लिए इष्टतम जोखिम समय निर्धारित करें. वैकल्पिक रूप से, इनपुट के लिए ऑटो एक्सपोजर बटन पर क्लिक करें एक पूर्व निर्धारित जोखिम समय. संकेत पर्याप्त तीव्र नहीं है, तो binning टैब पर क्लिक करके और ड्रॉप डाउन मेनू से 2 x 2 पिक्सेल binning का चयन करके कम जोखिम समय सक्षम करने के लिए पिक्सेल binning का चयन करें.
    नोट: Phototoxicity mitotic प्रगति और सेल व्यवहार्यता ख़राब कर सकते हैं. सामान्य mitoses पूरा करने के लिए नियंत्रण आबादी में माइटोटिक कोशिकाओं की विफलता एक संकेत है कि जोखिम समय और /
  4. एक अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर है कि बहु-निर्देशांक, बहु अच्छी तरह से इमेजिंग एक साथ प्राप्त किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है और छवि अधिग्रहण के लिए पैरामीटर को परिभाषित का उपयोग करें.
    1. का चयन करें और बहु अच्छी तरह से पकवान करने के लिए माइक्रोस्कोप चरण जांचना, निर्माता के निर्देशों के अनुसार. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए प्रकाश डाला या अन्यथा कुओं कि इस्तेमाल किया जा रहा है प्लेट प्रारूप के चित्र में प्रासंगिक कुओं पर क्लिक करके छवि होगी का चयन करें.
    2. GeneratedPoints नियंत्रण कक्ष (चित्र 2) केअंतर्गत, प्रत्येक अच्छी तरह से उस में निर्देशांक निर्धारित करें जिसे पॉइंट प्लेसमेंट टैब पर क्लिक करके और से पूर्वनिर्धारित या यादृच्छिक समन्वय प्लेसमेंट का चयन करके छवि बनाई जाएगी ड्रॉप डाउन मेनू. कार्य क्षेत्र टैब का चयन करें और अच्छी तरह से की सीमाओं को छोड़ने के लिए समन्वय चयन क्षेत्र को प्रतिबंधित करने के लिए ड्रॉप डाउन मेनू से प्रतिबंधित का चयन करें। प्रति अच्छी तरह से कैप्चर किए जाने वाले बिंदुओं की संख्या और वितरण का चयन करने के लिए गणना और वितरण टैब्स क्लिक करें.
      नोट: निर्देशांक है कि अच्छी तरह से 5 मिनट timepoint वेतन वृद्धि के भीतर प्रति छवि की जा सकती है की संख्या कुओं की संख्या द्वारा सीमित किया जाएगा छवि, साथ ही प्रत्येक चैनल के लिए जोखिम समय. आमतौर पर, 5-8 निर्देशांक प्रति अच्छी तरह से 4 ज के भीतर mitosis के माध्यम से प्रत्येक स्थिति प्रगति में कम से कम 50 कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त हैं।
    3. का चयन करें और समय अंतराल और अवधि पर क्लिक करके और TimeSecience नियंत्रण कक्ष में मूल्यों inputting द्वारा छवियों को इकट्ठा करने के लिए इनपुट.
      नोट: छवियों का अधिग्रहण हर 1 से 5 मिनट mitotic प्रगति की गतिशीलता पर नजर रखने के लिए उपयुक्त है. इमेजिंग की समग्र अवधि वांछित समापन बिंदु और सेल लाइन के प्रसार की दर को प्रतिबिंबित करना चाहिए. उदाहरण के लिए, 4 घंटे mitosis के माध्यम से कई कोशिकाओं प्रगति को देखने के लिए पर्याप्त है, 16 घंटे mitosis के माध्यम से एक अतुल्यकालिक जनसंख्या प्रगति में सबसे RPE-1 कोशिकाओं को देखने के लिए पर्याप्त है.

4. समय चूक छवि विश्लेषण मेटाफेज समय और माइटोटिक सेल भाग्य का निर्धारण करने के लिए माइटोटिक धुरी क्षोभ के बाद

नोट: एक छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका),ImageJ, या तुलनीय छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि विश्लेषण प्रदर्शन.

  1. जगह में RFP फिल्टर घन के साथ कब्जा कर लिया छवियों का चयन करके RFP-H2B लेबल chromatin कल्पना. प्रारंभिक क्रोमैटिन संहनन (चित्र 2ब्, नीला ऐरोहेड) और नाभिकीय लिफाफा टूटने के द्वारा दर्शाए अनुसार मिटोसिस में प्रवेश करने वाले सेल की पहचान करें (जब --ट्यूबुलिन-ईजीएफपी को अब नाभिकीय सीमा से बाहर नहीं रखा जाता है)।
  2. अलग-अलग कक्षों में मेटाफेज संरेखण और anaphase शुरुआत के mitotic समय निर्धारित करें: RFP-H2B-लेबल क्रोमैटिन तक mitotic प्रविष्टि से timepoints/मिनट की संख्या निर्धारित करने के लिए अधिग्रहीत फिल्म में लगातार timepoints के माध्यम से सेल ट्रैक मेटाफेज के दौरान सेल भूमध्य रेखा पर संरेखण पूर्ण करता है (चित्र 2C, पीला ऐरोहेड).
  3. माइटोटिक समय, माइटोटिक निष्ठा, और सेल भाग्य की निगरानी करने के लिए, समय निर्देशांक की पहचान करने के लिए लगातार टाइमपॉइंट के माध्यम से सेल को ट्रैक करना जारी रखें, जिस पर anaphase गुणसूत्र पृथक्करण स्पष्ट है (चित्र 2C, सफेद ऐरोहेड) और/ जहां क्रोमैटिन decompaction और परमाणु लिफाफा सुधार (के रूप में नाभिक से ट्यूबुलिन बहिष्करण द्वारा संकेत दिया) हुआ है.
    नोट: धुरी विधानसभा या माइटोटिक प्रगति में क्षोभ एक द्विध्रुवी माइटोटिक धुरी प्राप्त करने और पूर्ण गुणसूत्र संरेखण को प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय के एक समारोह के रूप में मूल्यांकन किया जा सकता है, या anaphase गुणसूत्र अलगाव को पूरा करने के लिए.
  4. प्रत्येक जनसंख्या में कोशिकाओं की पहचान करने के लिए आरएफपी-एच 2 बी की कल्पना करें जो एनाफेज गुणसूत्र पृथक्करण के दौरान पिछड़े गुणसूत्रों और क्रोमैटिन पुलों सहित माइटोटिक दोषप्रदर्शित करते हैं।
    नोट: समझौता माइटोटिक निष्ठा भी बहुन्यूक्लिएक्नेड या माइक्रोन्यूक्लिएड बेटी कोशिकाओं में परिणाम हो सकता है और mitotic बाहर निकलें पोस्ट कोशिकाओं में कल्पना की जा सकती है, चित्र 3के रूप में .

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Representative Results

तर्कु क्षोभ की उपस्थिति में माइटोटिक प्रगति का आकलन
धुरी पोल ध्यान केंद्रित करने का विनियमन उचित द्विध्रुवी धुरी गठन में एक आवश्यक कदम है. प्रोटीन की कमी , दवा निषेध , या सेन्ट्रोसोम संख्या भ्रष्ट धुरी संरचना में परिवर्तन और देरी या माइटोटिक प्रगति10,11,12,13को रोकने के माध्यम से इस प्रक्रिया में व्यवधान . फिर भी, कुछ क्षुब्धियां केवल क्षणिक रूप से धुरी गठन में देरी करती हैं और कोशिकाएं अंततः माइटोसिस के माध्यम से आगे बढ़ रही हैं ताकि एनाफेज गुणसूत्र पृथक्करण14को पूरा किया जा सके। कोशिका तुल्यकालन दृष्टिकोणों की अनुपस्थिति में, जो स्वयं अप्रत्यक्ष रूप से माइटोटिक प्रक्रियाओंकोप्रभावित कर सकता है1,2, कोशिकाएं माइटोसिस के माध्यम से अतुल्यकालिक रूप से प्रगति करती हैं ( चित्र2ग) । क्रोमैटिन की पहचान करने के लिए RFP-H2B का उपयोग करना, कॉम्पैक्ट क्रोमैटिन के साथ माइटोटिक कोशिकाओं को प्रोमेटाफेज में होने के रूप में मंचित किया जा सकता है (उन मेटाफेज संरेखण को पूरा करने से पहले: चित्र 2ब्, नीले एरोहेड), मेटाफेज (पूर्ण गुणसूत्र संरेखण: चित्र 2 सी,पीला ऐरोहेड्स) और एनाफेज (क्रोमोसोम को धुरी डंडे की ओर अलग किया जा रहा है: चित्र 2सी, सफेद ऐरोहेड्स)। 4 एच पर 5-8 निर्देशांक का कब्जा एक दी गई हालत में mitosis के माध्यम से कम से कम 50 कोशिकाओं की प्रगति का पालन करने के लिए पर्याप्त है. सेन्ट्रोसोम संख्या में परिवर्तन और/या अरोड़ा A kinase के निषेध के बाद धुरी विधानसभा की गतिशीलता की जांच करने के लिए, धुरी पोल के एक महत्वपूर्ण नियामक ध्यान केंद्रित14,15,16, 17, हम 2 सेन्ट्रोसोम के साथ मानव कोशिकाओं के लाइव सेल समय चूक इमेजिंग, या उन supernumerary सेंट्रोसोम युक्त इस्तेमाल किया. इमेजिंग की शुरुआत से पहले अरोड़ा ए काइनेज अवरोधक की उपस्थिति या अनुपस्थिति में कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया गया था। 2 सेन्ट्रोसोम वाली कोशिकाएं माइटोटिक प्रगति में व्यवधान का अनुभव करती हैं जब औरोरा एक काइनेज अवरोधक के साथ इलाज किया जाता है, लेकिन अंततः मेटाफेज गुणसूत्र संरेखण प्राप्त करने में सक्षम होते हैं (चित्र 2ब्, पीला ऐरोहेड)। इसके विपरीत, के साथ कोशिकाओं को अति सुंदर अरोड़ा एक अवरोध के प्रति संवेदनशील हैं और prometaphase कोशिकाओं में वृद्धि और metaphase कोशिकाओं की अनुपस्थिति प्रदर्शन, धुरी विधानसभा और mitotic प्रगति में देरी का संकेत.

चित्रा 3 दर्शाता है कि इस तरह के समय चूक इमेजिंग दृष्टिकोण दोनों धुरी विधानसभा और mitotic निष्ठा की निगरानी करने के लिए पर्याप्त हैं. जेड-ट्यूबुलिन-ईजीएफपी को विज़ुअलाइज़ करके, यह देखा गया कि जो कोशिकाएं तर्कु विघटन का अनुभव करती हैं (यहां सेन्ट्रोसोम अतिधापकेके कारण दिखाई जाती हैं) में गतिशील परिवर्तन होते हैं क्योंकि धुरी ध्रुव फोकसिंग प्राप्त होती है और एक द्विध्रुवी माइटोटिक धुरी तैयार करने के लिए बनाई जाती है। सेल विभाजन. धुरी विधानसभा के साथ समवर्ती, गुणसूत्र आंदोलन गुणसूत्र संरेखण और अलगाव निष्ठा का आकलन करने के लिए आरएफपी-H2B के साथ कल्पना की जा सकती है। मिटोटिक कोशिकाओं जो क्षणिक धुरी बहुध्रुवता का अनुभव लगाव त्रुटियों के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं जो anaphase के दौरान पिछड़े गुणसूत्रों में परिणाम और कोशिका चक्र के बाद G1 चरण में micronuclei फार्म. इस तरह के दोष इन लाइव सेल इमेजिंग दृष्टिकोण के साथ स्पष्ट कर रहे हैं.

माइटोसिस की गतिशील प्रगति में परिवर्तन माइटोटिक समय और प्रभाव माइटोटिक सेल भाग्य को बदल देते हैं
परमाणु लिफाफा टूटने के बाद, धुरी गठन और गुणसूत्र आंदोलन माइटोसिस के चरणों के माध्यम से ट्रैक किया जा सकता है माइटोटिक प्रगति का आकलन करने के लिए, अवधि, और कोशिकाओं के भाग्य है कि anaphase में प्रगति. सेंट्रोसोम प्रवर्धन, जो कई प्रकार के कैंसर में आम है, की विशेषता अतिरिक्त सेन्ट्रोसोम और बहुध्रुवीय तर्कु निर्माण18,19,20की उपस्थिति है। बहुध्रुवीय विभाजन के परिणामस्वरूप अत्यधिक एन्यूगुणित और संभावित अव्यवहार्य पुत्री कोशिकाओं के परिणामस्वरूप कैंसर कोशिकाएं द्विध्रुवी धुरी बनाने के लिए अतिरिक्त सेन्ट्रोसोमों को सक्रिय रूप से क्लस्टर करती हैं और द्विध्रुवी विभाजन5,20,21से गुजरना पड़ता है, 22,23,24. लाइव सेल इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग करना, हमारे प्रतिनिधि परिणाम बताते हैं कि एक सामान्य सेंट्रोसोम सामग्री के साथ कोशिकाओं metaphase संरेखण और anaphase शुरुआत के माध्यम से परमाणु लिफाफा टूटने से आगे बढ़ने के लिए 30 मिनट के तहत एक द्विध्रुवी विभाजन प्राप्त करने में सक्षम हैं ( चित्र 4 ए, डी, ई) . अतिरिक्त सेन्ट्रोसोम की उपस्थिति में, लगभग 50% कोशिकाएं एक क्षणिक बहुध्रुवीय माइटोटिक धुरी को दूर करने और द्विध्रुवी धुरी और पूर्ण कोशिका विभाजन बनाने में सक्षम होती हैं (चित्र 4सी, डी)। शेष कोशिकाएँ द्विध्रुवी तर्कु को प्राप्त करने में असमर्थ होती हैं और परिणामस्वरूप एक बहुध्रुवीय विभाजन(चित्र 4ठ, द)के माध्यम से निकास मिटोसिस प्राप्त करने में असमर्थ होती हैं। चाहे धुरी द्विध्रुवीता हासिल की है, अतिरिक्त centrosomes के साथ कोशिकाओं mitosis की एक काफी वृद्धि की अवधि 2 centrosomes के साथ कोशिकाओं की तुलना में प्रदर्शन, यह दर्शाता है कि mitotic प्रगति की गतिशीलता भी बदल सकता है जब में परिवर्तन माइटोटिक परिणाम स्पष्ट नहीं हैं (चित्र 4म्)

Figure 1
चित्र 1: माइक्रोस्कोप और कैमरा मापदंडों का चयन. (ए) एक छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर वांछित उद्देश्य और उपयुक्त फिल्टर घन का चयन करने के लिए खिड़की का प्रतिनिधित्व. दिखाया 20x आवर्धन उद्देश्य और brightfield फिल्टर घन का चयन है. (बी)नमूना प्लेट में कोशिकाओं को पाया जाता है और ब्राइटफील्ड या चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करध्यान में लाया जाता है। (C) प्रत्येक छवि कैप्चर के लिए जोखिम पैरामीटर सेट करने के लिए विंडो का प्रतिनिधित्व. पिक्सेल binning इस्तेमाल किया जा सकता है, यदि आवश्यक हो, पर कब्जा प्रति जोखिम समय को कम करने और कोशिकाओं को फोटो क्षति को कम करने के लिए प्राप्त करने के लिए. स्केल बार 10 डिग्री मी है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: छवि पर कब्जा और समय चूक माइक्रोस्कोपी का विश्लेषण. (A और B) विंडो का प्रतिनिधित्व यह दर्शाता है कि कैसे छवि प्राप्ति पैरामीटर NIS Elements HCA कार्य छवि प्राप्ति सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सेट किए जाते हैं. इस सॉफ्टवेयर बहु निर्देशांक, समय के साथ बहु अच्छी तरह से इमेजिंग की अनुमति देता है. प्रत्येक काम कुओं और निर्देशांक पर कब्जा कर लिया जा करने के लिए निर्दिष्ट करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। (ग)एक प्रयोग की चार शर्तों से एकल समय रेखा। आरएफपी-एच 2 बी क्रोमेटिन को ट्रैक करने के लिए प्रयोग किया जाता है। क्रोमैटिन संहनन और स्थिति mitosis के विभिन्न चरणों की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है: Prometaphase (क्रोमोसोम संरेखण, नीले arrowhead के अभाव में संहनन), Metaphase (सेल भूमध्य रेखा पर पूर्ण गुणसूत्र संरेखण, पीले arrowhead), और Anaphase (तुल्यकालिक गुणसूत्र अलगाव, सफेद arrowhead की दीक्षा के बाद). स्केल बार 10 डिग्री है. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: समय चूक इमेजिंग माइटोटिक निष्ठा में दोष कल्पना करता है। अतिरिक्त सेन्ट्रोसोम वाले सेल बहुध्रुवीय धुरी बनाते हैं और अक्सर सेल विभाजन को पूरा करने से पहले उन्हें द्विध्रुवी धुरी में क्लस्टर करते हैं। यहाँ, एक सेल सात अलग धुरी डंडे (सफेद तारांकन) जो, समय के साथ, दो मुख्य धुरी डंडे में संकुल रहे हैं के साथ mitosis में प्रवेश करती है. इस बिंदु पर, गुणसूत्रों धुरी भूमध्य रेखा के साथ संरेखित करने में सक्षम हैं, और सेल anaphase करने के लिए आय. क्षणिक बहुध्रुवता ने एकल गुणसूत्र के मल लगाव की अनुमति दी है। इस अनसुलझे त्रुटि anaphase जो एक बेटी सेल में एक micronucleus में शामिल हो जाता है के दौरान एक ठंड गुणसूत्र में परिणाम (एक तीर के साथ लेबल). क्रोमैटिन आरएफपी-हिस्टोन 2 बी के साथ कल्पना की जाती है और माइक्रोट्युबल्स को जेड-ट्यूबुलिन-ईजीएफपी के साथ कल्पना की जाती है। प्रत्येक पैनल में समय टिकटों परमाणु सीमा के भीतर tubulin का पता लगाने के द्वारा न्याय के रूप में स्पष्ट परमाणु लिफाफा टूटने के संबंध में मिनट से संकेत मिलता है. स्केल बार 5 m है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: माइटोसिस की गतिशील प्रगति में परिवर्तन माइटोटिक समय और प्रभाव माइटोटिक सेल भाग्य को बदल देते हैं। आरएफपी-एच 2 बी, जो लाल रंग में दिखाया गया है, क्रोमैटिन आंदोलन को ट्रैक करने के लिए प्रयोग किया जाता है और हरे रंग में दिखाया गया जेड-ट्यूबुलिन-जीएफपी, सेन्ट्रोसोम/स्पिनल पोल नंबर और संगठन की निगरानी करने के लिए प्रयोग किया जाता है। नाभिक से GFP-tubulin बहिष्करण की हानि, जल्दी chromatin संहनन के साथ समवर्ती एक संकेत है कि परमाणु लिफाफा नीचे टूट गया है (NEB) mitotic सेल विभाजन के लिए तैयारी में. जीएफपी-ट्यूबुलिन का परमाणु अपवर्जन परमाणु लिफाफे के माइटोटिक निकास और सुधार पर स्पष्ट है। (ए) दो सेन्ट्रोसोम वाला एक सेल द्विध्रुवी धुरी बनाता है और दो पुत्री कोशिकाओं को बनाने के लिए एनेफेज के माध्यम से प्रगति करता है। (बी और सी) अतिरिक्त सेन्ट्रोसोम वाले कोशिकाएं बहुध्रुवीय धुरी बनाने के लिए मिटोसिस में प्रवेश करती हैं। (बी)इनमें से कुछ कोशिकाएं जो द्विध्रुवीय तर्कु को प्राप्त किए बिना अतिसेन्ट्रोसोम में विलंब करती हैं और बहुध्रुवीय एनेफेज को पूरा करने के लिए प्रगति करती हैं। (ग) अतिरिक्त सेन्ट्रोसोम वाली अन्य कोशिकाएँ माइटोटिक प्रगति में क्षणिक विलंब दर्शाती हैं जबकि वे द्विध्रुवी एनेफेज को सक्षम करने के लिए अतिरिक्त सेन्ट्रोसोम का समूह करती हैं। (घ) अतिरिक्त सेन्ट्रोसोम वाली कोशिकाएँ द्विध्रुवी विभाजन से लगभग 50% समय तक गुजरने में सक्षम होती हैं, जबकि अतिरिक्त सेन्ट्रोसोम वाली शेष कोशिकाओं का बहुध्रुवीय विभाजन होता है। (ई) अतिरिक्त सेन्ट्रोसोम वाली कोशिकाओं ने अंतिम रूप से माइटोटिक भाग्य (द्विध्रुवीय या बहुध्रुवीय एनेफेज) की परवाह किए बिना माइटोटिक समय में वृद्धि की है। स्केल बार 5 m है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

समय चूक इमेजिंग द्वारा प्रदान अस्थायी संकल्प दृश्य और एकल कोशिकाओं के भीतर अनुक्रमिक सेलुलर घटनाओं के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है. दृष्टिकोण है कि सेलुलर तुल्यकालन का उपयोग करने के संग्रह और अनुक्रमिक समय बिंदुओं पर कोशिकाओं के निर्धारण के बाद कर रहे हैं कि तुलना अंततः कोशिकाओं की आबादी के बीच बना रहे हैं में सीमित हैं. संदर्भों में जहां क्षोभ के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया गैर वर्दी हो सकता है, या जहां प्रक्रिया कल्पना की जा रही गतिशील है, लाइव सेल समय चूक इमेजिंग बेहतर का पालन करें और एकल कोशिकाओं के दोनों गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए सुसज्जित है, साथ ही विषमता एक सेलुलर आबादी के भीतर. इस तरह, समय चूक इमेजिंग mitosis के गतिशील चरणों के माध्यम से सेल प्रगति की निगरानी में विशेष रूप से उपयोगी है और इस प्रगति के लिए कैसे क्षोभ अंततः mitotic सेल विभाजन और बाद में सेल भाग्य की निष्ठा को प्रभावित का आकलन.

जबकि वहाँ सेल इमेजिंग रहने के लिए लाभ के एक नंबर रहे हैं, महत्वपूर्ण चुनौतियों है कि विचार किया जाना चाहिए और जब संभव हो कम जुड़े रहे हैं. एक चुनौती इमेजिंग के दौरान सेल व्यवहार्यता और प्रसार सुनिश्चित करने के लिए उपयुक्त पर्यावरणीय स्थितियों को बनाए रखने में है। यह पूरा करने के लिए, इमेजिंग सेट अप एक पर्यावरण कक्ष है कि दोनों तापमान और सीओ 2 को नियंत्रित करता है शामिल होनाचाहिए. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को केवल तापमान विनियमन के साथ एक अल्पकालिक के लिए छवि हो सकती है अगर एक बंद कक्ष में ऐसा किया. दोनों ही मामलों में, अक्षीय फोकस उतार-चढ़ाव को कम करने के लिए एक एंटीकंपनटेबल और/या हार्डवेयर-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग (उदा., Nikon का Perfect Focus) प्रयोग की अवधि के दौरान प्लेट फोकस बनाए रखने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए। लाइव सेल इमेजिंग के साथ एक दूसरी महत्वपूर्ण चिंता photodamage और photobleaching के लिए क्षमता है. फोटोब्लीचिंग एक चिंता का विषय है जहां इमेजिंग की प्रगति के साथ फ्लोरोफ्लोरकी तीव्रता में फ्लोरोफोर की छवि धीरे-धीरे कम हो जाती है। हालांकि, उच्च तीव्रता उत्तेजना प्रकाश है कि photobleaching में परिणाम भी कोशिकाओं के लिए विषाक्त है और देखभाल जोखिम समय, छवि अधिग्रहण अंतराल, और इमेजिंग अनुक्रम की कुल अवधि को कम करके सेल जोखिम को कम करने के लिए किया जाना चाहिए करने के लिए जोखिम 25.phototoxicity को कम करने के लिए इमेजिंग स्थितियों को अनुकूलित नहीं करने के परिणाम डीएनए क्षति और अन्य सेलुलर परिवर्तन है कि बारी में समझौता व्याख्या और प्रयोग की समझ कर सकते हैं की पीढ़ी शामिल कर सकते हैं. सेल व्यवहार्यता लंबी अवधि इमेजिंग के साथ एक चिंता का विषय बन जाना चाहिए, पिक्सेल binning का उपयोग करने के लिए प्रयास किया जाना चाहिए (कम जोखिम सक्षम करने के लिए) और बाद में छवि कब्जा के बीच की अवधि में वृद्धि. एक अतिरिक्त चिंता का विषय यह है कि फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन के व्यवहार को बदल सकता है जिससे यह जुड़ा हुआ है, या यह कि जीनोम में वायरल अभिव्यक्ति के निर्माण का एकीकरण ही सेलुलर व्यवहार को प्रभावित कर सकता है। संभावना है कि एक फ्लोरोसेंट टैग के अलावा प्रोटीन समारोह को प्रभावित कर सकता है के लिए खाते में, एक एन या सी टर्मिनल फ्लोरोसेंट टैग के अलावा और गैर टैग प्रोटीन समारोह के साथ तुलना के बाद प्रोटीन समारोह का एक आकलन आवश्यक है. यह निर्धारित करने के लिए कि क्या सेल व्यवहार पर प्रतिकूल प्रभाव जीनोमिक टिड्डी के क्षोभ के कारण उत्पन्न होता है जिसमें वायरल निर्माण एकीकृत किया गया है, कई एकल सेल क्लोन प्राप्त किए जाने चाहिए, उन कोशिकाओं की तुलना में जो टैग किए गए प्रोटीन की कमी है, और निगरानी करने के लिए परीक्षण किया गया है कि सेलुलर फिटनेस और माइटोटिक प्रगति परेशान नहीं कर रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, वायरल अभिव्यक्ति निर्माण के यादृच्छिक एकीकरण के लक्ष्य प्रभाव से अंतर्जात टिड्डी में संलयन प्रोटीन के लक्षित एकीकरण के माध्यम से कम किया जा सकता है, या जीनोम के अन्य ज्ञात क्षेत्रों, CRISPR आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर.

Mitotic प्रगति के प्रमुख नियामकों की पहचान करने और उनकी विशेषता के दृष्टिकोण ने फिक्स्ड सेल इमेजिंग पर काफी भरोसा किया है। इस प्रकार पहचाने गए मिट्रोटिक विनियामकों का बाद में कैंसर कोशिकाओंकोतेजी से बढ़ने के लक्ष्य से लक्षित चिकित्सा विज्ञानों में शोषण किया गयाहै. हालांकि, antimitotic दवाओं हमेशा अलग कैंसर में समान रूप से प्रदर्शन नहीं करते हैं और कई मामलों में mitotic phenotypes कि या तो सफल या असफल chemothetic दृष्टिकोण से पहले में अंतर्दृष्टि स्पष्ट नहीं रह. धुरी-परेशान दवाओं की उपस्थिति और अनुपस्थिति में माइटोटिक कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए लाइव सेल समय-चूक इमेजिंग में उन न्यूनाधिकों की पहचान करने के लिए आवश्यक अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता है जो भयावह माइटस और समझौता की व्यवहार्यता में परिणाम होने की सबसे अधिक संभावना है सामान्य कोशिकाओं पर कम से कम प्रभाव के साथ कैंसर की कोशिकाओं.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

डीएलएम एक NSF GRFP द्वारा समर्थित है. ALM जैव चिकित्सा अनुसंधान में उत्कृष्टता के लिए स्मिथ परिवार पुरस्कार से धन द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin Gibo-Life sciences 25-510 A serine protease used to release adherent cells from culture dishes
15ml centrifuge tubes Olympus Plastics 28-101
20x CFI Plan Fluor objective  Nikon For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence
293T Cells ATCC CRL-3216 For use in retroviral transfection; used in step 1.1
a-tubulin-EGFP  Addgene various numbers Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors
Alisertib Selleckchem S1133 Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM.
Blasticidin Invitrogen A11139-03 Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells
C02 Airgas For use in cell culture and live cell imaging
Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) Chroma 49005 Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP
Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) Chroma 49002 Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin
disposable glass Pastuer pipets, sterilized  Fisher Scientific 13-678-6A For use in aspirating cells 
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibo-Life sciences 11965-084 Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibo-Life sciences 10438-026 Cell culture medium supplement
Lipofectamine 3000 and p3000 Invitrogen L3000-015 Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4
Multi well Tissue Culture dishes Corning various for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging
Nikon Ti-E microscope Nikon Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging
NIS Elements HC  Nikon Version 4.51 Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4
OPTI-MEM Gibo-Life sciences 31985-070 Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3
Penicillin/Streptomycin  Gibo-Life sciences 15140-122 antibiotic used in cell culture medium
phosphate bufferred saline (PBS) Caisson labs PBP06-10X1LT sterile saline solution for use with cell culture
pMD2.G Addgene 12259 Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4
Polybrene Sigma-Aldrich H9268 Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10
psPAX Addgene 12260 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4
Puromycin Invitrogen ant-pr-1 Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells
RFP- Histone 2B (H2B) Addgene various numbers Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors
RNAi Max Invitrogen 13778-150 Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs
RPE-1 cells ATCC CRL-4000 Human retinal pigment epithelial cell line
Tissue culture dish 100x20mm Corning  353003 for use in culturing adherent cells
Zyla sCMOS camera  Nikon Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells

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References

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Mercadante, D. L., Crowley, E. A., Manning, A. L. Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations. J. Vis. Exp. (151), e60255, doi:10.3791/60255 (2019).

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